低氧條件下SIRT3調控ROS介導的氧化應激反應對肺癌細胞凋亡的影響

黃 波,丁 潔,郭紅榮,王紅娟,徐建群,鄭 泉

肺癌是全球最常見的癌癥之一,發病率和病死率高[1]。低氧是腫瘤快速生長中過量氧消耗和血管供應不足所導致的重要腫瘤微環境特征[2]。低氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)的表達是低氧的標志,HIF-1α可通過調節腫瘤細胞的血管生成和細胞周期進程等促進腫瘤進展[3]。去乙?；?(sirtuin 3, SIRT3)被證實在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)組織中高表達,與NSCLC的發生發展相關[4]。有文獻[5]報道SIRT3可通過抑制線粒體活性氧(reactive oxygen species, ROS)的生成抑制HIF-1α和腫瘤生長,但在低氧條件下SIRT3是否可以通過調節ROS的生成從而影響肺癌細胞中的氧化應激和HIF-1α表達,目前尚未見報道。因此,該研究旨在探討低氧條件下SIRT3通過ROS對肺癌細胞中的氧化應激反應和HIF-1α表達的影響及其機制,為肺癌的靶向治療提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料人非小細胞肺癌A549細胞購于中國科學院上海細胞庫。ROS抑制劑N-乙酰半胱胺酸(n-acetylcysteine, NAC)(貨號:HY-B0215)購于美國MCE公司,F12K培養基(貨號:21127-022)購于美國Gibco公司,BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA細胞裂解液、MTT(貨號:PC0020、R0010、M1025)購于北京索萊寶科技有限公司,一抗SIRT3、HIF-1α、GAPDH和HRP標記的山羊抗兔IgG二抗(貨號:PAB35180、PAB37598、PAB36269、SAB43714)購于武漢貝茵萊生物科技有限公司,SYBR FAST qPCR Master Mix(貨號:KM4101)購于美國KAPA Biosystems公司,TRIzol(貨號:15596026)購于美國ambion公司,逆轉錄試劑盒(貨號:6210A)購于日本TAKARA公司,DMSO(貨號:D2650)購于美國SIGMA公司,AnnexinV-PE/7 AAD凋亡檢測試劑盒(貨號:559763)購于美國BD公司,ROS檢測試劑盒(含ROS熒光探針2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate, DCFH-DA)(貨號:S0033)購于上海碧云天生物技術有限公司,丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(super oxide dimutese, SOD)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)測定試劑盒(貨號:A003-1-2、A001-3-2、A006-2-1)購于南京建成生物工程研究所。311型CO2恒溫培養箱購自美國Thermo公司,AMR-100酶標儀購自杭州奧盛儀器有限公司,NovoCyte流式細胞儀購自美國ACEA公司,CFX-Connect 96熒光定量PCR儀、mini protean 3 cell電泳儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養及低氧細胞模型的構建 A549細胞用含10%胎牛血清的F12K培養基培置于37 ℃、5%CO2的培養箱中培養。細胞融合度達到80%以上時,胰酶消化細胞,按1 ∶2的比例傳代培養。取對數生長期的細胞接種至6孔板中,5×105個細胞/孔,每孔2 ml,置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h。將細胞暴露于低氧(5%～8%O2)條件下培養0、12、24、48 h,RT-PCR和Western blot檢測低氧條件下不同培養時間細胞中HIF-1α和SIRT3 mRNA和蛋白的表達,由此確定最佳低氧誘導時間。

1.2.2構建SIRT3過表達慢病毒載體和穩轉株 根據SIRT3的序列構建過表達慢病毒載體,轉染至肺癌細胞中,并篩選獲得穩轉株,以未轉染的細胞和轉染空載的細胞為對照,RT-PCR檢測細胞中SIRT3 mRNA的表達,驗證轉染效率,顯示慢病毒轉染和穩轉株構建成功。

1.2.3細胞分組及處理 將A549細胞分成5組:對照組、低氧組、低氧+ROS抑制劑NAC組、低氧+SIRT3過表達(SIRT3 overexpression, SIRT3-OE)組和低氧+SIRT3-OE+NAC組。對照組細胞正常培養;低氧組細胞暴露于低氧條件下培養24 h;低氧+NAC組先用20 mmol/L的NAC誘導24 h[6],再暴露于低氧條件下培養24 h;低氧+SIRT3-OE組將SIRT3過表達慢病毒細胞穩轉株在低氧條件下培養24 h;低氧+SIRT3-OE+NAC組將SIRT3過表達慢病毒細胞穩轉株用20 mmol/L的NAC誘導24 h,于低氧條件下培養24 h。處理完成后,取出細胞培養板,加入MTT溶液,培養4 h后吸去上清液,加入DMSO溶解液,搖床低速振蕩10 min,結晶物充分溶解后酶標儀檢測490 nm處的吸光度值,以檢測細胞增殖情況。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡 收集細胞,加入預冷的PBS洗滌,PBS重懸細胞,加入10 μl Annexin V-FITC和7 AAD,混勻,4 ℃避光孵育30 min,加入PBS,上流式細胞儀檢測。

1.2.5RT-PCR和Western blot法檢測細胞中HIF-1α和SIRT3 mRNA和蛋白的表達 收集細胞,TRIzol法提取細胞總RNA,逆轉錄合成cDNA,進行PCR擴增,引物序列表見表1。以GAPDH為內參,2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量。提取細胞總蛋白,BCA法進行蛋白質定量,上樣電泳,濕轉至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉,加入一抗稀釋液(1 ∶1 000)室溫孵育1 h,洗膜3次,加入二抗稀釋液(1 ∶20 000)室溫孵育1 h,洗膜3次,ECL顯影,TANON GIS軟件讀取條帶灰度值,目的蛋白與內參蛋白的比值即為目的蛋白的相對表達量。

表1 引物序列表

1.2.6流式細胞術檢測細胞中ROS含量 用無血清培養液稀釋DCFH-DA,使終濃度為10 μmol/L。收集1.2.3項各組細胞懸浮于稀釋好的DCFH-DA中,置于37 ℃、5%CO2的培養箱中孵育20 min,待DCFH-DA和細胞充分接觸后用無血清細胞培養液洗滌細胞,PBS重懸,上流式細胞儀檢測。

1.2.7生化試劑盒檢測細胞中MDA、SOD和GSH的含量 收集1.2.3項各組細胞上清液,嚴格按照試劑盒說明書步驟檢測MDA、SOD和GSH的含量。

2 結果

2.1 低氧暴露不同時間對A549細胞中HIF-1α和SIRT3 mRNA和蛋白表達的影響與0 h相比,低氧暴露12 h細胞中HIF-1α mRNA水平變化差異無統計學意義(t=-1.78,P>0.05),HIF-1α蛋白水平升高(t=-5.36,P<0.01),SIRT3 mRNA和蛋白水平均降低(tmRNA=-6.38,t蛋白=5.81, 均P<0.01);低氧暴露24 h和48 h細胞中HIF-1α mRNA和蛋白水平均升高(tmRNA(24 h)=-6.92,tmRNA(48 h)=-12.47,t蛋白(24 h)=-7.51,t蛋白(48 h)=-11.11, 均P<0.01),SIRT3 mRNA和蛋白水平均降低(tmRNA(24 h)=10.95,tmRNA(48 h)=13.76,t蛋白(24 h)=11.95,t蛋白(48 h)=17.63, 均P<0.01)。見圖1。因此最終確定最佳低氧誘導時間為24 h。

圖1 低氧暴露不同時間細胞中HIF-1α和SIRT3 mRNA和蛋白表達水平的比較

2.2 低氧條件下過表達SIRT3對A549細胞增殖的影響與對照組(0.90±0.02)相比,低氧組(1.26±0.02)細胞增殖能力升高(t=-16.28,P<0.01);與低氧組比較,低氧+NAC組(0.88±0.03)和低氧+SIRT3-OE組(0.97±0.01)細胞增殖能力均降低(t低氧+NAC組=16.92,t低氧+SIRT3-OE組=13.21, 均P<0.01);與低氧+NAC組相比,低氧+SIRT3-OE+NAC組(0.74±0.04)細胞增殖能力降低(t=6.46,P<0.01)。見圖2。

圖2 各組細胞增殖能力的比較

2.3 低氧條件下過表達SIRT3對A549細胞凋亡的影響與對照組(8.59%±0.51%)相比,低氧組(3.98%±0.33%)細胞凋亡率降低(t=3.45,P<0.05);與低氧組比較,低氧+NAC組(15.50%±1.04%)和低氧+SIRT3-OE組(16.55%±0.43%)細胞凋亡率均升高(t低氧+NAC組=-8.62,t低氧+SIRT3-OE組=-9.41, 均P<0.01);與低氧+NAC組相比,低氧+SIRT3-OE+NAC組(25.90%±3.43%)細胞凋亡率升高(t=-7.78,P<0.01)。見圖3。

圖3 各組細胞凋亡率的比較

2.4 低氧條件下過表達SIRT3對A549細胞中HIF-1α表達的影響與對照組相比,低氧組細胞中HIF-1α mRNA和蛋白表達水平升高(tmRNA=-14.32,t蛋白=-20.21, 均P<0.01),SIRT3 mRNA和蛋白表達水平降低(tmRNA=22.89,t蛋白=16.41, 均P<0.01);與低氧組相比,低氧+NAC組和低氧+SIRT3-OE組細胞中HIF-1α mRNA和蛋白表達水平降低(tmRNA(低氧+NAC組)=-7.21,tmRNA(低氧+SIRT3-OE組)=8.44,t蛋白(低氧+NAC組)=5.60,t蛋白(低氧+SIRT3-OE組)=9.00, 均P<0.01),SIRT3 mRNA和蛋白表達水平升高(tmRNA(低氧+NAC組)=-4.49,tmRNA(低氧+SIRT3-OE組)=-5.34,t蛋白(低氧+NAC組)=-6.21,t蛋白(低氧+SIRT3-OE組)=-9.08, 均P<0.01);與低氧+NAC組相比,低氧+SIRT3-OE+NAC組細胞中HIF-1α mRNA和蛋白表達水平降低(tmRNA=5.70,t蛋白=7.65, 均P<0.01),SIRT3 mRNA和蛋白表達水平升高(tmRNA=-8.20,t蛋白=-8.57, 均P<0.01)。見圖4。

圖4 各組細胞中HIF-1α和SIRT3的mRNA和蛋白表達水平的比較

2.5 低氧條件下過表達SIRT3對A549細胞中ROS含量的影響與對照組(5.80%±1.85%)相比,低氧組(47.43%±4.01%)細胞中ROS含量升高(t=-18.67,P<0.01);與低氧組相比,低氧+NAC組(35.77%±2.58%)和低氧+SIRT3-OE組(29.67%±1.57%)細胞中ROS含量均降低(t低氧+NAC組=5.23,t低氧+SIRT3-OE組=7.96, 均P<0.01);與低氧+NAC組相比,低氧+SIRT3-OE+NAC組(19.80%±2.95%)細胞中ROS含量降低(t=7.16,P<0.01)。見圖5。

圖5 各組細胞中ROS含量的比較

2.6 低氧條件下過表達SIRT3對A549細胞中MDA、SOD和GSH含量的影響與對照組相比,低氧組細胞中MDA含量升高(t=-18.44,P<0.01),SOD和GSH含量降低(tSOD=14.79,tGSH=20.94, 均P<0.01);與低氧組相比,低氧+NAC組和低氧+SIRT3-OE組細胞中MDA含量降低(t低氧+NAC組=7.62,t低氧+SIRT3-OE組=11.74, 均P<0.01),SOD(t低氧+NAC組=-6.44,t低氧+SIRT3-OE組=-8.65, 均P<0.01)和GSH含量升高(t低氧+NAC組=-7.19,t低氧+SIRT3-OE組=-12.76, 均P<0.01);與低氧+NAC組相比,低氧+SIRT3-OE+NAC組細胞中MDA含量降低(t=9.37,P<0.01),SOD和GSH含量升高(tSOD=-5.80,tGSH=-10.14, 均P<0.01)。見圖6。

圖6 各組細胞中MDA、SOD和GSH含量的比較

3 討論

研究[7]表明,SIRT3在NSCLC中具有抑癌作用。本研究結果顯示,低氧條件下過表達SIRT3能夠促進腫瘤細胞凋亡,并抑制腫瘤細胞增殖,提示SIRT3具有腫瘤抑制作用,與前人研究結果一致[7-8]。腫瘤微環境在維持NSCLC的發生和發展中具有重要作用。炎癥細胞浸潤、血管、可溶性因子和低氧狀態等構成了NSCLC中的腫瘤微環境,其中低氧是肺癌腫瘤最常見的微環境特征,能夠影響癌細胞的轉移和代謝[2]。腫瘤細胞對低氧的適應主要受HIF的調節,HIF可隨著細胞氧水平的降低而增加[9]。低氧時HIF-1α水平的升高,可以調節細胞代謝,誘導存活分子的產生、促進新生血管的形成,使腫瘤細胞在低氧條件下存活和轉移,從而促進腫瘤生長、侵襲和轉移[3]。研究[10]表明,HIF-1α的表達受SIRT3介導的去乙?；{控。本研究結果顯示,低氧條件下過表達SIRT3能夠抑制HIF-1α的表達,與前期研究[11]結果一致,提示低氧條件下SIRT3能夠通過抑制HIF-1α的表達來抑制腫瘤進展。

研究[12]發現,SIRT3在調節線粒體功能和ROS產生中也發揮重要作用。ROS是一種非常重要的生物活性物質,可通過誘導脂質過氧化或破壞細胞內蛋白質和核酸誘導細胞壞死或凋亡,被認為是治療癌癥的重要藥物[13]。在癌細胞中,ROS信號傳導在細胞的存活、轉錄、蛋白質翻譯以及腫瘤的形成和發展中起著重要作用。高水平的ROS有助于癌細胞增殖、DNA改變、凋亡、轉移和血管生成[14]。本研究結果顯示,低氧條件下過表達SIRT3能夠抑制ROS的增加,表明SIRT3對ROS具有抑制作用。此外還檢測了低氧條件下過表達SIRT3對A549細胞中氧化應激相關指標MDA、SOD和GSH的影響,其中MDA是脂質過氧化氫的最終產物,是ROS的指示物;SOD是一種將O2-催化還原為過氧化氫的酶;GSH可以催化過氧化氫和其他過氧化物的還原,具有抗氧化作用[15]。結果顯示,過表達SIRT3能夠降低MDA水平,升高SOD和GSH水平。為明確低氧條件下SIRT3調控ROS的機制,用ROS抑制劑NAC處理A549細胞,結果顯示,與NAC單獨處理相比,NAC聯合過表達SIRT3后細胞ROS水平降低,MDA水平降低,SOD和GSH水平升高,表明SIRT3能夠通過抑制ROS來抑制氧化應激反應,NAC聯合過表達SIRT3細胞中HIF-1α的表達降低,細胞凋亡率升高。