姜黃素可能通過上調Prdx6蛋白表達抑制軟骨細胞鐵死亡

陳 凡,周富麗,陳 勇,付萬進,周仁鵬,胡 偉,魯 超

骨關節炎(osteoarthritis,OA)是一種以軟骨損傷為主的常見關節疾病,其特征是關節軟骨細胞外基質(extracellular matrix, ECM)降解、關節軟骨退化和骨贅的形成[1-2]。鐵死亡是一種鐵離子依賴的,以脂質活性氧(reactive oxygen species, ROS)累積,線粒體皺縮為主要標志的新型程序性細胞死亡方式,許多抑制或緩解脂質過氧化的藥物均可抑制鐵死亡[3],從而能夠有效干預疾病的發展,因此成為當前研究的熱點。姜黃素(curcumin,Cur)具有抗氧化、抗菌以及與非甾體類抗炎藥物類似的抗炎活性,已經廣泛應用于OA的治療中[4]。Cur的抗氧化作用與多種信號通路有關[5],研究報道[6]Cur在調控過氧化物酶6(peroxiredoxin6,Prdx6)表達在抑制內質網應激和線粒體凋亡中發揮重要作用,但其在軟骨細胞鐵死亡中的作用及機制目前尚不清楚。Prdx6作為過氧化物還原酶家族的一員,是發揮抗氧化應激與維持細胞磷脂平衡的關鍵蛋白[7]。因此,本研究旨在探討Cur調控Prdx6蛋白表達在抑制軟骨細胞鐵死亡過程中的作用及可能的機制,為OA的防治提供新的靶點與策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株及實驗動物 C28/I2人正常軟骨細胞系,由ATCC公司提供;SD大鼠20只,雄性,體質量160～180 g,鼠齡6～8周,由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供,合格證號:SCXK(魯)20190003。于溫度(22±3)℃,濕度40%～70%條件下12 h光照12 h黑暗交替飼養。

1.1.2人膝關節軟骨組織樣本 2019年—2021年臨床收集正常人(5例)和OA患者(5例)置換下來的膝關節軟骨組織標本,排除因有膝關節感染性疾病、類風濕性關節炎等其他疾病進行膝關節置換的軟骨標本。本研究通過安徽理工大學生物醫學研究倫理委員會審核(倫理批號:2021020)。

1.1.3藥品和試劑 Cur(美國Sigma-Aldrich公司,貨號:08511);Erastin(美國Selleck生物科技有限公司,貨號:S7242);胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(美國Invitrogen生命技術有限公司,貨號:C0235);DMEM 高糖培養基(以色列BI生物科技公司,貨號:06-1055-57-1ACS);乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)檢測試劑盒(瑞士Hoffmann-La Roche有限責任公司,貨號:11644793001);噻唑藍(thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT)(上海碧云天生物技術有限公司,貨號:ST1537);BODIPY 581/591 C11熒光探針(美國Invitrogen生命技術有限公司,貨號:D3861);總谷胱甘肽(glutathione,GSH)檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司,貨號:S0052);抗SLC7A11抗體(英國abcam公司,貨號:ab307601);抗GPX4抗體(英國abcam公司,貨號:ab125066);抗Prdx6抗體(江蘇親科生物研究中心有限公司,貨號:DF6765);抗β-actin抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司,貨號:TA-09);抗ACSL4抗體(美國Santa Cruze公司,貨號:sc-365230);抗FTH抗體(美國Santa Cruze公司,貨號:sc-376594)。

1.1.4儀器 電泳儀(型號:EPS 600,上海天能電子有限公司);CO2培養箱(型號:371Steri-Cycle,美國Thermo Fisher科技公司);酶標儀(型號:800TS,美國ThermoFisher科技公司);流式細胞儀(型號:CytoFLEX,美國Thermo Fisher科技公司);倒置熒光顯微鏡(型號:AxioVert.A1,德國Carl Zeiss股份公司);超低溫冰箱(型號:DW-86L626,青島海爾股份有限公司);化學發光分析儀(型號:FINEDO X6,上海天能電子有限公司);離心機(型號:No. 5417R,德國Eppendorf股份公司)。

1.2 方法

1.2.1膝關節軟骨組織染色

1.2.1.1OA大鼠模型的建立及組織切片 20只SD大鼠隨機分為2組:正常大鼠組、OA大鼠模型組。采用左膝前交叉韌帶切除術+內側半月板摘除術建立左膝 OA 模型。取材后膝關節組織樣本經4%多聚甲醛固定,10%EDTA溶液脫鈣后進行組織浸蠟、包埋、切片。人膝關節軟骨組織切片同大鼠。

1.2.1.2Safranin O/Fast Green染色 大鼠膝關節切片脫蠟水化后,按常規方法進行Safranin O/Fast Green染色,倒置熒光顯微鏡拍照保存。

1.2.1.3HE染色 大鼠膝關節切片脫蠟水化后,按常規方法進行HE染色,倒置熒光顯微鏡拍照保存。

1.2.1.4免疫組織化學染色 大鼠和人軟骨組織切片脫蠟水化后孵育Prdx6和GPX4蛋白一抗(1 ∶50)過夜,37 ℃孵育二抗(1 ∶150) 30 min,DBA顯色3 min,蘇木精溶液復染2 min,脫水封片后顯微鏡下觀察。

1.2.2C28/I2軟骨細胞系培養和傳代 C28/I2軟骨細胞系用含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養基,在含有5% CO2,溫度為37 ℃的條件下培養,觀察細胞貼壁情況至達到對數增長期,用0.25%胰酶進行消化傳代分組,分為:Control組、Erastin組、Cur組、Erastin+Cur組。

1.2.3MTT法檢測細胞活力 按1.2.2項中分組情況,在96孔板中用2.5 μmol/L Erastin和不同濃度Cur(0、0.312、0.625、1.25、2.5、5、10、20和40 μmol/L)分別處理Erastin組、Cur組和Erastin+Cur組的C28/I2軟骨細胞系8 h,顯微鏡下觀察細胞死亡數量至50%時,每孔加入MTT檢測液,孵育4 h后加入二甲基亞砜溶解,酶標儀選定波長490 nm和570 nm,測定吸光度值計算細胞活力,確定最宜Cur加藥濃度為20 μmol/L。

1.2.4LDH法檢測細胞毒性 按1.2.2項中分組情況,在24孔板中用2.5 μmol/L Erastin和20 μmol/L Cur處理Erastin組、Cur組和Erastin+ Cur組C28/I2軟骨細胞系8 h,依據羅氏LDH試劑盒使用說明書,使用酶標儀測定波長在492 nm和620 nm處的吸光度,確定LDH的釋放值。

1.2.5流式細胞術檢測脂質ROS 按1.2.2項中分組情況,在6孔板中用2.5 μmol/L Erastin和20 μmol/L Cur處理Erastin組、Cur組和Erastin+Cur組C28/I2軟骨細胞系8 h。用2 μmol/L BODIPY 581/591C11探針染色30 min,胰酶消化并于1 500 r/min,4 ℃離心5 min收集細胞沉淀,通過流式細胞儀進行分析,數據用FlowJo軟件分析。

1.2.6總GSH試劑盒檢測GSH含量 按1.2.2項中分組情況,在6孔板中用2.5 μmol/L Erastin和20 μmol/L Cur處理Erastin組、Cur組和Erastin+Cur組C28/I2軟骨細胞系8 h。胰酶消化并1 500 r/min,4 ℃,離心5 min收集細胞沉淀,實驗按碧云天生物的試劑盒使用說明進行。

1.2.7Western blot檢測ACSL4、SLC7A11、Prdx6、FTH、GPX4蛋白表達 按1.2.2項中分組情況,在6孔板中用2.5 μmol/L Erastin和20 μmol/L Cur處理Erastin組、Cur組和Erastin+Cur組C28/I2軟骨細胞系8 h。用RIPA蛋白裂解液提取軟骨細胞總蛋白,根據不同的蛋白分子量在合適的SDS-PAGE凝膠中進行電泳(分離膠80 V 30 min,濃縮膠120 V 60 min)。再轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上用5%脫脂牛奶封閉,置于抗ACSL4(1 ∶500)、抗SLC7A11(1 ∶1 000)、抗FTH(1 ∶500)、抗GPX4(1 ∶500)、抗Prdx6(1 ∶1 000)一抗孵育過夜,用辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔/鼠IgG二抗(1 ∶500)孵育1h,配制ECL混合顯影液平鋪在膜表面,化學發光分析儀中顯影。使用ImageJ軟件對Western blot條帶進行量化。

1.2.8Cur分子與Prdx6蛋白的分子對接 利用分子對接技術Biovia Discovery Studio2016評價Cur分子與Prdx6蛋白的對接,并展示Cur分子與Prdx6蛋白相互作用的二維結構。

2 結果

2.1 OA大鼠關節軟骨病理染色和Western blot法檢測結果正常大鼠和OA大鼠Safranin O/Fast Green病理染色結果顯示,正常大鼠關節軟骨表面完整、平滑,軟骨細胞排列正常、數量正常、核染正常,軟骨基質著色鮮紅;OA大鼠模型關節面糜爛、缺損、變形,軟骨結構消失,軟骨層進行性喪失或者損壞,軟骨細胞數量減少、排列紊亂、有簇集現象,軟骨基質著色變淺。HE病理染色結果顯示正常大鼠膝關節軟骨表面光滑連續、無損傷,而OA大鼠模型關節軟骨的形態學出現明顯的改變,關節軟骨表面不連續,軟骨基質損傷、斷裂,軟骨組織被侵蝕,關節表面輪廓發生典型的病理改變(圖1A)。免疫組織化學染色觀察Prdx6和鐵死亡標志物GPX4蛋白在OA大鼠模型中的表達,結果顯示OA大鼠模型關節軟骨中Prdx6和GPX4蛋白黃染變淡(圖1B)。以上結果說明OA發病進程中存在鐵死亡。

2.2 Prdx6和鐵死亡標志物GPX4蛋白在OA患者關節軟骨中的表達情況Western blot檢測結果顯示與正常人相比,OA患者中Prdx6(t=3.38,P<0.01)和GPX4(t=3.66,P<0.01)蛋白表達明顯降低(圖2A、B)。免疫組織化學染色觀察Prdx6和鐵死亡標志物GPX4蛋白在OA患者中的表達,結果顯示OA患者關節軟骨中Prdx6和GPX4蛋白黃染變淡(圖2B)。以上結果進一步表明OA發病進程中存在鐵死亡,且Prdx6蛋白表達的降低可能與鐵死亡有關。

圖2 OA患者軟骨組織中Prdx6和GPX4的表達情況(n=5)

2.3 Cur對Erastin誘導的C28/I2軟骨細胞系鐵死亡細胞活力和細胞毒性的影響Erastin和不同濃度Cur處理C28/I2軟骨細胞系8 h,通過MTT法檢測細胞活力,結果顯示,與Erastin組比較,Cur能濃度依賴性抑制Erastin誘導的關節軟骨細胞活力的降低,提高細胞活力,且在Cur濃度為20 μmol/L時保護效果顯著(t=9.00,P<0.01)(圖3A)。LDH法檢測細胞毒性,結果顯示(圖3B)Erastin組關節軟骨細胞中LDH釋放增加(t=6.78,P<0.01),表明Erastin增加了關節軟骨細胞的毒性,而用20 μmol/L Cur處理后可以明顯降低軟骨細胞LDH的釋放(t=6.55,P<0.01),表明Cur可以降低Erastin所致的軟骨細胞毒性。

圖3 Cur對Erastin誘導的軟骨細胞鐵死亡細胞活力(n=6)和細胞毒性(n=4)的影響

2.4 Cur對Erastin誘導的C28/I2軟骨細胞系鐵死亡脂質ROS產生和GSH含量的影響流式細胞術量化比較FITC-A+脂質過氧化細胞最大百分比,結果顯示(圖4A、B)Erastin處理后軟骨細胞脂質ROS明顯增加(t=9.64,P<0.01),而Cur處理后能明顯降低脂質ROS的水平(t=4.76,P<0.01)。GSH結果顯示(圖4C)Erastin處理后軟骨細胞內GSH含量明顯降低(t=115.20,P<0.01),而Cur處理后軟骨細胞內GSH含量明顯提高(t=98.66,P<0.01)。

圖4 Cur對Erastin誘導的軟骨細胞脂質ROS水平和GSH含量的影響(n=3)

2.5 Cur對Erastin誘導的C28/I2軟骨細胞系Prdx6和鐵死亡相關蛋白表達的影響Western blot檢測結果顯示在Erastin誘導的軟骨細胞鐵死亡過程中,Cur處理可以降低軟骨細胞ACSL4(t=11.87,P<0.01)蛋白表達,上調SLC7A11(t=5.19,P<0.01)、Prdx6(t=3.77,P<0.05)、FTH(t=4.11,P<0.05)、GPX4(t=8.06,P<0.01)蛋白表達。說明Cur可能通過上調Prdx6蛋白表達抑制C28/I2軟骨細胞系鐵死亡。見圖5。

圖5 Cur對Erastin誘導的軟骨細胞鐵死亡Prdx6和鐵死亡蛋白表達的影響(n=3)

2.6 Cur分子與Prdx6蛋白的分子對接情況通過分子對接技術探究Cur分子與Prdx6蛋白的結合情況,結果顯示Cur分子可以與Prdx6蛋白結合,二者之間存在相互作用力:范德華力;Cur分子與Prdx6蛋白163位VAL纈氨酸殘基有Pi-Sigma鍵結合,與LYS144、LEU167、ALA171氨基酸殘基有Pi-Alkyl鍵結合。見圖6。

圖6 Cur分子與Prdx6蛋白分子對接圖

3 討論

OA因其病因和發病機制的復雜性,目前臨床上針對OA的預防和根治尚無有效的治療藥物和治療方法,因此OA發生發展的分子機制亟待深入探究。軟骨細胞作為關節軟骨中唯一的細胞類型,參與軟骨基質的合成[8]。生理情況下,軟骨細胞的分化與死亡及軟骨基質的合成和分解維持動態平衡。而在OA的發病進程中,這種平衡被打破,關節組織部位大量的炎癥、氧化應激等因素誘發軟骨細胞過度死亡,進而引起關節功能的喪失。OA發病進程中存在凋亡、自噬、壞死等類型的細胞死亡方式,然而靶向抑制這些類型的細胞死亡并不能有效抑制軟骨損傷,提示OA病程中可能存在其他類型的細胞死亡方式。因此,對軟骨細胞死亡方式及其調控機制的研究將有助于OA的防治。

本研究表明OA患者和OA大鼠發病進程存在鐵死亡,Prdx6蛋白表達的降低可能與鐵死亡有關。研究[9]報道Cur通過抑制NF - κB信號通路抑制軟骨細胞凋亡從而發揮軟骨保護作用,且Cur在一些癌細胞鐵死亡中也發揮作用,但其在軟骨細胞鐵死亡中的作用未見報道。臨床研究[10]表明OA患者血清中脂質ROS較正常人明顯增加,并伴有GSH水平的降低。本研究表明Cur處理減少了脂質ROS的產生,提高了軟骨細胞內GSH含量。鐵死亡的發生依賴于脂質ROS的累積及其介導的脂質過氧化反應[11],因此通過調控細胞內ROS的水平及其下游信號級聯效應,能夠干預細胞鐵死亡的發生。

此外,本研究結果顯示Cur處理后ACSL4蛋白表達降低,Prdx6、SLC7A11、FTH、GPX4蛋白表達增加。GPX4能夠利用GSH將過氧化的脂質還原為無毒性的脂醇,抑制ACSL4可減少多不飽和脂肪酸整合到磷脂上,且SLC7A11作為組成System xc-的兩個亞基之一,可以促進胱氨酸合成GSH[12]進而抑制軟骨細胞鐵死亡。Prdx6作為一種過氧化還原蛋白,它不僅結構獨特,而且具有谷胱甘肽過氧化物酶活性和鈣非依賴性磷脂酶活性,其活性調控受到亞細胞定位、底物結合及翻譯后修飾等因素影響。通過不同活性功能參與多種疾病的發生與發展,在腫瘤、炎性疾病及缺血性腦卒中等疾病中具有重要作用。研究[13]結果顯示在腫瘤細胞鐵死亡過程中,Prdx6能夠發揮清除脂質ROS的功能,是一個新的腫瘤細胞鐵死亡的負性調控因子。本研究結果顯示Cur和Prdx6之間存在較強的相互作用,結合Cur對軟骨細胞鐵死亡的抑制作用,表明Cur可能通過上調鐵死亡過程中Prdx6蛋白表達抑制軟骨細胞鐵死亡。

綜上所述,本研究表明Cur可能通過上調鐵死亡過程中Prdx6蛋白的表達,促進Prdx6清除脂質ROS,進而抑制Erastin誘導的軟骨細胞鐵死亡。后續還需以Prdx6為靶點探討其在Cur抑制軟骨細胞鐵死亡發生發展中的作用及其可能的分子機制,為OA的防治提供新思路。