丹黃散激活PINK 1/Parkin信號(hào)通路對(duì)高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響

范 燚,張春玲,趙 偉,陳 露,邸鐵濤,周世勇,魏良綱,張 艷,董源源

糖尿病潰瘍(diabetic ulcers,DUs)作為一種慢性、難愈性疾病,是糖尿病的常見(jiàn)并發(fā)癥之一。DUs的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,傳統(tǒng)治療方法傷口愈合緩慢、治療時(shí)間長(zhǎng)、治療成本高,給患者帶來(lái)痛苦[1]。尋找有效可行的干預(yù)靶標(biāo),成為相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。血管內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)期暴露與于高糖環(huán)境下,易出現(xiàn)炎癥損傷,從而導(dǎo)致血管病變[2]。線粒體自噬通過(guò)自噬方式靶向選擇性清除功能受損的線粒體,從而維持線粒體功能網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)平衡。研究[3]表明,線粒體自噬水平降低,且與其它機(jī)制的交互作用是DUs難愈合的關(guān)鍵原因之一。磷酸酯酶與張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)誘導(dǎo)假定激酶(PTEN induced putative kinase,PINK)1/帕金森病蛋白(Parkin)通路通過(guò)調(diào)控自噬可識(shí)別并清除受損的線粒體,是目前較公認(rèn)的自噬途徑,被廣泛用來(lái)評(píng)估自噬水平[4]。丹黃散是由丹參、大黃、當(dāng)歸、沒(méi)藥、沉香、松香幾味藥物組成的復(fù)方散劑,具有活血化瘀、祛腐生肌、利濕解毒之功效。前期研究[5]顯示,丹黃散具有促進(jìn)糖尿病大鼠潰瘍愈合的效果,可促進(jìn)創(chuàng)面肉芽組織生長(zhǎng),然而其作用機(jī)制尚未明確。該研究以PINK 1/Parkin通路介導(dǎo)的線粒體自噬為靶向,探究丹黃散對(duì)高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響,并探討其是否能通過(guò)Pink1/Parkin信號(hào)通路介導(dǎo)的線粒體自噬,維持創(chuàng)面細(xì)胞線粒體正常結(jié)構(gòu)與功能,促進(jìn)DUs創(chuàng)面愈合。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(貨號(hào):DFSC-EC-01)購(gòu)自上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥物 丹黃散為貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑(黔藥制字Z 03 100 240)。方中藥物大黃、丹參、當(dāng)歸、沉香、松香、沒(méi)藥均由院內(nèi)藥劑科按照2020年版《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行采購(gòu),按照比例混合經(jīng)30 B粉碎機(jī)物理粉碎后充分混勻,取得的中藥粉末以能過(guò)120目篩為宜,用60 Co-γ輻照滅菌處理,用無(wú)菌水調(diào)和。重組人表皮生長(zhǎng)因子凝膠(以下簡(jiǎn)稱生長(zhǎng)因子),國(guó)藥準(zhǔn)字S 20020123,購(gòu)自桂林華諾威基因藥業(yè)有限責(zé)任公司,規(guī)格為10 g/支。

1.1.3主要試劑和儀器 葡萄糖(貨號(hào):H 42021168)購(gòu)自湖北科倫藥業(yè)有限公司;山羊血清封閉液(貨號(hào):SL 038)購(gòu)自北京Solarbio公司;胎牛血清(貨號(hào):12483020)購(gòu)自美國(guó)Gibco-BRL公司;Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG(貨號(hào):ZF-0511)、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(貨號(hào):ZB-2301)、熒光封片劑(含DAPI)(貨號(hào):ZLI-9557)購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;Anti-PINK 1抗體(貨號(hào):DF 7742),Anti-LC 3-Ⅱ(貨號(hào):AF 4650),購(gòu)自美國(guó)Affinity公司;Anti-Parkin抗體(貨號(hào):66674-1-Ig)、Anti-Bcl2抗體(貨號(hào):68103-1-Ig)、anti-Beclin1抗體(貨號(hào):11306-1-Ap)、Anti-Bax抗體(貨號(hào):60267-1-Ig)、β-actin(貨號(hào):81115-1-RR)均購(gòu)自武漢三鷹公司;BCA 蛋白定量試劑盒(貨號(hào):33267)購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司;Transwell上小室(貨號(hào):3422)購(gòu)自美國(guó)康寧公司;結(jié)晶紫(貨號(hào):C196471)購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;30 B粉碎機(jī)(型號(hào):GMP30B)購(gòu)自常州市久川干燥設(shè)備有限公司;顯微鏡(型號(hào):BX53)、倒置熒光顯微鏡(型號(hào):IX51)均購(gòu)自日本OlymPus公司;移液槍購(gòu)自德國(guó)EPPendorf公司;免疫組化筆(型號(hào):ZLI-9305)購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(型號(hào):HF90)購(gòu)自上海力申科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞在37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),每2～3 d傳代1次,使用第3代細(xì)胞展開(kāi)實(shí)驗(yàn)。探索丹黃散對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞作用效果。將實(shí)驗(yàn)分組為:對(duì)照組、生長(zhǎng)因子組、丹黃散組、高糖組、高糖+生長(zhǎng)因子組、高糖+丹黃散組,每組3 例。對(duì)照組加入10%空白血清,在對(duì)照組基礎(chǔ)上,生長(zhǎng)因子組加入生長(zhǎng)因子,丹黃散組加入10%丹黃散,高糖組加入30 mmol/L葡萄糖,高糖+生長(zhǎng)因子組加入30 mmol/L葡萄糖和生長(zhǎng)因子,高糖+丹黃散組加入30 mmol/L葡萄糖和10%丹黃散。

1.2.2細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移率 將6 組細(xì)胞分別置于6孔板中,培養(yǎng)24 h,待細(xì)胞融合到90%后,用移液槍垂直于細(xì)胞培養(yǎng)盤底部緩慢劃痕;PBS清洗3次,在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),在倒置熒光顯微鏡下分別于0、48 h觀察并記錄劃痕距離,計(jì)算細(xì)胞轉(zhuǎn)移率。細(xì)胞轉(zhuǎn)移率=(0 h劃痕距離-48 h劃痕距離)/0 h劃痕距離×100%。

1.2.3Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲 取6 組細(xì)胞懸液接種到鋪有基質(zhì)膠的Transwell上室,放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h,4%多聚甲醛固定30 min,0.1%結(jié)晶紫染色10 min,PBS清洗3次,倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野,記錄侵襲細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞侵襲率=侵襲細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.4免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)抗凋亡蛋白Bcl-2、Beclin-1、促凋亡蛋白Bax的蛋白表達(dá)情況 取6 組細(xì)胞進(jìn)行爬片,PBS浸洗、室溫、封閉后,加入3% BSA稀釋的一抗Anti-Bcl-2(1 ∶100)、anti-Beclin1(1 ∶100)、Anti-Bax(1 ∶100),4 ℃濕盒內(nèi)孵育過(guò)夜,PBS浸洗3次,滴加稀釋好的熒光二抗(Alexa Fluor?488標(biāo)記山羊抗兔IgG,1 ∶100),37 ℃濕盒孵育1 h,PBS漂洗3 次,DAPI核染5 min,去離子水漂洗,封片,在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5Western blot技術(shù)檢測(cè)PINK 1、Parkin、LC 3-Ⅱ蛋白表達(dá)情況 取各組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,PBS清洗2次,加入細(xì)胞裂解液,離心后取上清液,BCA法測(cè)定總蛋白濃度,蛋白變性、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜,加入一抗Anti-PINK 1(1 ∶1 000)、Anti-Parkin(1 ∶1 000)、Anti-LC 3-Ⅱ(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶1 000),4 ℃孵育過(guò)夜,次日復(fù)溫,加二抗(辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG,1 ∶5 000),37 ℃孵育1 h,TBS洗膜3次,ECL暗室曝光顯影。以β-actin為內(nèi)參,采用ImageJ圖像分析軟件進(jìn)行灰度值分析。灰度值=目的條帶/β-actin。

2 結(jié)果

2.1 6組細(xì)胞轉(zhuǎn)移率、侵襲率的情況方差分析發(fā)現(xiàn),6組細(xì)胞的轉(zhuǎn)移率、侵襲率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=31.077、108.281;P<0. 001)。兩兩比較結(jié)果顯示,與對(duì)照組、生長(zhǎng)因子組相比,丹黃散組細(xì)胞轉(zhuǎn)移率、侵襲率降低(t=7.708、4.396、25.118、9.320;均P<0. 05);與高糖組、高糖+生長(zhǎng)因子組相比,高糖+丹黃散組細(xì)胞轉(zhuǎn)移率、侵襲率降低(t=9.120、3.828、11.678、8.374;均P<0. 05)。見(jiàn)表1、圖1。說(shuō)明丹黃散降低能夠降低高糖誘導(dǎo)細(xì)胞的細(xì)胞轉(zhuǎn)移率、侵襲率。

圖1 6組細(xì)胞增殖的劃痕距離和侵襲能力的比較

表1 6組細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移率、侵襲率的比較

2.2 6組細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2、Beclin-1、促凋亡蛋白Bax的蛋白表達(dá)情況方差分析顯示,6組細(xì)胞的Bcl-2、Beclin-1、Bax蛋白表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.564、19.956、40.108,均P<0. 05)。兩兩比較結(jié)果顯示,與對(duì)照組、生長(zhǎng)因子組相比,丹黃散組Bcl-2和Beclin-1的蛋白水平升高(t=-6.161、-6.095、-5.804、-3.885;P<0.05), Bax的蛋白水平降低(t=10.823、5.473;P<0.05)。與高糖處理后的高糖組、高糖+生長(zhǎng)因子組相比,高糖+丹黃散組細(xì)胞Bcl-2和Beclin-1的蛋白水平仍升高(t=-6.722、-3.330、-7.195、-3.921;P<0.05), Bax的蛋白水平仍降低(t=8.125、7.899;P<0.05)。見(jiàn)表2、圖2。說(shuō)明丹黃散可上調(diào)Bcl-2和Beclin-1的蛋白水平,下調(diào)Bax的蛋白水平。

圖2 6組細(xì)胞Bcl-2、Beclin-1、Bax蛋白表達(dá)的免疫熒光圖 ×200

表2 免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)6 組細(xì)胞Bcl-2、Beclin-1、Bax蛋白的表達(dá)水平

2.3 Western blot檢測(cè)6組細(xì)胞PINK 1、Parkin、LC 3-Ⅱ蛋白表達(dá)情況方差分析發(fā)現(xiàn),6組細(xì)胞的PINK 1、Parkin、LC 3-Ⅱ蛋白表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=128.504、101.518、66.948,均P<0. 001)。兩兩比較結(jié)果顯示,與對(duì)照組、生長(zhǎng)因子組相比,丹黃散組的PINK 1、Parkin、LC 3-Ⅱ蛋白表達(dá)明顯增高(t=-14.717、-9.682、-12.135、-11.502、-11.501、-5.765;均P<0.05);與高糖組、高糖+生長(zhǎng)因子組相比,高糖+丹黃散組細(xì)胞PINK 1、Parkin、LC 3-Ⅱ蛋白表達(dá)仍升高(t=-22.045、-6.197、-12.244、-7.521、-10.954、-6.245;均P<0. 05)。見(jiàn)表3、圖3。說(shuō)明丹黃散可明顯提升高糖處理細(xì)胞的PINK 1、Parkin、LC 3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平。

圖3 Western blot檢測(cè)6組細(xì)胞PINK 1、Parkin、LC 3-Ⅱ蛋白的表達(dá)水平

表3 Western blot檢測(cè)6 組細(xì)胞PINK 1、Parkin、LC 3-Ⅱ蛋白的表達(dá)水平

3 討論

DUs與周圍血管損傷密切相關(guān),研究[6]發(fā)現(xiàn),DUs的難愈性與肉芽組織的微血管再生能力降低以及血管生成不良導(dǎo)致的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)減少密切相關(guān),促進(jìn)創(chuàng)面局部血管生成能夠在一定程度上改善糖尿病潰瘍的愈合障礙。長(zhǎng)期高血糖水平和內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是造成周圍血管損傷和血管新生困難導(dǎo)致的DUs創(chuàng)面愈合困難的重要原因[7]。因此,在嚴(yán)格控制血糖的同時(shí)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行有效保護(hù)是預(yù)防和治療DUs的關(guān)鍵。研究[8]發(fā)現(xiàn),高糖會(huì)加重細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng),增加細(xì)胞遷移能力和局部侵襲能力。有效抑制高糖狀態(tài)下的細(xì)胞遷移對(duì)于阻止疾病進(jìn)展至關(guān)重要。

線粒體自噬對(duì)維護(hù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起著重要作用,是細(xì)胞內(nèi)一種適應(yīng)性保護(hù)機(jī)制,激活血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)線粒體自噬水平可降低細(xì)胞凋亡,促進(jìn)其分化、增殖和遷移[9]。磷酸酯酶與PTEN誘導(dǎo)PINK1/Parkin信號(hào)通路是調(diào)控線粒體自噬的重要途徑,Parkin是一種E3泛素連接酶,能夠調(diào)控蛋白降解及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),促進(jìn)自噬體吞噬線粒體,PINK 1具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性,作為線粒體膜電位變化感受器,在生理狀態(tài)下,PINK 1導(dǎo)入線粒體基質(zhì)被泛素蛋白酶體系統(tǒng)降解,并與Parkin相互作用抑制其向線粒體的轉(zhuǎn)運(yùn),維持自噬正常水平[10]。Xi et al[11]研究發(fā)現(xiàn),黃芩素可通過(guò)上調(diào) PINK 1/Parkin信號(hào)通路調(diào)節(jié)線粒體自噬,有效保護(hù)高糖損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞;上調(diào)糖尿病小鼠血管壁PINK 1和Parkin蛋白可誘導(dǎo)線粒體自噬,保護(hù)線粒體完整性,減緩血管內(nèi)皮損傷。由此可見(jiàn),PINK 1可以通過(guò)PINK 1/Parkin信號(hào)通路保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞。PINK 1充當(dāng)線粒體自噬的“監(jiān)測(cè)者”觸發(fā)線粒體自噬的起始信號(hào),Parkin作為線粒體自噬信號(hào)的“增強(qiáng)子”介導(dǎo)底物泛素化,與Beclin-1和微管相關(guān)蛋白輕鏈3-Ⅱ(LC 3-Ⅱ)結(jié)合后形成自噬小體,降解受損線粒體。細(xì)胞凋亡途徑主要依賴線粒體并受線粒體蛋白(Bcl-2家族蛋白)的調(diào)節(jié),細(xì)胞凋亡時(shí)會(huì)伴隨Bax結(jié)合線粒體復(fù)合物,抗凋亡蛋白Bcl-2可有效抑制線粒體上的促凋亡蛋白復(fù)合體形成[12]。

“祛腐生肌”是難愈性創(chuàng)面的主要治療方法之一,丹黃散秉承“祛腐生肌”理念,集祛腐與生肌作用于一體。研究[13]表明丹黃散能夠促進(jìn)糖尿病大鼠潰瘍創(chuàng)面毛細(xì)血管新生,加速傷口愈合。本研究發(fā)現(xiàn)丹黃散對(duì)高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮具有一定保護(hù)作用,可降低細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移,并激活PINK 1/Parkin信號(hào)通路,上調(diào)Beclin-1、LC 3-Ⅱ、Bcl-2蛋白表達(dá),下調(diào)Bax的表達(dá),提高線粒體自噬水平。本研究選擇的信號(hào)通路有大量的上游和下游調(diào)控因子,未來(lái)工作中可以進(jìn)行更深層次的研究。