穿心蓮內(nèi)酯調(diào)控鐵死亡中SLC7A11/GPX4軸減輕膿毒癥腸損傷

黃 銘,張藝馨,曹國(guó)棟,曾佑成,林 靚,王曉悅,程青虹,3

膿毒癥是機(jī)體對(duì)感染反應(yīng)失調(diào)導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙[1]。在膿毒癥發(fā)展過(guò)程中,腸道是容易受損的器官之一。鐵死亡是一種鐵依賴性、脂質(zhì)過(guò)氧化物累積誘發(fā)的細(xì)胞死亡方式,經(jīng)研究證明可通過(guò)抑制鐵死亡保護(hù)膿毒癥心臟功能[2],然而鐵死亡對(duì)于膿毒癥腸損傷的作用少有研究。穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide,AG)化學(xué)式為C20H30O5,具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤等作用[3]。而AG通過(guò)鐵死亡對(duì)腸損傷發(fā)揮的作用尚未可知。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)盲腸結(jié)扎穿刺(cecum ligation and puncture,CLP)術(shù)構(gòu)建膿毒癥模型,探討穿心蓮內(nèi)酯能否通過(guò)激活鐵死亡中溶質(zhì)載體家族7成員11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)/谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)軸減輕膿毒癥腸損傷。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑穿心蓮內(nèi)酯(貨號(hào):365645)及鐵死亡抑制劑(ferrostatin-1, Fer-1,貨號(hào):347174)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor α, TNF-α)、白介素6(interleukin 6, IL-6)試劑盒(貨號(hào):GMP-TL662、GMP-TL652)購(gòu)自上海語(yǔ)純生物科技公司;腸脂肪酸結(jié)合蛋白(intestinal fatty acid binding protein,I-FABP)、D-乳酸(貨號(hào):SEKM-0239、BC5350)購(gòu)自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司;丙二醛(malondialdehyde,MDA)測(cè)定試劑盒、還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)測(cè)定試劑盒(貨號(hào):A003-1-2、A006-2-1)購(gòu)自南京建成生物工程研究所;鐵離子比色法檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):E1042)購(gòu)自北京普利萊生物公司;BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):P0012S)購(gòu)自江蘇碧云天生物科技有限公司;兔抗溶質(zhì)載體家族7成員11(SLC7A11)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)、鐵重鏈蛋白1(ferritin heavy chain 1,FTH-1)(貨號(hào):T57046、T56969)購(gòu)自上海Abmart公司,FTH-1抗體(貨號(hào):ab183781)購(gòu)自上海Abcam公司,β-actin抗體、山羊抗鼠和山羊抗兔二抗(貨號(hào):GB110010、GB23301、GB23303)購(gòu)自武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器Z323K低溫離心機(jī)(德國(guó)HERMILE公司),Elx-800多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Bad公司),EG1150石蠟包埋機(jī)、RM2265輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(德國(guó)LEICA公司),CH20光學(xué)顯微鏡(日本olympus公司),Tanon-5200 Multi全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像儀(上海天能公司)。

1.3 方法

1.3.1動(dòng)物分組及模型制備 SPF級(jí)雄性SD大鼠80只,體質(zhì)量(200±25)g,購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,生產(chǎn)許可證編號(hào):SYXK(新)2011-010101,于SPF級(jí)動(dòng)物房由專人予以鼠飼料及水,室內(nèi)保持通風(fēng),相對(duì)溫度保持20～25 ℃,相對(duì)濕度保持50%～70%,自由進(jìn)食飲水。本實(shí)驗(yàn)已獲得石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào):A2022-173-01)。將40只SD雄性大鼠隨機(jī)分為5組,分別是假手術(shù)(sham)組、CLP組、AG低、中、高劑量組(5、10、20 mg/kg)[4-5],每組8只;以AG高劑量(AG20)組為最佳劑量組再將其余40只SD雄性大鼠分為sham組、CLP組、AG20組、鐵死亡抑制劑(Fer-1)組[6]、AG20+Fer-1組,每組8只。造模開始前1 h,給藥組予以AG(20 mg/kg)及Fer-1(10 mg/kg)腹腔注射處理,假手術(shù)組予以等體積生理鹽水注射。除假手術(shù)組外,其余各組均采用CLP建立膿毒癥模型[7],具體操作:術(shù)前12 h禁食不禁水,予以戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉,消毒后沿大鼠腹中線切開,找到盲腸拉出腹腔,盲腸根部1/4處結(jié)扎,穿刺盲腸末端2次,擠出少量腸內(nèi)容物,回納盲腸,逐層關(guān)腹。假手術(shù)組使用相同的操作,不進(jìn)行結(jié)扎及穿孔。術(shù)后2 h觀察呼吸頻率、心率、飲食、活動(dòng)變化等判斷膿毒癥模型是否建立成功。

1.3.2炎癥及腸黏膜通透性檢測(cè) 術(shù)后24 h取sham組、CLP組、AG低、中、高劑量組腹主動(dòng)脈血2 ml,離心,取上層血清,按照試劑盒檢測(cè)血清中炎癥水平(IL-6、TNF-α)及腸黏膜通透性水平(I-FABP、D-乳酸)。

1.3.3HE染色 取每組距回盲瓣5 cm處腸組織,4%多聚甲醛溶液中固定后切片、脫蠟、染色、封片,于顯微鏡下觀察腸組織損傷情況。依據(jù)Chiu′s分級(jí)進(jìn)行評(píng)分,Chiu′s分級(jí)[8]具體評(píng)分如下:小腸黏膜、絨毛正常(0分);在絨毛頂端中出現(xiàn)腸黏膜上皮下間隙擴(kuò)大,常伴有毛細(xì)血管充血,炎細(xì)胞浸潤(rùn)(1分);腸上皮下間隙顯著擴(kuò)張,絨毛頂端上皮抬高與固有層中度分離(2分);固有層大量分離,部分絨毛頂端脫落(3分);絨毛及固有層脫落,毛細(xì)血管擴(kuò)張(4分);固有層消化或破壞,伴出血或潰瘍(5分)。

1.3.4透射電鏡檢測(cè)腸組織病理變化 取sham組、CLP組、AG20組、Fer-1組、AG20+Fer-1組大鼠腸組織于電鏡固定液固定后經(jīng)過(guò)包埋、脫水、切片及染色后在透射電鏡下觀察腸組織病理變化。

1.3.5氧化應(yīng)激水平檢測(cè) 取sham組、CLP組、AG20組、Fer-1組、AG20+Fer-1組腸組織進(jìn)行反復(fù)研磨后取上清液,參照試劑盒說(shuō)明書對(duì)上清液進(jìn)行MDA、GSH含量測(cè)定。

1.3.6Fe3+檢測(cè) 取sham組、CLP組、AG20組、Fer-1組、AG20+Fer-1組腸組織進(jìn)行反復(fù)研磨后取上清液,參照試劑盒說(shuō)明書對(duì)上清液進(jìn)行Fe3+含量測(cè)定。

1.3.7Western blot 取sham組、CLP組、AG20組、Fer-1組、AG20+Fer-1組腸組織勻漿上清液蛋白,BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白變性后,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,并與SLC7A11、GPX4和β-actin一抗(1 ∶1 000) 4 ℃孵育過(guò)夜。第2天,洗膜3次,室溫孵育抗鼠或抗兔二抗(1 ∶10 000)1 h,洗膜3次后使用ECL化學(xué)發(fā)光液顯影。采用ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值,以β-actin為內(nèi)參,計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 AG對(duì)膿毒癥大鼠炎癥指標(biāo)及腸黏膜通透性的影響如圖1,與sham組相比,CLP組血清IL-6、TNF-α、IFBP、D-乳酸水平明顯升高(tIL-6=28.70,tTNF-α=37.75,tIFBP=24.06,tD-乳酸=25.28,均P<0.05);與CLP組相比AG 5、10、20 mg/kg組血清IL-6(t5 mg/kg=7.15,t10 mg/kg=11.64,t20 mg/kg=17.42,均P<0.05)、TNF-α(t5 mg/kg=9.09,t10 mg/kg=14.77,t20 mg/kg=21.05,均P<0.05)、IFBP(t5 mg/kg=4.10,t10 mg/kg=8.98,t20 mg/kg=15.89,均P<0.05)、D-乳酸(t5 mg/kg=4.86,t10 mg/kg=10.31,t20 mg/kg=15.43,均P<0.05)水平均逐步降低,呈濃度依賴性(趨勢(shì)性檢驗(yàn)P<0.05)。提示AG可降低炎癥及腸黏膜通透性,且高濃度組效果最佳。

圖1 AG對(duì)膿毒癥大鼠IL-6、TNF-α、IFABP、D-乳酸的影響

2.2 AG對(duì)膿毒癥大鼠腸組織形態(tài)學(xué)變化的影響如圖2所示,sham組腸黏膜絨毛排列整齊,無(wú)明顯病理學(xué)改變;與sham組相比,CLP組絨毛可見斷裂及脫落,毛細(xì)血管擴(kuò)張及炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯,固有層明顯破壞,Chiu’s評(píng)分降低(t=34.80,P<0.05);與CLP組相比,AG組腸絨毛脫落逐步好轉(zhuǎn),毛細(xì)血管擴(kuò)張及炎細(xì)胞浸潤(rùn)逐步改善,固有層增生和破壞減輕, AG20組改善最為明顯(tAG 5 kg/mg=4.85,tAG 10 kg/mg=8.39,tAG 20 kg/mg=13.53,均P<0.05)。

圖2 各組大鼠腸組織形態(tài)變化及Chiu′s評(píng)分 HE ×100

2.3 AG對(duì)膿毒癥大鼠腸組織絨毛及線粒體變化的影響以AG20組為最佳劑量組進(jìn)行研究,如圖3A所示,在光鏡下AG20組和Fer-1組較CLP組相比腸絨毛排列稍整齊,毛細(xì)血管擴(kuò)張減輕,固有層增生及破壞明顯好轉(zhuǎn),Chiu’s評(píng)分明顯降低(tAG20=11.87,tFer-1=9.33,P<0.05);與AG20組、Fer-1組分別相比,AG20+Fer-1組腸絨毛頂端破壞少,未見明顯固有層的增生及破壞,Chiu’s評(píng)分降低(t=9.23,t=11.7,P<0.05)。如圖3B所示,在電鏡下可見sham組腸上皮絨毛結(jié)構(gòu)清晰完整,排列整齊,線粒體無(wú)明顯改變;CLP組絨毛排列不齊,可見斷裂、缺失,線粒體數(shù)量減少,空泡樣改變嚴(yán)重;AG20組及Fer-1組絨毛排列稍齊,斷裂及缺失減少,線粒體空泡稍有改善;而 AG20+Fer-1組腸組織結(jié)構(gòu)破損改善更為明顯。

圖3 各組大鼠腸組織光鏡和透射電鏡下形態(tài)變化圖及Chiu′s評(píng)分

2.4 AG對(duì)膿毒癥大鼠腸組織氧化應(yīng)激水平的影響以AG20組為最佳劑量組進(jìn)行研究,如圖4所示,與sham組相比,CLP組腸組織中MDA含量明顯升高(t=24.57,P<0.05),GSH含量明顯降低(t=31.49,P<0.05);與CLP組相比,AG20組及Fer-1組腸組織中MDA含量明顯降低(tAG20=9.55,tFer-1=13.21,P<0.05),GSH含量明顯升高(tAG20=11.83,tFer-1=13.70,P<0.05);與AG20組、Fer-1組分別相比,AG20+Fer-1組腸組織氧化應(yīng)激水平下降更為明顯(MDA:t=9.87,t=6.21;GSH:t=6.34,t=4.47,均P<0.05)。

圖4 不同濃度AG對(duì)膿毒癥大鼠腸黏膜氧化應(yīng)激水平的影響

2.5 AG對(duì)膿毒癥大鼠腸組織Fe3+含量的影響以AG20組為最佳劑量組進(jìn)行研究,如圖5所示,與sham組(4.95±0.78)相比,CLP組腸組織中Fe3+含量(38.86±2.79)明顯升高(t=23.81,P<0.05);與CLP組相比,AG20組及Fer-1組腸組織中Fe3+含量(27.53±2.26、23.86±1.51)明顯降低(t=7.95,t=10.53,P<0.05);與AG20組、Fer-1組分別相比,AG20+Fer-1組腸組織中Fe3+含量(13.02±2.13)降低更明顯(t=10.19,t=7.61,P<0.05)。

圖5 不同濃度AG對(duì)膿毒癥大鼠腸黏膜Fe3+含量的影響

2.6 AG對(duì)膿毒癥大鼠腸組織SLC7A11、GPX4、FTH-1蛋白表達(dá)水平的影響以AG20組為最佳劑量組進(jìn)行研究,如圖6所示,與sham組相比,CLP組腸組織中SLC7A11、GPX4、FTH-1蛋白含量明顯降低(tSLC7A11=18.86,tGPX4=38.57,tFTH-1=26.65,P<0.05);與CLP組相比,AG20組(tSLC7A11=3.88,tGPX4=22.89,tFTH-1=4.48)及Fer-1組(tSLC7A11=3.47,tGPX4=24.90,tFTH-1=4.72)腸組織中SLC7A11、GPX4、FTH-1蛋白含量均明顯升高;與AG20組、Fer-1組分別相比,AG20+Fer-1組腸組織中SLC7A11、GPX4、FTH-1蛋白含量升高更明顯(SLC7A11:t=3.87,t=4.28;GPX4:t=8.21,t=6.19;FTH-1:t=6.10,t=6.34;均P<0.05)。

圖6 各組大鼠腸組織SLC7A11、GPX4、FTH-1蛋白表達(dá)水平

3 討論

膿毒癥是由免疫紊亂、器官功能失調(diào)、炎癥風(fēng)暴等原因誘發(fā)多器官功能障礙,肺臟、腎臟、肝臟等器官均可產(chǎn)生病變,從而危及生命[9]。隨著研究不斷深入,膿毒癥并發(fā)腸損傷也受到越來(lái)越多的關(guān)注。腸道微生態(tài)失衡、線粒體功能障礙、異常腸道細(xì)胞死亡等機(jī)制均可誘發(fā)膿毒癥腸損傷的發(fā)生[10]。本研究中膿毒癥組大鼠腸黏膜結(jié)構(gòu)破壞,病理學(xué)損傷明顯,發(fā)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng),腸黏膜通透性明顯增加,提示膿毒癥發(fā)生時(shí)伴有腸道損傷。具有抗氧化、抗炎、抗病毒等廣泛藥理活性的AG對(duì)膿毒癥腸損傷的影響報(bào)道尚少,本研究對(duì)于同樣實(shí)施了CLP術(shù)但經(jīng)過(guò)AG給藥后,可見腸黏膜病理?yè)p傷逐步改善,炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激均有所降低,且劑量越高,作用越明顯,均揭示AG對(duì)膿毒癥腸道起保護(hù)作用,但AG對(duì)于膿毒癥腸損傷的保護(hù)作用是通過(guò)何種方式起效的,尚無(wú)人進(jìn)行探究。

鐵死亡為近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的新型細(xì)胞死亡方式,被證實(shí)參與膿毒癥心臟[11]器官損傷。當(dāng)鐵死亡加重時(shí),細(xì)胞內(nèi)鐵累積引起毒性脂質(zhì)過(guò)氧化物ROS的升高,氧化應(yīng)激水平增高,鐵重鏈蛋白(FTH-1)表達(dá)減少。本研究中膿毒癥組加入分別加入Fer-1及AG后,Fe3+含量降低,FTH-1蛋白表達(dá)提高,抗氧化作用增強(qiáng),且AG和Fer-1共同作用時(shí)上述效果更明顯,直接證明了鐵死亡不僅參與更是促進(jìn)了膿毒癥腸損傷的發(fā)生,而AG可通過(guò)減輕鐵死亡發(fā)揮保護(hù)作用。

SLC7A11是System Xc-系統(tǒng)發(fā)揮功能的主要亞基,此亞基主要作用是將胞外胱氨酸及胞內(nèi)谷氨酸以1 ∶1比例交換,使胞內(nèi)有充足的半胱氨酸來(lái)合成GSH,GSH可與GPX4協(xié)同將胞內(nèi)脂質(zhì)氧化物轉(zhuǎn)化為無(wú)毒的脂質(zhì)醇,以減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)氧化物的累積,從而抑制鐵死亡的發(fā)生發(fā)展,減輕組織損傷[12-13]。本研究CLP組中SLC7A11、GPX4表達(dá)均受到抑制,腸組織損傷嚴(yán)重,加入AG及Fer-1后SLC7A11、GPX4蛋白表達(dá)增加,腸組織損傷得到修復(fù)。AG和Fer-1聯(lián)用時(shí),鐵死亡進(jìn)一步受到抑制,出現(xiàn)了更強(qiáng)大的抗炎癥、抗氧化功能,修復(fù)腸組織損傷作用,這可能與AG激活鐵死亡中SLC7A11/GPX4軸改善膿毒癥腸損傷有關(guān)。

綜上所述,穿心蓮內(nèi)酯可能通過(guò)調(diào)節(jié)SLC7A11/GPX4軸來(lái)抑制鐵死亡的發(fā)生,從而改善膿毒癥大鼠腸損傷。但關(guān)于穿心蓮內(nèi)酯是否可以通過(guò)SLC7A11/GPX4軸的上游及下游調(diào)控靶點(diǎn)控制鐵死亡誘導(dǎo)膿毒癥腸損傷的發(fā)生尚有待深究,未來(lái)將在后面的研究中進(jìn)一步探索。