RAB10對(duì)胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及臨床意義

匡 鵬,張欽泉,程 盛,董 毅,王理承,張思璐,葉家欣,馬丹丹,李中虎 ,張智勇,

胰腺癌是一種惡性程度極高的消化系統(tǒng)腫瘤,5年生存率約為10%[1],據(jù)美國腫瘤研究機(jī)構(gòu)[2]估計(jì),截止2022年,約49 830例患者死于胰腺癌,在所有惡性腫瘤中占比8.2%。作為預(yù)后極差的消化道惡性腫瘤,胰腺癌臨床診治困難,手術(shù)干預(yù)效果不佳[3]。近些年來一些新型的治療方法,如免疫抑制、分子靶向、聯(lián)合放化療均效果不佳[4-5],早期手術(shù)切除仍是目前唯一有效的治療方法[1]。因此,尋找與胰腺癌有關(guān)的基因,基因檢測(cè)手段的使用對(duì)胰腺癌的早期診斷、改善其生存和預(yù)后顯得尤為重要。RAB10基因位于人染色體 2p23.3[6],國內(nèi)外研究[7-10]表明RAB10在膠質(zhì)瘤、骨肉瘤、宮頸癌、肝癌等多種惡性腫瘤的發(fā)展中表現(xiàn)出癌基因特征。RAB10在胰腺癌組織中的表達(dá)水平可能影響胰腺癌細(xì)胞的生物學(xué)功能。該研究旨在探討RAB10在胰腺癌組織中的表達(dá)情況,并研究沉默、過表達(dá)RAB10對(duì)胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響以及RAB10的表達(dá)水平對(duì)胰腺癌患者臨床相關(guān)預(yù)后的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器RAB10、GAPDH單克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自美國Abcam公司(貨號(hào):ab237703、ab245357、ab263962)。L15購自上海iCell公司(貨號(hào):iCell-0009)。FBS購自美國Gibco公司(貨號(hào):10091-148)。EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司(貨號(hào):C0071S)。凋亡檢測(cè)試劑盒購自北京Solarbio公司(貨號(hào):CA1020)。Transwell小室購自美國Corning公司(貨號(hào):3422)。Matrigel膠購自美國BD公司(貨號(hào):356234)。BCA 蛋白定量試劑盒購自江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司(貨號(hào):CW0014S)。ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購自蘇州UElandy公司(貨號(hào):S6009M).熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司(型號(hào):CX-1)。流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特生命科學(xué)公司(型號(hào):CytoFLEX S)。CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司(型號(hào):Forma 3111)。人胰腺癌SW1990細(xì)胞株購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 方法

1.2.1生物信息學(xué)分析 ①GEPIA數(shù)據(jù)庫分析RAB10在胰腺癌及正常胰腺組織中的基因表達(dá)差異:在GEPIA數(shù)據(jù)庫中條件設(shè)置為:“gene:RAB10”、“cancer type:PAAD”,“Match TCGA normal and GTEx data”可獲得RAB10在正常胰腺組織與胰腺癌組織中的表達(dá)差異。② 不同RAB10mRNA表達(dá)水平胰腺癌患者的相關(guān)臨床數(shù)據(jù)收集與分析:下載癌基因數(shù)據(jù)庫TCGA中RAB10在胰腺癌中的基因表達(dá)量和臨床相關(guān)性數(shù)據(jù),將RAB10mRNA表達(dá)量的中位數(shù)定為分界線,把胰腺癌患者分為RAB10低表達(dá)組和RAB10高表達(dá)組,并對(duì)臨床相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2細(xì)胞的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與檢測(cè) ① 細(xì)胞的培養(yǎng):將SW1990細(xì)胞系培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(其中含10%的FBS),放置在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,至細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合度;② 細(xì)胞轉(zhuǎn)染:將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)板,待接種細(xì)胞貼壁后,將過表達(dá)RAB10質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SW1990細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組(RAB10-OE),將空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW1990細(xì)胞作為其對(duì)照組(pcDNA3.1);針對(duì)RAB10序列合成3條小干擾RNA(siRNA)分別轉(zhuǎn)染SW1990細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組(RAB10-siRNA-1、2、3),將隨機(jī)陰性對(duì)照序列siRNA作為其對(duì)照組(NC-siRNA)。③ 細(xì)胞的檢測(cè):使用Q-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默效果及過表達(dá)效果,挑選干擾效果最好的siRNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。使用BCA、ECL試劑盒按說明書進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn),檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。

1.2.3EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 在24孔板中鋪板,接種轉(zhuǎn)染后的四組細(xì)胞并配制20 μmol/L EdU工作液,將上述EdU工作液預(yù)熱至37 ℃,濃度稀釋至10 μmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞,將EdU工作液加入細(xì)胞中,待EdU標(biāo)記完成后加入固定液固定15 min,去除固定液,使用PBS洗滌細(xì)胞后加入通透液繼續(xù)培養(yǎng)15 min,去除通透液,每孔加入0.5 ml Clik反應(yīng)液,避光培養(yǎng)30 min后洗滌細(xì)胞,每孔加入10 μmol/L Hoechst 33342溶液1 ml,培養(yǎng)10 min后洗滌,完成核染色。在熒光顯微鏡下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行拍照和處理數(shù)據(jù),該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 調(diào)整轉(zhuǎn)染后四組細(xì)胞的濃度為5×105～1×106個(gè)/ml。吸取上述1 ml細(xì)胞,4 ℃、1 000 r/min離心機(jī)離心10 min后去除上清液。加入預(yù)冷PBS液1 ml,輕搖試管使細(xì)胞懸浮,4 ℃、1 000 r/min離心機(jī)離心10 min,去除上清液,若存在貼壁細(xì)胞,則先用胰酶消化,再加入PBS洗滌處理。將細(xì)胞重懸于200 μl Binding Buffer緩沖液中,向上述液中加入10 μl PI 與10 μl Annexin V-FITC,輕晃混勻液體,避光在室溫下反應(yīng)15 min后再加入300 μl Binding Buffer緩沖液。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè),該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。使用FlowJo 10處理數(shù)據(jù)作圖。

1.2.5Transwell實(shí)驗(yàn) Transwell小室放置于24孔板中。將無血清的L15與Matrigel膠按8 ∶1稀釋至60 μl,置入培養(yǎng)箱中5 h后,待上室膠凝固并吸除殘余液體,再加入100 μl的無血清L15培養(yǎng)基,放入培養(yǎng)箱中水化20 min。胰酶消化轉(zhuǎn)染后的四組細(xì)胞,把無血清L15重懸制備成細(xì)胞懸液,使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。取上述1×104個(gè)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞接種至上室,含有10%FBS的L15培養(yǎng)基接種于下室。放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待24 h后吸干孔板里面的培養(yǎng)基,再使用4%的多聚甲醛固定20 min、結(jié)晶紫染色25 min,最后使用PBS清洗3次,在顯微鏡下拍照。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6劃痕實(shí)驗(yàn) 接種約5×105個(gè)轉(zhuǎn)染后的四組細(xì)胞至6孔板;24 h貼壁后用使用移液器槍頭對(duì)著直尺進(jìn)行劃線,使用PBS沖洗細(xì)胞3次,除去劃下的細(xì)胞,加入L15培養(yǎng)基、FBS血清,置入37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于培養(yǎng)的0 、24、48 h時(shí)顯微鏡下拍照。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌組織及正常胰腺組織中的RAB10mRNA表達(dá)情況GEPIA數(shù)據(jù)庫共包含171個(gè)正常胰腺組織樣本及179個(gè)胰腺癌組樣本。結(jié)果顯示胰腺癌組織中RAB10mRNA的表達(dá)量明顯高于正常胰腺組織(P<0.05)。見圖1。

圖1 RAB10在胰腺癌組織和正常胰腺組織中的表達(dá)比較

2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果驗(yàn)證Q-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2A、B所示,在SW1990細(xì)胞中,RAB10mRNA表達(dá)在siRNA-1組與siRNA-2組中明顯降低(tsiRNA-1=13.494,tsiRNA-2=19.939,均P<0.001;tsiRNA-3=0.78,P=0.48),且siRNA-2組沉默效果更好,故后續(xù)實(shí)驗(yàn)均選用siRNA-2組;RAB10-OE組RAB10mRNA表達(dá)明顯高于pcDNA3.1組(t=23.08,P<0.01);Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2C所示,與NC-siRNA組比較,RAB10-siRNA1、2、3組蛋白表達(dá)量均減少,其中RAB10-siRNA-2減少最明顯;與pcDNA3.1組比較,RAB10-OE組蛋白表達(dá)量增加。表示均轉(zhuǎn)染成功。

圖2 RAB10 mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)

2.3RAB10對(duì)細(xì)胞增殖的影響如圖3所示,與NC-siRNA組相比,RAB10-siRNA-2組SW1990細(xì)胞的增殖能力明顯降低(t=32.03 ,P<0.000 1);與pcDNA3.1組相比, RAB10-OE組SW1990細(xì)胞的增殖能力明顯升高(t=8.02,P=0.001 3)。表明沉默RAB10能夠抑制SW1990細(xì)胞的增殖,過表達(dá)RAB10能夠促進(jìn)SW1990細(xì)胞的增殖。

圖3 各組細(xì)胞的細(xì)胞增殖率

2.4RAB10對(duì)細(xì)胞凋亡的影響如圖4所示,與NC-siRNA組相比, RAB10-siRNA-2組SW1990細(xì)胞的凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增加(t=35.73,P<0.01);與pcDNA3.1組相比,RAB10-OE組SW1990細(xì)胞的凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少(t=21.39,P<0.001)。表明沉默RAB10能夠增強(qiáng)SW1990細(xì)胞的凋亡,過表達(dá)RAB10能夠抑制SW1990細(xì)胞的凋亡。

圖4 各組細(xì)胞凋亡情況

2.5RAB10對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響如圖5所示,與 NC-siRNA 組相比, RAB10-siRNA-2組SW1990細(xì)胞的侵襲能力明顯降低(t=11.01,P=0.000 4);與pcDNA3.1組相比, RAB10-OE組SW1990細(xì)胞的侵襲能力明顯增強(qiáng)(t=7.18,P=0.002)。表明沉默RAB10能夠抑制SW1990細(xì)胞的侵襲能力,過表達(dá)RAB10能夠增強(qiáng)SW1990細(xì)胞的侵襲能力。

圖5 各組細(xì)胞侵襲能力

2.6RAB10對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6、表1所示,與NC-siRNA組相比,RAB10-siRNA-2組SW1990細(xì)胞的遷移能力明顯減弱(48 h:t=33.94,P<0.001);與pcDNA3.1組相比, RAB10-OE組SW1990細(xì)胞的遷移能力明顯增強(qiáng)(48 h:t=61.46,P<0.001)。表明沉默RAB10抑制SW1990細(xì)胞的遷移能力,過表達(dá)RAB10增強(qiáng)SW1990細(xì)胞的遷移能力。

表1 劃痕實(shí)驗(yàn)未遷移率(n=3)

圖6 各組細(xì)胞遷移能力 ×40

2.7RAB10mRNA表達(dá)水平與胰腺癌患者預(yù)后的關(guān)系根據(jù)癌癥基因數(shù)據(jù)庫TCGA中下載的RAB10臨床相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,將RAB10mRNA表達(dá)量的中位數(shù)定為分界線,把胰腺癌患者分為RAB10低表達(dá)組和RAB10高表達(dá)組。利用Kaplan-Meier法繪制胰腺癌患者生存曲線圖。結(jié)果如圖7所示,RAB10低表達(dá)組生存時(shí)間明顯高于RAB10高表達(dá)組(1 059 dvs485 d,χ2=14.420,P<0.001)。Log-rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示RAB10低表達(dá)組生存時(shí)間明顯高于RAB10高表達(dá)組(P<0.001)。

圖7 RAB10高、低表達(dá)組生存時(shí)間與生存率的關(guān)系

2.8Cox單因素、多因素回歸分析結(jié)果下載TCGA

數(shù)據(jù)庫中胰腺癌臨床數(shù)據(jù),將胰腺癌患者臨床病理特征進(jìn)行Cox回歸分析。結(jié)果顯示,臨床分級(jí)、T分期、M分期及RAB10mRNA表達(dá)水平與胰腺癌患者生存時(shí)間明顯相關(guān)(均P<0.05)。將具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的單因素Cox回歸分析影響因素納入多因素Cox回歸分析,結(jié)果顯示,RAB10mRNA的表達(dá)水平為影響胰腺癌患者生存時(shí)間的唯一獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表2。

表2 Cox回歸分析RAB10mRNA表達(dá)水平與胰腺癌患者生存時(shí)間的關(guān)系

3 討論

惡性腫瘤具有細(xì)胞分化和增殖異常、生長失去控制、浸潤性和轉(zhuǎn)移性等生物學(xué)特征,其發(fā)生是一個(gè)多因子、多步驟的復(fù)雜過程。人體中幾乎所有的細(xì)胞都可能由于突變而發(fā)生改變,從而發(fā)展成癌癥,其中基因突變是重要的影響因素。同時(shí)惡性腫瘤的發(fā)生是癌細(xì)胞不受人體調(diào)節(jié)機(jī)制控制,逐漸侵襲正常組織的漸進(jìn)過程。上述過程往往受到原癌基因以及抑癌基因的調(diào)控。

RAB10是一種蛋白質(zhì)編碼基因,其編碼的GTP結(jié)合蛋白R(shí)AB10屬于RAS超家族的小GTP酶。RBA10主要分布于胞吐、胞吞區(qū)室,介入調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸,是細(xì)胞內(nèi)膜運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,參與從運(yùn)輸囊泡的形成到與膜的融合。RAB10在Rabs活性GTP結(jié)合形式與非活性GDP結(jié)合形式之間循環(huán),能夠?qū)⒅苯迂?fù)責(zé)囊泡形成,運(yùn)動(dòng),拴系和融合的不同下游效應(yīng)子集招募到膜中[11]并參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡[12],影響細(xì)胞增殖和腫瘤進(jìn)展。這種調(diào)控因子的作用使得RAB10具有潛在的研究價(jià)值。

本研究通過生信分析顯示RAB10mRNA的表達(dá)水平與胰腺癌患者的生存時(shí)間相關(guān),RAB10高表達(dá)患者的生存時(shí)間明顯降低,在單因素Cox回歸分析中顯示RAB10mRNA表達(dá)水平與胰腺癌患者臨床分級(jí)、T分期、M分期相關(guān),多因素Cox回歸分析顯示出RAB10mRNA表達(dá)水平是胰腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Wang et al研究[9]表明RAB10低表達(dá)的肝癌患者生存時(shí)間明顯高于高表達(dá)患者, Cox回歸分析顯示RAB10高表達(dá)是肝癌患者根治術(shù)后總生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Dai et al研究[7]表明RAB10在骨肉瘤細(xì)胞中高表達(dá)也與患者生存率降低有關(guān), Cox分析顯示RAB10的高表達(dá)與骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移以及 TNM 分期呈正相關(guān)。國內(nèi)外文獻(xiàn)與本研究顯示RAB10的表達(dá)水平與腫瘤患者的生存期相關(guān)。

本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示RAB10可以促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移,并誘導(dǎo)其凋亡。Jiang et al研究[13]表明,在骨肉瘤細(xì)胞中沉默RAB10能夠明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長和遷移。Dai et al[7]發(fā)現(xiàn)RAB10在骨肉瘤細(xì)胞在骨肉瘤組織中的蛋白表達(dá)遠(yuǎn)高于非腫瘤性骨組織。Zhang et al[10]發(fā)現(xiàn)RAB10在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)增殖和侵襲能力。本研究的結(jié)果顯示,RAB10在胰腺癌中高表達(dá),并且能夠促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增值、侵襲和遷移能力。因此,RAB10可能與癌細(xì)胞的惡性功能相關(guān)。

總之,本研究使用癌癥基因數(shù)據(jù)庫及細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)說明了RAB10可能具有促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞惡性功能行為的作用。未來將繼續(xù)收集胰腺癌患者臨床相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,并在公共數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)中驗(yàn)證,進(jìn)一步研究RAB10在胰腺癌細(xì)胞中可能的調(diào)控通路。