牙齦卟啉單胞菌感染及維生素D通路蛋白表達(dá)對(duì)食管鱗癌患者生存預(yù)后的影響

錢夢(mèng)凡,孔金玉,劉怡文,孫 蔚,周福有,高社干

食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)發(fā)病機(jī)制尚未明確,病死率極高[1]。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,Pg)感染已被證實(shí)為ESCC患者預(yù)后不良的主要高危因素[2]。資料顯示,維生素D(vitamin D,VitD)是人體必需的脂溶性維生素,不僅可促進(jìn)生長和骨骼鈣化,還可降低病原微生物載量,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,發(fā)揮抑癌作用[3-4]。其中,VitD 24-羥化酶(vitamin D 24-hydroxylase,CYP24A1)、VitD 1α-羥化酶(vitamin D 1α-hydroxylase,CYP27B1)及VitD受體(vitamin D receptor,VDR)為VitD代謝通路中的關(guān)鍵調(diào)控因子,三者活性的改變參與腫瘤發(fā)生發(fā)展[5],且CYP24A1和VDR的基因多態(tài)性與ESCC顯著相關(guān)[6]。基于VitD代謝受阻與ESCC的發(fā)病密切相關(guān)[6]及病原微生物可通過干擾VitD代謝促進(jìn)腫瘤惡性發(fā)展[7],推測Pg感染及VitD代謝通路關(guān)鍵調(diào)控因子表達(dá)改變可能與ESCC患者預(yù)后密切相關(guān)。

該研究旨在通過檢測ESCC患者組織中Pg感染情況及CYP24A1、CYP27B1與VDR表達(dá)情況,分析各指標(biāo)對(duì)患者生存預(yù)后的影響,以期為ESCC患者臨床防治策略的制定提供可靠指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑與儀器 Pg抗體(意大利Diatheva公司,貨號(hào):ANT0085),CYP24A1(武漢Proteintech公司,貨號(hào):25174-1-AP)、CYP27B1及VDR抗體(英國Abcam公司,貨號(hào):ab206655、ab3508);二步法免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):PV-9000);檸檬酸鈉抗原修復(fù)液、DAB顯色試劑盒及PBS(北京Solarbio公司,貨號(hào):C1032、DA1010、P1010);蘇木精(南京建成生物工程研究所,貨號(hào):I030-1-1);中性樹膠(上海Sangon Biotech公司,貨號(hào):E675007-0100)。組織切片掃描儀(匈牙利3DHIESTECH公司,型號(hào):Pannoramic MIDI),光學(xué)顯微鏡(日本 Nikon公司,型號(hào):ECLIPSE Ni-E)。

1.1.2病例資料 選擇安陽市腫瘤醫(yī)院2015年1月—2017年1月行ESCC根治術(shù)的185例ESCC患者為研究對(duì)象。收集手術(shù)切除的ESCC組織石蠟包埋樣本進(jìn)行常規(guī)切片,切片厚度為3 μm,用于后續(xù)指標(biāo)檢測。本研究于術(shù)前獲得患者知情同意,并且通過安陽市腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(倫理批號(hào):2023WZ16K01)。入組標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)見圖1,最終納入173例ESCC患者。患者隨訪期為60個(gè)月,生存時(shí)間為確診時(shí)間至死亡或確診后60個(gè)月。

圖1 本研究ESCC患者入組標(biāo)準(zhǔn)

1.2 方法IHC染色根據(jù)IHC試劑盒及DAB顯色試劑盒說明書步驟進(jìn)行IHC染色。采用Pg、CYP24A1、CYP27B1與VDR抗體按說明書推薦濃度進(jìn)行抗體孵育。結(jié)果判讀:① 染色強(qiáng)度評(píng)分:無著色、淺黃色、棕黃色及棕褐色分別為0、1、2、3分;② 陽性細(xì)胞百分比評(píng)分:≤5%、>5%且≤25%、>25%且≤50%、>50%且≤75%及>75%分別為0、1、2、3、4分。①與②乘積為最終IHC評(píng)分。于400倍光學(xué)顯微鏡下判讀各指標(biāo)染色結(jié)果,隨機(jī)拍攝5個(gè)視野并計(jì)算IHC評(píng)分的平均值。本研究中,各指標(biāo)判定標(biāo)準(zhǔn)為:<2分為陰性,≥2分為陽性[2,8-9]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理運(yùn)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用χ2檢驗(yàn)分析Pg感染情況及CYP24A1、CYP27B1與VDR表達(dá)情況之間相關(guān)性以及各指標(biāo)與患者臨床病理特征之間相關(guān)性。用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線并用Log-rank檢驗(yàn)生存曲線之間的差異。單因素Cox回歸計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比例(hazard ratios,HR)及其95%置信區(qū)間。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ESCC組織中Pg、CYP24A1、CYP27B1與VDR的表達(dá)情況采用IHC檢測173例ESCC組織中Pg感染情況及CYP24A1、CYP27B1與VDR表達(dá)情況。結(jié)果如圖2所示,ESCC細(xì)胞胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒代表上述各指標(biāo)陽性,Pg、CYP24A1、CYP27B1和VDR的陽性率分別為43.35%、37.57%、20.23%及21.97%。Pg感染與CYP24A1、CYP27B1及VDR相關(guān)(均P<0.05)。見表1。

表1 ESCC組織中各指標(biāo)之間的關(guān)系[n(%)]

圖2 ESCC組織中Pg、CYP24A1、CYP27B1

2.2 Pg、CYP24A1、CYP27B1和VDR與ESCC患者臨床病理特征之間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)分析各指標(biāo)與ESCC患者臨床病理特征之間的關(guān)系。結(jié)果如表2所示,在男性、有吸煙史、有飲酒史、腫瘤分化程度為低分化、浸潤深度侵及纖維膜、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期為Ⅲ/Ⅳ期的患者中,Pg感染率及CYP24A1陽性率更高(均P<0.01)。在腫瘤浸潤深度未侵及纖維膜、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期為Ⅰ/Ⅱ期的患者中,CYP27B1及VDR陽性率更高(均P<0.01)。

表2 Pg、CYP24A1、CYP27B1及VDR與ESCC患者臨床病理特征之間的關(guān)系[n(%)]

2.3 Pg、CYP24A1、CYP27B1和VDR對(duì)ESCC患者生存預(yù)后的影響生存分析結(jié)果顯示,Pg及CYP24A1陽性組患者生存率低于陰性組患者(均P<0.05),CYP27B1及VDR陰性組患者生存率低于陽性組患者(均P<0.05)。將IHC結(jié)果里4張連續(xù)切片同時(shí)滿足Pg感染與CYP24A1表達(dá)陽性、CYP27B1與VDR表達(dá)陰性的患者歸為Pg+CYP24A1+CYP27B1-VDR-高風(fēng)險(xiǎn)組(共62例),不滿足上述條件的歸為低風(fēng)險(xiǎn)組(共111例)。結(jié)果顯示:高風(fēng)險(xiǎn)組患者生存率低于低風(fēng)險(xiǎn)組患者(均P<0.05)。此外,Pg+CYP24A1+CYP27B1-VDR-高風(fēng)險(xiǎn)組患者預(yù)后最差,死亡風(fēng)險(xiǎn)最高(HR=4.59, 95%CI: 3.04～6.71)。見圖3、表3。

圖3 各組ESCC患者術(shù)后5年生存曲線

2.4 Pg+CYP24A1+CYP27B1-VDR-高低風(fēng)險(xiǎn)組對(duì)不同ESCC人群生存預(yù)后的影響以患者性別、年齡、吸煙史、飲酒史及TNM分期為分層變量,分析不同ESCC人群中Pg+CYP24A1+CYP27B1-VDR-高低風(fēng)險(xiǎn)組患者生存時(shí)間之間差異,結(jié)果如圖4、表4所示,在各分層標(biāo)準(zhǔn)的ESCC人群中,高風(fēng)險(xiǎn)組患者死亡風(fēng)險(xiǎn)均較高,預(yù)后均較差(均P<0.05);尤其是在TNM分期為Ⅰ/Ⅱ期的ESCC人群中,與低風(fēng)險(xiǎn)組相比,高風(fēng)險(xiǎn)組患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)增加更為明顯(HR=19.83, 95%CI: 5.70～68.98,P<0.05)。

表4 各臨床病理特征高風(fēng)險(xiǎn)組與低風(fēng)險(xiǎn)組ESCC患者的生存曲線比較

圖4 各組ESCC患者術(shù)后5年生存曲線

3 討論

VitD為免疫調(diào)節(jié)劑,在機(jī)體的抗感染免疫中發(fā)揮重要作用。VitD不僅可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生防御素和抗菌肽,增強(qiáng)其抗菌活性,還可與免疫細(xì)胞上的VDR結(jié)合,刺激免疫細(xì)胞增殖分化,調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫,參與清除病原微生物、減輕組織損傷[10]。VitD能降低乙肝病毒及幽門螺桿菌等病原微生物載量,抑制肝癌及胃癌的惡性演進(jìn)[3-4],還能抑制病原微生物毒力因子(如黏附素、蛋白酶等)活性,削弱其致病力[11]。乙肝病毒可通過下調(diào)VDR表達(dá),阻止活性VitD發(fā)揮作用,降低機(jī)體免疫防御功能,協(xié)助自身大量復(fù)制,促進(jìn)肝癌細(xì)胞的惡性增殖[7]。

VitD代謝通路中關(guān)鍵調(diào)控因子表達(dá)量改變可促進(jìn)多種腫瘤惡性演進(jìn)[12]。CYP24A1是活性VitD的滅活酶,可滅活1,25-二羥基維生素D3,抑制其發(fā)揮功能,在多種腫瘤中的表達(dá)量顯著高于癌旁正常組織,已被證實(shí)為潛在的促癌基因[8,12-14]。CYP27B1是VitD合成的關(guān)鍵限速酶,其表達(dá)與肺、前列腺、結(jié)腸以及甲狀旁腺腫瘤的進(jìn)展呈負(fù)相關(guān),且在多種惡性腫瘤中均可發(fā)揮抗癌作用[14]。VDR是VitD發(fā)揮功能的主要受體,VitD代謝通路主要依靠二者結(jié)合作用于靶細(xì)胞發(fā)揮效應(yīng)。在消化系統(tǒng)腫瘤中,VDR表達(dá)量降低與發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高有關(guān)[12]。Yang et al[6]發(fā)現(xiàn)血漿中的VitD水平與ESCC顯著相關(guān),且VDR和CYP24A1的基因多態(tài)性與ESCC易感性相關(guān)。Bao et al[15]發(fā)現(xiàn)VDR高表達(dá)的ESCC患者生存期顯著高于VDR低表達(dá)患者,且體外細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn)VDR是ESCC的抑制因子,上調(diào)VDR基因表達(dá)可抑制ESCC細(xì)胞增殖。上述研究與本研究結(jié)果一致。但目前ESCC研究中,尚無Pg感染及VitD通路基因之間相關(guān)性的報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn),ESCC組織中Pg、CYP24A1、CYP27B1及VDR的陽性率分別為43.35%、37.57%、20.23%及21.97%。其中,Pg感染與CYP24A1、CYP27B1及VDR相關(guān),表明Pg感染的ESCC細(xì)胞中CYP24A1活性增強(qiáng),而CYP27B1及VDR活性降低。Pg感染陽性和CYP24A1表達(dá)陽性組的患者中,男性、有吸煙史及飲酒史的患者比例增加,提示可能由于大多數(shù)男性患者長期吸煙、飲酒,口腔環(huán)境差,造成Pg及CYP24A1陽性率均增高。兩個(gè)指標(biāo)陽性組患者中,腫瘤分化程度為低分化的患者比例增加,提示惡性程度更高的ESCC微環(huán)境更適合Pg定植,定植部位CYP24A1多為高表達(dá)。Pg+24A1+27B1-VDR-高風(fēng)險(xiǎn)組,腫瘤浸潤深度侵及纖維膜、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期為Ⅲ/Ⅳ期的患者比例增加。表明Pg感染、VitD代謝通路中CYP24A1陽性率增高及CYP27B1與VDR陽性率降低可加速ESCC惡性進(jìn)程。

本研究生存分析結(jié)果顯示,Pg感染與CYP24A1表達(dá)陽性組、CYP27B1與VDR表達(dá)陰性組患者生存期均縮短,表明Pg感染及VitD代謝通路相關(guān)蛋白表達(dá)改變與ESCC患者預(yù)后不良密切相關(guān);Pg+CYP24A1+CYP27B1-VDR-高風(fēng)險(xiǎn)組患者,死亡風(fēng)險(xiǎn)更高,表明同時(shí)滿足上述指標(biāo)改變的患者生存預(yù)后更差。此外,本研究發(fā)現(xiàn)在各分層標(biāo)準(zhǔn)的ESCC人群中,高風(fēng)險(xiǎn)組患者死亡風(fēng)險(xiǎn)均較高,預(yù)后均較差,表明Pg+CYP24A1+CYP27B1-VDR-可作為ESCC患者預(yù)后預(yù)測的可靠指標(biāo)。