阿司匹林誘發GSDME依賴性細胞焦亡對結腸癌細胞增殖的影響

司馬學琴,蘇延停,李成武

結腸癌是臨床常見的惡性腫瘤之一,國外的一項流行病學研究[1]結果顯示,其發病率為所有惡性腫瘤的前三位,且近年來發病率與病死率呈上升趨勢,但目前對于結腸癌的發病機制仍不清楚。近期研究[2]顯示其發生機制可能與結腸腫瘤組織中腫瘤干細胞的無限增殖和異常分化能力有關。由于腫瘤分子生物學近些年的快速發展,分子靶向治療成為臨床腫瘤治療研究的熱點,已經有越來越多的靶向治療藥物應用于臨床[3]。阿司匹林對結腸腫瘤的預防作用已被逐漸證實,但其具體作用機制尚未闡明[4]。細胞焦亡是一種依賴于白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)轉化半胱氨酸蛋白酶-1(cysteinyl aspartate and specific proteinase 1,Caspase-1)、多種炎癥因子為誘因的細胞死亡形式[5],研究[6]表明辛伐他汀通過觸發焦孔素E(Gasdermin E,GSDME)介導的細胞焦亡引起胃癌細胞死亡,但目前尚無關于阿司匹林能否通過誘發GSDME依賴性細胞焦亡從而影響結腸癌細胞增殖的研究。因此本研究通過分子生物學技術分析阿司匹林對結腸癌細胞增殖的影響及這一過程與GSDME依賴性細胞焦亡的相關性,為結腸癌的分子靶向治療提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑阿司匹林(貨號:A2093)購自美國sigma公司,人結腸癌Caco-2細胞購自上海中科院細胞庫;MTT分析試劑盒(貨號:ab211091)購自Abcam(上海)貿易有限公司;乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)釋放檢測試劑盒(貨號:C0016)購自上海碧云天生物技術有限公司;IL-1β、白介素-18(interleukin-18,IL-18)酶聯免疫吸附試驗檢測試劑盒(貨號:EK101BHS、EK118)購自北京中杉金橋公司;一抗NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)(貨號:bs-41293R)、Caspase-1(貨號:bs-20616R)及山羊抗兔IgG二抗(貨號:bs-40295G)購自北京博奧森生物技術有限公司;一抗GSDME-N(貨號:ab215191)購自Abcam(上海)貿易有限公司;內參β-actin抗體(貨號:bb-2101)購自上海貝博生物科技有限公司;GSDME siRNA購自北京華泰億康生物科技有限公司;胎牛血清(貨號:12483020)及DMEM培養基(貨號:11965092)購自美國Gibco公司,蛋白免疫印跡試驗(Western blot)相關試劑和胰蛋白酶-EDTA混合液(貨號:C0201)購自上海碧云天生物技術有限公司;LipofectaminTM2000(貨號:11668030)轉染試劑購自美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 主要儀器恒溫培養箱(型號:HHCP-160S)購自沃爾福(上海)實業有限公司;倒置顯微鏡(型號:CKX41)購自日本OLYMPUS公司;高速離心機購自上海醫用分析儀器廠(型號:TGI-16);實時熒光定量PCR儀(型號:CFX Connect)、電泳儀(型號:1658033)與轉膜儀(型號:Trans-Blot Turbo)購自美國伯樂公司;全自動凝膠成像分析系統(型號:GeneGenius)購自美國SYGENE公司。

1.3 方法

1.3.1細胞培養 在培養皿中用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養Caco-2細胞,置于CO2含量為5%的37 ℃恒溫培養箱中培養,飽和濕度。傳代條件:培養2～3 d,細胞密度>80%。用胰蛋白酶-EDTA混合液消化傳代后培養。細胞處于對數生長期時進行實驗。

1.3.2MTT法檢測細胞增殖活性 取對數生長期的細胞,以每孔約5×103個細胞的密度接種到96孔細胞培養板上進行培養,待細胞貼壁后,倒去原培養基,分別加含有不同濃度的阿司匹林(1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 mmol/L)的培養基繼續培養,同時加入等量原培養基作為空白對照組,每組設3個復孔,繼續培養48 h后取出細胞培養板,每孔中避光加入20 μl的MTT粉劑溶液,置于培養箱中培養4 h后取出,用PBS溶液輕輕洗滌,加入20 μl的DMSO溶液,使用酶標儀在570 nm波長下測量吸光度值,生長抑制率=(1-實驗組吸光度值/對照組吸光度值)×100%。根據實驗結果,選擇細胞生長抑制率達平臺期的濃度用作后續實驗。

1.3.3轉染 當15 mmol/L阿司匹林處理好的Caco-2細胞培養密度達到50%后進行siRNA沉默GSDME(siRNA-GSDME)操作,按LipofectamineTM2000轉染試劑說明書進行轉染,轉染后繼續培養細胞48 h后進行實驗。

1.3.4顯微鏡下觀察細胞形態 取處于對數生長期的細胞,接種到6孔板中,并立即放在培養箱中,待細胞貼壁后,用15 mmol/L阿司匹林處理后繼續培養48 h,后期沉默GSDME基因,在顯微鏡下觀察各組細胞形態。

1.3.5LDH釋放實驗 收集15 mmol/L阿司匹林處理好的細胞和對照組細胞,1 000 r/min離心5 min,吸取各孔中的上清液,按步驟依照試劑盒說明書測定LDH釋放量。

1.3.6Western blot檢測蛋白表達水平 收集15 mmol/L阿司匹林處理好的細胞和對照組細胞,加入RIPA 裂解液,置于冰上裂解30 min,在高速離心機4 ℃條件下以12 000 r/min離心10 min,吸取上清液提取總蛋白,用BCA法測定各組細胞蛋白濃度,各組加入緩沖液后放入100 ℃沸水中水煮變性后備用。按每孔30 μg蛋白上樣,凝膠電泳并濕轉法轉膜到PVDF膜上,5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,分別加入NLRP3(1 ∶1 000)、Caspase-1(1 ∶1 000)、GSDME-N(1 ∶1 000)及β-actin(1 ∶500)抗體,4 ℃孵育10 h,加入山羊抗兔二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h后,用TBST溶液洗膜3次,涂上發光顯影液用顯影儀拍照,用ImageJ軟件分析相應灰度值。

1.3.7ELISA法檢測細胞上清液中IL-1β和IL-18的含量 將收集到的處理后的Caco-2細胞懸液以1 000 r/min離心5 min后,收集15 mmol/L阿司匹林細胞和對照組細胞上清液,依照ELISA試劑盒說明書按步驟測定IL-1β和IL-18的含量。

2 結果

2.1 不同濃度阿司匹林對Caco-2細胞增殖活性的影響給予不同濃度的阿司匹林分別處理Caco-2細胞48 h,采用MTT法檢測增殖抑制率,結果顯示:48 h不同濃度組細胞增殖抑制率分別為(5.80±0.68)、(11.22±0.93)、(21.14±1.26)、(35.52±1.54)、(50.34±0.69)、(50.66±1.83)。與1.0 mmol/L組相比,2.5 mmol/L組細胞增殖抑制率增加(t=7.627,P<0.05);與2.5 mmol/L組相比,5.0 mmol/L組細胞增殖抑制率增加(t=7.310,P<0.05);與5.0 mmol/L組相比,10.0 mmol/L組細胞增殖抑制率增加(t=9.975,P<0.01);與10.0 mmol/L組相比,15.0 mmol/L組細胞增殖抑制率增加(t=10.215,P<0.01),提示阿司匹林表現出一定劑量依賴性抑制Caco-2細胞的增殖。當濃度超過15.0 mmol/L后其濃度效應達到平臺期,與15.0 mmol/L組相比,20.0 mmol/L組對細胞增殖抑制無差異(t=1.061,P>0.05)。見圖1。

圖1 不同濃度阿司匹林對Caco-2細胞增殖抑制作用的比較

2.2 阿司匹林對Caco-2細胞焦亡的影響用濃度為15 mmol/L的阿司匹林的培養基培育Caco-2細胞48 h,在顯微鏡下觀察細胞的形態變化,并應用LDH 釋放檢測試劑盒檢測細胞上清液中LDH含量。結果如圖2A所示,與對照組相比,阿司匹林組細胞數目減少,并且能夠明顯觀察到細胞膜出現腫脹甚至破裂現象和細胞膜內容物流出等典型的細胞焦亡形態學特征。如圖2B所示, 應用阿司匹林后細胞上清中LDH 的含量增加(t=6.738,P<0.05)。

圖2 阿司匹林對Caco-2細胞形態和細胞上清中LDH含量的影響

2.3 阿司匹林對Caco-2細胞中焦亡相關因子表達的影響Western blot結果顯示如圖3所示,與對照組相比,阿司匹林組能明顯提升Caco-2細胞中焦亡相關基因NLRP3、Caspase-1、GSDME-N蛋白表達水平(tNLRP3=6.479,tCaspase-1=6.293,tGSDME-N=5.704,均P<0.05)。

圖3 阿司匹林對Caco-2細胞焦亡相關蛋白表達的影響與對照組比較:*P<0.05

圖4 阿司匹林對Caco-2細胞上清中IL-1β、IL-18含量的影響與對照組比較:**P<0.01

2.4 阿司匹林對Caco-2細胞上清中IL-1β與IL-18的影響ELISA結果如圖5所示,與對照組相比,阿司匹林能夠明顯提升Caco-2細胞中焦亡相關因子IL-1β與IL-18的水平(tIL-1β=11.357,tIL-18=12.953,均P<0.01)。

圖5 沉默GSDME對Caco-2細胞焦亡的影響

2.5 沉默GSDME對Caco-2細胞焦亡的影響使用siRNA-GSDME沉默Caco-2細胞(阿司匹林處理濃度為15 mmol/L)中的GSDME,Western blot結果顯示, GSDME的關鍵剪切片段GSDME-N處于低表達狀態,提示GSDME沉默成功(圖5A);沉默組較15 mmol/L阿司匹林組細胞增加,細胞膜較為完整,細胞破裂少見,細胞上清中LDH 的含量明顯降低(t=6.258,P<0.05)。見圖5B、C。

2.6 沉默GSDME后對Caco-2細胞上清中IL-1β與IL-18的影響ELISA結果顯示,與阿司匹林組相比,沉默GSDME明顯抑制焦亡相關因子IL-1β與IL-18的水平(tIL-1β=9.953、tIL-18=11.026,均P<0.01)。見圖6。

圖6 沉默GSDME對IL-1β、IL-18含量的影響與阿司匹林組比較:**P<0.01

3 討論

結腸癌作為我國常見的惡性腫瘤,嚴重影響患者的健康,早期診斷與治療是改善結腸癌患者預后的關鍵。近些年來,由于傳統治療方式的局限性以及人們對惡性腫瘤分子生物學研究的深入,分子靶向治療已成為新的研究方向。阿司匹林是一種臨床常用的非甾體抗炎藥,除了抗風濕及預防心腦血管疾病意外,研究[7]表明,長期低劑量使用阿司匹林能夠降低結腸癌的發病率,因此被臨床推薦應用于抗結腸癌的預防治療中。現代藥理學研究證實阿司匹林具有抗炎與抗腫瘤免疫作用,但機制尚未完全明確,可能與炎癥反應可以刺激腫瘤細胞的發生與轉移有關[8]。本研究通過給予含有不同濃度阿司匹林的培養基培養干預結腸癌Caco-2細胞,結果顯示阿司匹林對于Caco-2細胞增殖活性的抑制具有時間與濃度依賴性,說明阿司匹林能夠抑制其增殖,但機制尚未明確。

細胞程序性死亡包括細胞凋亡、壞死及焦亡等[9]。與凋亡及壞死不同,細胞焦亡是由半胱氨酸天冬酶Caspase家族介導的細胞程序性死亡,當細胞受到外源刺激時,細胞內形成NLRP3炎癥小體,從而活化Caspase-1,切割Gasdermin家族的GSDMD與GSDME[10]。當GSDME被切割后會產生GSDME-N片段,研究[11]表明GSDME-N具有在細胞膜上成孔的特性,導致細胞焦亡發生。當細胞焦亡發生時,細胞膜腫脹破裂、細胞核皺縮、包含炎性因子的細胞內容物向胞外釋放。Caspase-1的結構中包括3個結構域,其中一個結構域可與炎性體中的銜接蛋白發生相互作用,進而將炎性細胞因子 pro-IL-1β和 pro-IL-18切割裂解成響應免疫細胞中的炎性刺激的活性形式IL-1β和IL-18。當細胞焦亡發生時,細胞內容物中含有大量炎癥因子IL-1β和IL-18,并會隨著細胞膜破裂而流出[12]。本研究結果顯示,使用含有阿司匹林的培養基干預,能明顯增加Caco-2細胞中NLRP3、Caspase-1、GSDME等基因的蛋白表達,提高Caco-2細胞上清液中IL-1β及IL-18的含量,說明這一過程中有細胞焦亡發生。此外本研究結果顯示,在使用含有阿司匹林的培養基培養Caco-2細胞后細胞上清中LDH水平明顯上升,提示細胞膜完整性發生了破壞,進一步說明了細胞焦亡可能參與了阿司匹林對Caco-2細胞的作用過程。

有研究報道稱,GSDME在胃癌[13]和乳腺癌[14]中的表達被沉默,表明GSDME可能在癌癥進展中發揮抑癌作用。本研究結果顯示,在正常Caco-2細胞中GSDME的關鍵剪切片段GSDME-N蛋白處于低表達狀態,而給予使用含有阿司匹林的培養基培養干預后GSDME的蛋白表達量明顯上升,同時給予阿司匹林干預后Caco-2細胞數目明顯減少,并且能夠明顯觀察到細胞膜出現腫脹甚至破裂,細胞膜內容物流出等典型的細胞焦亡形態學特征。當通過siRNA沉默GSDME后細胞上清液中LDH釋放減少,說明細胞膜破裂程度減輕,且細胞形態少見細胞焦亡形態學特征,進一步說明了GSDME是焦亡發生過程中的關鍵,而阿司匹林或許能通過誘發GSDME依賴性細胞焦亡發揮抗腫瘤細胞增殖的作用。