甲基-β-環(huán)糊精通過(guò)限制脂質(zhì)代謝抑制橫紋肌肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲

胡亞飛,闞 晨,汪思應(yīng)

橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma,RMS)是兒童中最常見的軟組織肉瘤。RMS總發(fā)病率約為4.5/100萬(wàn)[1]。近年來(lái),隨著手術(shù)、化療技術(shù)的提高以及新型抗癌藥物的出現(xiàn),RMS的治療水平顯著提升,但仍有復(fù)發(fā)和預(yù)后不良的情況出現(xiàn)[2-3]。有研究表明[4],脂質(zhì)代謝重編程參與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程,但其在肉瘤中的作用尚不清楚。從脂質(zhì)代謝重編程的角度來(lái)探究肉瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)理為肉瘤治療提供新的方向。課題組前期結(jié)果表明與正常肌肉組織相比,肉瘤組織中脂質(zhì)合成相關(guān)基因高表達(dá)。基于此,該研究采用脂質(zhì)抑制劑甲基-β-環(huán)糊精(methyl-β-cyclodextrin, mβCD)對(duì)人骨骼橫紋肌肉瘤細(xì)胞進(jìn)行處理,探究其分子機(jī)制。該研究結(jié)果可能為人骨骼橫紋肌肉瘤治療提供一個(gè)新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 人骨骼橫紋肌肉瘤細(xì)胞系(RD、SJCRH30和A673)購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù),短串聯(lián)重復(fù)序列鑒定正確。人骨骼肌細(xì)胞系(HSMC)購(gòu)自湖南豐輝生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用8只 4～5 周齡的 BALB/C雌性裸鼠,體質(zhì)量 16～20 g(購(gòu)自江蘇集萃藥康生物科技股份公司),動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào):LLSC 20210807)。飼養(yǎng)條件:SPF 級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng),環(huán)境溫度20～24 ℃,濕度40%～70%,通風(fēng)換氣15～20次/h,設(shè)置12 h 光照12 h 黑暗交替。

1.1.2主要試劑與儀器 胎牛血清(FBS,貨號(hào): S711-001S)購(gòu)自美國(guó)Lonsera公司,DMEM高糖培養(yǎng)基(貨號(hào):PM150210)、RPMI-1640培養(yǎng)基(貨號(hào):PM150110)購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司,細(xì)胞計(jì)數(shù)盒-8(cell counting kit-8, CCK-8)檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):GK10001)購(gòu)自美國(guó)GLPBIO公司,基質(zhì)膠(Matrige,貨號(hào):356234)、細(xì)胞培養(yǎng)小室(Transwell小室,貨號(hào):353097)購(gòu)自美國(guó)BD公司,結(jié)晶紫染色液(貨號(hào):G1063)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司,TRIzol總RNA提取試劑(貨號(hào):CW0580)購(gòu)自江蘇康為世紀(jì)生物科技有限股份公司, EVO M-MLV反轉(zhuǎn)錄預(yù)混型示蹤試劑盒(貨號(hào):AG11734)、SYBR GreenProTagHS 預(yù)混型qPCR 試劑盒(貨號(hào):AG11476)購(gòu)自湖南艾科瑞生物工程有限公司,qRT-PCR引物購(gòu)自上海生物工程有限公司,mβCD(貨號(hào):GC32697)購(gòu)自美國(guó)GLPBIO公司,三酰甘油(triglyceride,TG)檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):E1013-50)購(gòu)自北京普利萊公司,細(xì)胞培養(yǎng)箱(型號(hào):Galaxy170S)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司,酶標(biāo)儀(型號(hào): Varioskan LUX)購(gòu)自美國(guó)賽默飛生物有限公司,實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(型號(hào):CFX96)購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析 利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析脂質(zhì)合成相關(guān)基因在正常肌肉組織和肉瘤組織中的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)合成相關(guān)基因在肉瘤組織中高表達(dá),故后續(xù)通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證。

1.2.2qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞SREBP1和SQLEmRNA表達(dá) 采用TRIzol法提取細(xì)胞(HSMC,RD,SJCRH30和A673)總RNA,測(cè)定其RNA濃度和純度后,使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。利用SYBR Green Pro Tag HS 預(yù)混型進(jìn)行 qRT-PCR 檢測(cè),反應(yīng)體系為 20 ul,每組樣品設(shè)置 3個(gè)復(fù)孔。擴(kuò)增程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性30 s ,95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s。共41個(gè)循環(huán)。目標(biāo)基因SREBP1引物 F: 5′-CGGAACCATCTTGGCAACAGT-3′,R: 5′-CGCTTCTCAATGGCGTTGT-3′ ;SQLE引物F:5′-GATGATGCAGCTATTTTCGAGGC-3′,R: 5′-CCTGAGCAAGGATATTCACGACA-3′。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組與處理 本研究分為3組對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,對(duì)照組1:正常培養(yǎng)的人骨骼橫紋肌肉瘤細(xì)胞系RD;實(shí)驗(yàn)組1: mβCD(1mmol/L)處理的RD;對(duì)照組2:正常培養(yǎng)的人骨骼橫紋肌肉瘤細(xì)胞系SJCRH30;實(shí)驗(yàn)組2: mβCD(1 mmol/L)處理的SJCRH30;對(duì)照組3:正常培養(yǎng)的人骨骼橫紋肌肉瘤細(xì)胞系A(chǔ)673;實(shí)驗(yàn)組3: mβCD(1 mmol/L)處理的A673。用于后續(xù)平板克隆、軟瓊脂集落形成、細(xì)胞遷移侵襲和TG檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4細(xì)胞培養(yǎng) HSMC、RD、A673細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的 DMEM高糖培養(yǎng)液中,SJCRH30細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素RPMI-1640培養(yǎng)液中。所有細(xì)胞均在 37 ℃、5% CO2加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,采用0.25%胰蛋白酶消化方式對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代。后續(xù)試驗(yàn)細(xì)胞均為8～15代。

1.2.5細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) CCK-8試劑盒用于檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。將細(xì)胞(RD、SJCRH30、A673)接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔細(xì)胞密度為2 000個(gè),培養(yǎng)液為體積100 μl。4 h后使用新鮮培養(yǎng)液將mβCD稀釋為5個(gè)梯度(0、0.5、1、1.5、2 mmol/L)。棄去 96 孔板內(nèi)原有培養(yǎng)液,加入含上述濃度的mβCD培養(yǎng)液。培養(yǎng)0 、24 、48 、72 h后,加入10 μl CCK-8溶液, 孵育2 h。其中,0 h檢測(cè)時(shí)間在細(xì)胞貼壁后(即培養(yǎng)4～6 h)。用多功能酶標(biāo)測(cè)量?jī)x檢測(cè) 450 nm處的吸光度值。

1.2.6平板克隆實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞消化離心后,按每孔1 500 個(gè)細(xì)胞量接種到6孔板內(nèi),每組3個(gè)復(fù)孔。將6孔板置于37 ℃、5% CO2的加濕細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10 d左右。時(shí)間到后,在孔內(nèi)加入0.1 % 結(jié)晶紫染色液對(duì)細(xì)胞染色固定,拍照留存。

1.2.7軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn) 按照1 ∶1的比例將培養(yǎng)液和1.2%的瓊脂糖溶液混合均勻鋪在6孔板待凝,此過(guò)程約30 min。隨后將0.7%瓊脂糖溶液與含各組細(xì)胞(每孔2 000個(gè)細(xì)胞)的完全培養(yǎng)基混合液加入6孔板中待凝,此過(guò)程30 min。之后在每孔內(nèi)加入適量培養(yǎng)液,防止蒸發(fā)。14 d后鏡下觀察。

1.2.8細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞消化計(jì)數(shù),并用無(wú)血清培養(yǎng)液重懸,稀釋為每孔3×104。在24孔板孔內(nèi)加入600 μl完全培養(yǎng)液,之后將小室放入孔內(nèi),吸取各組無(wú)血清細(xì)胞懸液加入到小室上層。將24孔板放在37 ℃、5% CO2的加濕細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。之后對(duì)小室清洗,結(jié)晶紫染色,對(duì)小室下層細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.9細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 按照1 ∶6的比例將基質(zhì)膠與無(wú)血清培養(yǎng)液混合,每個(gè)小室200 μl混合液,待凝。此過(guò)程大約1 h。細(xì)胞消化計(jì)數(shù),并用無(wú)血清培養(yǎng)液重懸,稀釋為每孔3×104。在24孔板孔內(nèi)加入600 μl完全培養(yǎng)液,之后將小室放入孔內(nèi),吸取無(wú)血清細(xì)胞懸液加入到小室基質(zhì)膠上層。將24孔板放在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。之后對(duì)小室清洗,結(jié)晶紫染色。對(duì)小室下層細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.10裸鼠成瘤 將細(xì)胞數(shù)為5×106,體積為150 μl的SJCRH30細(xì)胞懸液分別接種到小鼠腋下。3 d后,對(duì)照組小鼠開始隔天腹腔注射150 μl無(wú)菌PBS,實(shí)驗(yàn)組小鼠隔天腹腔注射150 μl用PBS溶解后的mβCD溶液,藥物劑量為400 mg/kg。期間記錄小鼠體質(zhì)量,測(cè)量腫瘤體積。

1.2.11脂質(zhì)組學(xué) 將對(duì)照組(SJCRH30)和實(shí)驗(yàn)組(1 mmol/L mβCD處理)細(xì)胞消化離心,按照每組細(xì)胞數(shù)為1×107裝到無(wú)菌1.5 ml EP管內(nèi),每組取3個(gè)樣本。將樣本在4 ℃離心機(jī)離心5 min,轉(zhuǎn)速為 2 000 r/min。棄上清液,收集細(xì)胞沉淀于 1.5 ml 離心管中。標(biāo)記好EP管,將EP管的尖底插入液氮中,淬滅細(xì)胞沉淀 1 min,-80 ℃冰箱內(nèi)保存。收集好樣本后由歐易生物公司完成后續(xù)檢測(cè)。

1.2.12TG檢測(cè) 將細(xì)胞消化離心計(jì)數(shù),細(xì)胞數(shù)為1×106。后續(xù)按照說(shuō)明書操作,多功能酶標(biāo)測(cè)量?jī)x在波長(zhǎng)550 nm處讀取數(shù)據(jù),分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 脂質(zhì)合成相關(guān)基因在人骨骼肌細(xì)胞和人骨骼橫紋肌肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況腫瘤基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常肌肉組織相比,脂質(zhì)合成相關(guān)基因在肉瘤組織中高表達(dá)。見圖1A。選取數(shù)據(jù)庫(kù)中表達(dá)差異最明顯的兩個(gè)基因SREBP1和SQLE在人骨骼肌細(xì)胞和人骨骼橫紋肌肉瘤細(xì)胞中驗(yàn)證。qRT-PCR結(jié)果顯示:與HSMC相比,人骨骼橫紋肌肉瘤細(xì)胞(RD、SJCRH30和A673)SREBP1基因和SQLE基因mRNA表達(dá)均升高(SREBP1:tRD=26.62,tSJCRH30=93.50,tA673=12.15, 均P<0.001;SQLE:tRD=26.09,tSJCRH30=21.21,tA673=12.09,均P<0.001)。見圖1B-C。

圖1 數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果及SREBP1、SQLE基因在不同細(xì)胞的相對(duì)表達(dá)情況

2.2 mβCD對(duì)人骨骼橫紋肌肉瘤細(xì)胞增殖能力的影響CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組(0 mmol/L)相比,0.5、1、1.5、2 mmol/L mβCD處理的RD、SJCRH30和A673細(xì)胞的增殖能力均下降(0.5 mmol/L:tRD=8.69,tSJCRH30=6.08,tA673=23.05;1 mmol/L:tRD=15.29,tSJCRH30=25.76,tA673=22.98;1.5 mmol/L:tRD=16.86,tSJCRH30=46.04,tA673=31.76;2 mmol/L:tRD=58.67,tSJCRH30=53.46,tA673=35.69,均P<0.01)。見圖2。

圖2 不同濃度mβCD處理后各組細(xì)胞的增殖能力

2.3 mβCD對(duì)人骨骼橫紋肌肉瘤細(xì)胞形成克隆能力的影響平板克隆結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,mβCD處理的RD、SJCRH30、A673細(xì)胞形成的克隆數(shù)目明顯減少。(tRD=9.92,tSJCRH30=15.48,tA673=10.36,均P<0.001)。見圖3。

圖3 mβCD處理后各組的細(xì)胞克隆情況

2.4 mβCD對(duì)人骨骼橫紋肌肉瘤細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,mβCD處理的RD、SJCRH30和A673細(xì)胞遷移數(shù)目下降(tRD=12.81,tSJCRH30=15.62,tA673=10.09,均P<0.001)。見圖4。此外,與對(duì)照組相比,mβCD處理的RD、SJCRH30、A673細(xì)胞侵襲數(shù)目也明顯下降(tRD=7.05,tSJCRH30=4.74,tA673=8.76,均P<0.01)。見圖5。

圖4 mβCD對(duì)人骨骼橫紋肌肉瘤細(xì)胞遷移能力的影響

圖5 mβCD對(duì)人骨骼橫紋肌肉瘤細(xì)胞侵襲能力的影響

2.5 mβCD對(duì)人骨骼橫紋肌肉瘤細(xì)胞軟瓊脂集落形成能力的影響腫瘤細(xì)胞具有非錨定生長(zhǎng)能力。軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比, mβCD處理的RD、SJCRH30、A673細(xì)胞軟瓊脂集落形成數(shù)量減少(tRD=4.00,tSJCRH30=5.00,tA673=4.03,均P<0.05 )。見圖6。

圖6 mβCD處理后各組細(xì)胞的軟瓊脂集落形成能力

2.6 mβCD對(duì)人骨骼橫紋肌肉瘤細(xì)胞成瘤能力的影響裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,mβCD組小鼠重量減輕,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖7C。與對(duì)照組相比,mβCD組腫瘤體積明顯下降(接種后15 d:t=2.76,P<0.05;接種后17 d:t=3.19,P<0.05;接種后19 d:t=4.81,P<0.01;接種后21 d:t=4.93,P<0.001)。見圖7A、B、D。同時(shí)mβCD組腫瘤重量也降低(t=6.62,P<0.001)。見圖7E。以上這些結(jié)果均可證實(shí)mβCD具有抑制人骨骼橫紋肌肉瘤細(xì)胞的成瘤能力。

圖7 mβCD對(duì)人骨骼橫紋肌肉瘤細(xì)胞成瘤能力的影響

2.7 mβCD對(duì)人骨骼橫紋肌肉瘤細(xì)胞中脂質(zhì)代謝物的影響主成分分析圖、偏最小二乘-判別分析和正交偏最小二乘方-判別分析三種統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組有差異。見圖8A-C。表明人骨骼橫紋肌肉瘤細(xì)胞在mβCD處理后,脂質(zhì)代謝物發(fā)生變化。此外,在變量權(quán)重值(variable important in projection,VIP)>1,t<0.05的篩選條件下,篩選出128個(gè)差異代謝物。見圖8D。紅色原點(diǎn)為實(shí)驗(yàn)組中顯著上調(diào)的代謝產(chǎn)物(P<0.05, VIP>1 且fold chage (FC)>1),共75個(gè)。藍(lán)色原點(diǎn)為實(shí)驗(yàn)組中顯著下調(diào)的代謝產(chǎn)物(P<0.05, VIP>1 且FC<1),共53個(gè)。灰色原點(diǎn)代表無(wú)顯著變化的代謝產(chǎn)物。KEGG富集通路分析結(jié)果顯示,mβCD可抑制人骨骼橫紋肌肉瘤細(xì)胞中TG的代謝物生成(tTG(16:1/18:1/18:1)=5.85,tTG(16:1/16:1/18:1)=14.71,tTG(16:0/18:1/18:1)=6.41,tTG(16:0/16:1/18:1)=4.00,tTG(16:0/18:1/20:4)=9.78,tTG(18:0/18:1/18:1)=3.02,均P<0.05)。見圖9。TG檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示:與三組人骨骼橫紋肌肉瘤細(xì)胞相比,mβCD(1 mmol/L)處理組TG含量均降低(tRD=7.78,tSJCRH30=9.34,tA673=2.20,P<0.01)。見圖10。提示mβCD很可能通過(guò)降低TG含量來(lái)減輕人骨骼橫紋肌肉瘤細(xì)胞的惡性程度。

圖8 多元統(tǒng)計(jì)分析及火山圖

圖9 KEGG富集通路分析圖

圖10 mβCD對(duì)人骨骼橫紋肌肉瘤細(xì)胞TG含量的影響

3 討論

RMS 是軟組織惡性腫瘤的一種,具有高度的侵襲性,主要影響兒童。然而,其治療和預(yù)后的效果并不十分理想[5],探究新的治療靶點(diǎn)尤為重要。該研究通過(guò)探究橫紋肌肉瘤細(xì)胞中脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)其脂質(zhì)合成較正常細(xì)胞上升,mβCD可能通過(guò)抑制脂質(zhì)合成而減輕橫紋肌肉瘤惡性程度,為RMS治療提供新的視角。

腫瘤的發(fā)生受多重因素影響,如環(huán)境改變和基因突變等[6-7]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)代謝重編程成為癌癥的主要特征之一[8],已被眾多研究者關(guān)注,但在肉瘤方面的研究仍有很大欠缺。本研究從脂質(zhì)合成的角度入手,探究脂質(zhì)代謝重編程在肉瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用。通過(guò)查閱數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn),相較正常肌肉組織,脂質(zhì)合成相關(guān)基因在肉瘤組織中高表達(dá),并在qRT-PCR中得到驗(yàn)證,結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)相一致。提示在肉瘤中脂質(zhì)代謝可能也進(jìn)行重編程。有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)βCD是一種有效的脂質(zhì)小分子藥物抑制劑,它可以將細(xì)胞質(zhì)膜的疏水結(jié)構(gòu)封裝在其內(nèi)部疏水腔中,并連續(xù)地從外層質(zhì)膜中提取膽固醇等相關(guān)脂質(zhì)[9]。持續(xù)的膽固醇消耗增加細(xì)胞膜張力及其可變性,使細(xì)胞容易發(fā)生獨(dú)立于細(xì)胞骨架狀態(tài)的破裂[10]。利用此特性,它可以通過(guò)抑制PI3K-Akt-Bad通路的激活,誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[11]。然而mβCD對(duì)于橫紋肌肉瘤的影響目前仍然未知。本研究表明mβCD可以抑制人骨骼橫紋肌肉瘤細(xì)胞的克隆形成、遷移以及侵襲。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證mβCD可以抑制人骨骼橫紋肌肉瘤的生長(zhǎng)。以上結(jié)果都表明mβCD可以抑制人骨骼橫紋肌肉瘤細(xì)胞的惡性程度。本研究脂質(zhì)組學(xué)結(jié)果分析顯示mβCD處理后可降低人骨骼橫紋肌肉瘤細(xì)胞中TG含量。TG增高也是腫瘤發(fā)展的誘因,也有研究[12]將其作為治療靶點(diǎn)。同時(shí)用TG檢測(cè)試劑盒對(duì)脂質(zhì)組學(xué)的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果表明mβCD處理后人橫紋肌肉瘤細(xì)胞TG含量降低。在本研究中雖證明mβCD可以抑制人骨骼橫紋肌肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等惡性生物學(xué)行為,且可能是通過(guò)降低TG含量發(fā)揮的抑制作用,為橫紋肌肉瘤的治療提供了一個(gè)新的思路。但本研究仍有不足之處,關(guān)于mβCD抑制人骨骼橫紋肌肉瘤細(xì)胞惡性的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步探究,TG合成與人骨骼橫紋肌肉瘤細(xì)胞惡性程度的相關(guān)性需要進(jìn)一步厘清,調(diào)控人骨骼橫紋肌肉瘤細(xì)胞TG合成的基因需深度挖掘。