合成樹脂類材料的細胞毒性方法差異性分析

鐘文雨，黃虹蓉，楊安然，孔怡然，林鐘石

(深圳市醫療器械檢測中心，廣東 深圳 518000)

0 引言

醫療器械是指單獨或者組合使用于人體的儀器、設備、器具、材料或者其他物品，也包括所需要的軟件[1]，其安全性與人民健康和社會安全都具有緊密聯系[2]。一次性醫療用品大多數由高分子聚合物即合成樹脂類制作而成[3]，合成樹脂具有許多優異的性能，可以制造成塑料假肢、合成樹脂牙等[4]，被廣泛用于醫療的各個領域。市面上合成樹脂類一次性醫療用品種類越來越豐富，但也大大增加了其與人體暴露的風險。因此，合成樹脂類材料的醫療器械的臨床前安全性評價就尤為重要，選擇適宜的檢測方法可以有效地縮短醫療器械的臨床前評價研究時限以及節省研究成本。體外細胞毒性試驗作為目前醫療器械進行臨床前安全性評價的首選和必選試驗項目[5]，其具有研究周期短、敏感性高、節省經費的優勢[6]。其中的浸提液實驗是目前較為廣泛的用于檢測醫療器械的細胞毒性的方法，其定量評價方法相對于定性評價方法更具有客觀性。

在GB/T 16886.5—2017 中體外細胞毒性試驗的定量評價方法包含中性紅攝取法、集落形成法、MTT 比色法以及XTT 比色法[7]。這四種試驗方法的機理存在不同之處，如何按照標準要求來選擇適宜的細胞毒性試驗方法，是目前醫療器械注冊前的一大難點。本實驗根據GB/T 16886.5—2017 附錄中提供的中性紅攝取法、集落形成法、MTT 比色法以及XTT 比色法四種定量試驗方法，選擇醫療領域中使用率較高的PE、PP、PS 和PVC 四種合成樹脂類材料作為代表，評價分析合成樹脂類材料在四種不同試驗方法下的細胞毒性結果的差異性，以此為選擇適宜的細胞毒性檢測方法提供一定的數據支持。

1 實驗材料與方法

樣品前處理參照GB/T 16886.12—2017，PE 材料、PP 材料、PS 材料和PVC 材料按照0.2 g/mL 的浸提比例制備樣品浸提液。

1.1 中性紅攝取法

1.1.1 材料

BALB/c 3T3 細胞(中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫)；DMEM 培養基、新生小牛血清(GIBCO)；乙醇、乙酸(廣州化學試劑廠)；中性紅染料(SIGMA)。

1.1.2 實驗步驟

將BALB/c 3T3 細胞按照1×104個細胞/100 μL 接種在96 孔板孔中，置于5% CO2培養箱37 ℃培養24 h后棄去原培養液，分別加入空白對照溶液、陽性對照溶液、樣品浸提液。在培養24 h 后，小心棄去原培養液，用100 μL 預熱的PBS 沖洗后，每孔加入100 μL 的中性紅培養基再孵育3 h。然后棄去中性紅培養基，150 μL PBS沖洗后，每孔再加入150 μL 中性紅洗脫液，在酶標儀540 nm 波長下測定吸光度并計算細胞相對活力。

1.2 集落形成法

1.2.1 材料

V79 細胞(中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫)；MEM 培養基、胎小牛血清(GIBCO)；吉姆薩染液(珠海貝索)。

1.2.2 實驗步驟

將V79 細胞按照100個細胞/13 mL 接種在6 孔板孔中，置5% CO2培養箱37 ℃培養24 h 后棄去原培養液，分別加入2 mL 的空白對照溶液、陽性對照溶液、樣品浸提液。培養6 d 后，棄去原培養液，用PBS 沖洗后，加入甲醇固定集落，再用5%吉姆薩染液染色后，計算每一孔的集落數目，并計算每個組別的PE 值。

1.3 MTT 比色法

1.3.1 材料

L-929 細胞(中國科學院典型培養物保藏委員會 細 胞庫)；MEM 培 養 基、胎 小 牛 血清(GIBCO)；

MTT(SIGMA)。

1.3.2 實驗步驟

將L929 細胞按照1×104個細胞/100 μL 接種在96 孔板孔中，置5% CO2培養箱37 ℃培養24 h 后棄去原培養液，分別加入空白對照溶液、陰性對照浸提液、陽性對照、樣品浸提液，每組設置6 個復孔。在培養24 h 后，倒置顯微鏡下檢查無異常后，小心棄去原培養液，每孔加入50 μL 的MTT 溶液再孵育2 h。然后棄去MTT 溶液，每孔加入100 μL 異丙醇，在酶標儀570 nm 波長(參比波長650 nm)下測定光密度并計算存活率。

1.4 XTT 比色法

1.4.1 材料

L-929 細胞(中國科學院典型培養物保藏委員會細 胞庫)；MEM 培 養基、胎 小 牛 血清(GIBCO)；XTT、PMS(SIGMA)。

1.4.2 實驗步驟

將L929 細胞按照1×104個細胞/100 μL 接種在96 孔板孔中，置5% CO2培養箱37 ℃培養24 h 后棄去原培養液，分別加入空白對照溶液、陰性對照浸提液、陽性對照以及樣品浸提液，每組設置6 個復孔。在培養24 h 后，倒置顯微鏡下檢查無異常后，每孔加入50 μL的XTT/PMS 溶液再孵育4 h。振蕩混勻后從每孔取出100 μL 等份液體至新的孔板對應孔中，在酶標儀450 nm波長(參比波長630 nm)下測定吸光度并計算存活率。

2 結果判定條件

以上四種不同定量試驗方法，均采用結果數值70%為界限判定樣品的細胞毒性。每種方法對應的測定條件以及判定條件如表1 所示。

表1 不同方法的細胞毒性測定條件及判定

3 實驗結果

4 種不同的試驗樣品分別在四種定量試驗方法下測定細胞毒性，中性紅攝取法、集落形成法、MTT 比色法及XTT 比色法的細胞毒性詳細結果如表2 所示。

表2 受試樣品在不同實驗方法下的細胞毒性結果

本實驗結果表明，合成樹脂類材料在這四種不同實驗方法下，表現出的細胞毒性結果無顯著性差異，結果具有一致性。

4 討論

PE 是一種通過乙烯聚合制備得到的高性能樹脂，由于其優良的機械強度和生物相容性以及無味、無毒、植入體內無不良影響等優勢，低密度PE 可用于制造薄膜和包裝袋等；高密度PE 則用于制造人工臟器、人工關節、矯形外科修補材料等；超高分子量PE 在骨科和心血管植入領域得到普及[8]。PP 是丙烯聚合制備得到的材料，主要用于制造醫用導管、輸液容器等，也可經表面活性劑處理后制成人工肺等[9]。PS 是苯乙烯單體自由基加聚合成而得到的透明、熱塑性合成樹脂[10]，主要用于制造醫療用瓶、注射器托盤和包裝材料等。PVC 是由氯乙烯在引發劑作用下聚合而成的熱塑性合成樹脂，具有良好的力學性能且耐寒、柔軟、透明[11]，主要用于輸血袋、輸液袋、體外循環裝置導管、鼓泡式氧合袋、尿袋等與人體短期接觸的制品。由此可見，合成樹脂在醫用耗材、治療性器械、植入性器械等多個方向都具有不可忽視的地位，因此其臨床前生物安全性評價是必不可少的。

通過細胞毒性定量檢測方法，可以客觀地測量細胞數量、蛋白質總量、酶釋放、活體染料釋放以及還原等參數，其靈敏度和判定限都比定性評價更高，而且受到試驗者個人主觀因素的影響也更小。然而，定量的試驗方法中也各有優勢和不足。中性紅攝取法是檢測溶酶體完整性，具有靈敏度高、重現性好、高通量的優點[6]，但誘發溶酶體腫脹的物質會干擾實驗結果而出現假陰性[12]；集落形成法通過細胞增殖能力表現細胞毒性，這種增殖能力在死細胞或不再具備分裂能力的細胞上是喪失的[13-14]，但受實驗操作人員的主觀因素影響較大且耗時長；MTT 和XTT 比色法實驗原理相同，都是通過降解活細胞內的線粒體脫氫酶來反映細胞毒性[15]，但生成的有色物質不同，MTT 比色法產生的甲臜需要通過裂解細胞以溶解測定，XTT比色法減少了人為操作誤差[16]，但XTT 試劑相較于MTT 成本較高，大大增加了試驗成本。

本試驗通過對PE、PP、PS、PVC 這四種材料進行中性紅攝取法、集落形成法、MTT 比色法及XTT 比色法測定細胞毒性，均未表現出細胞毒性，因此這四種樹脂材料選擇任一定量測定方法均可測定。但在生產工藝過程中，原材料需要經過一系列的切割、黏合等操作后才能成為最終產品，這些過程中也許會產生新的致使細胞毒性的物質仍未可知。因而，在選擇細胞毒性的定量試驗方法時，仍然需要根據產品本身的特性選擇適當的方法。原材料的細胞毒性雖然不能代表生產的最終產品的細胞毒性，但可以作為優化產品的思路，節省產品研發成本。