基于網絡藥理學探討八珍湯重塑食管癌腫瘤微環境的作用機制

瞿穎，向科旭，王蓓茹，侯鋮宇，王繼勇

1. 廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東 廣州 510006 2. 湖南醫藥學院第一附屬醫院，湖南 懷化 418000 3. 廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東 廣州 510405

食管癌是全球性的常見惡性腫瘤之一，發病率及死亡率分別占至惡性腫瘤第7 位及第6 位[1]。當前，食管癌主要采用手術、放化療、免疫和靶向治療等聯合治療方案。其中手術仍然是首選治療，但是食管癌發現時往往是局部晚期，手術切除局部腫瘤后，局部失敗率和遠處轉移率很高，故而術前常進行新輔助治療（放療、化療或聯合治療），能夠減少腫瘤微轉移、提高完全切除率。目前本科室針對局部晚期食管癌患者術前主要采用化療加免疫治療（卡鉑+白蛋白紫杉醇+卡瑞麗珠單抗），待病灶縮小后行手術治療，該方式治療效果良好，部分患者可以達到病理完全緩解[2]。但是，輔助治療后患者往往出現氣血不足的表現，出現貧血、白細胞降低等相關并發癥，從而影響食管癌治療效果。由于食管癌手術范圍大（切除全部食管以及部分胃），手術時間長，中醫認為手術、長時間麻醉會耗傷人體氣血，故而食管癌術后往往氣血不足[3]，且部分患者行化學治療后，常出現骨髓抑制，中醫認為化療后骨髓抑制基本屬于氣血不足[4]，術后還會繼續行一定療程的化學輔助治療，往往會損傷脾胃，加之食管癌患者脾胃本不足，氣血生化無源，更加耗傷人體氣血，故而在治療食管癌期間注重恢復氣血。八珍湯為氣血雙補的經典方劑，本科室在臨床上運用八珍湯聯合化療加免疫治療方式能夠減少血液系統相關并發癥的發生，有效改善患者氣血不足的表現。故探討食管癌氣血不足證的治療及機制研究尤為重要。文獻表明，八珍湯輔助放化療治療惡性腫瘤可取得滿意的療效[5-7]。其在改善患者營養狀況、增強免疫功能、提高生活質量以及延長生存期等方面發揮著重要的作用[8-9]。有研究表明，八珍湯聯合放化療可激活CD4、CD8、NK 細胞活性，增強中晚期食管癌患者的免疫功能，同時減輕放化療引起的骨髓抑制等不良反應，從而提高抗腫瘤作用[10]。也有研究報道術前同步放化療聯合八珍湯治療食管癌獲得良好的療效[11]。雖然八珍湯在食管癌治療方面發揮重要作用，但是其具體機制尚不清楚。腫瘤微環境是腫瘤細胞生長和轉移的土壤，中藥干預腫瘤微環境已成為腫瘤治療的研究熱點。現代研究發現中醫藥抗腫瘤的優勢不在于徹底消滅腫瘤，在于重塑腫瘤微環境，從而誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤的增殖、血管生成、免疫逃逸等[12]。腫瘤微環境的理論基礎與中醫整體觀念一致，不單純研究腫瘤本身，還探索腫瘤周圍環境對腫瘤生長的影響。故而基于腫瘤微環境探索八珍湯重塑腫瘤微環境的機制更能闡釋八珍湯的作用機制與辨病辨證施治。生物信息學和網絡藥理學能從生物網絡出發分析藥物有效成分與疾病和靶點之間的作用關系，進而闡明藥物的藥效物質基礎和作用機制。本研究運用生物信息學和網絡藥理學方法探討八珍湯重塑食管癌腫瘤微環境的潛在靶點與作用機制，并借助分子對接技術進行驗證，以期為后續研究提供理論依據及數據支持。

1 資料與方法

1.1 篩選藥物有效成分及靶點通過檢索中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP，https：//old.tcmspe.com/tcmsp.php）數據庫，分別根據篩選標準檢索八珍湯中各個中藥（人參、白術、茯苓、甘草、當歸、熟地黃、白芍、川芎）的活性成分。篩選標準：口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18。利用TCMSP 獲取八珍湯活性成分的靶標蛋白，根據UniProt（http：//www.uniport.org/）數據庫中蛋白注釋文件將靶蛋白的名稱轉換為基因名。

1.2 獲取影響食管癌腫瘤微環境的相關靶點通過R 語言中的TCGAbiolinks 包（版本2.25.3）從美國國家癌癥研究所建立的癌癥基因組圖譜（TCGA，https：//portal.gdc.cancer：gov）數據庫下載食管癌患者的轉錄組數據和臨床信息，轉錄組數據格式為FPKM，從原始數據中篩選具有完整預后信息的食管癌樣本，對于食管癌樣本基因表達矩陣重復數據保留表達值最高的數值。通過使用R 語言的ESTIMATE 包（版本1.0.13）計算食管癌腫瘤樣本的相關評分。使用survminer 包的surv_cutpoint 函數確定各相關評分生存曲線的最佳截斷值（cut-off 值），并根據cut-off 值將腫瘤樣本分為高低評分兩組，并利用survival包（版本3.5-0）和survminer 包（版本0.4.9）分析高低分組間的生存率，繪制相應的生存曲線，P＜0.05 時認為差異具有統計學意義。根據上述高低分組生存分析結果，使用R 軟件的limma 包（版本3.54.1）篩選與食管癌患者生存顯著相關的免疫評分高低組和基質評分高低組間的差異表達基因并取并集。篩選標準為|logFC|＞0.585 和校正后的P＜0.05。并集中的差異基因是食管癌腫瘤微環境預后相關基因，將這些預后相關基因作為重塑食管癌腫瘤微環境的相關基因。

1.3 八珍湯重塑食管癌腫瘤微環境的靶點篩選及“中藥-成分-靶點”網絡構建使用在線工具Venny（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）對上述八珍湯有效成分靶點及重塑食管癌腫瘤微環境相關基因取交集，獲得交集基因。結合藥物成分信息文件，使用Cytoscpe 3.9.1 構建“中藥-成分-靶點”網絡。

1.4 生物信息學分析采用生物學富集方法對上述過程得到的交集基因進行分析，本過程采用注釋、可視化和集成發現數據庫（DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）完成，從基因本體（GO）富集分析以及京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集兩方面對共有基因進行分析，并通過三線表呈現，篩選條件：FDR＜0.05。

1.5 八珍湯重塑食管癌腫瘤微環境相關基因的蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡構建及Hub 基因篩選將八珍湯重塑食管癌腫瘤微環境相關基因導入STRING 數據庫獲得其PPI 網絡映射關系，并通過Cytoscape 3.9.1 對該映射關系進行可視化，并利用Cytoscape 的插件CytoHubba 篩選網絡中的關鍵基因，根據最大團中心（MCC）算法篩選最為重要的前5 個Hub 基因，并將這5 個Hub 基因作為核心基因。

1.6 分子對接將PPI 網絡中篩選得到的核心基因作為后續分析的核心靶點，檢索核心靶點對應的藥物成分作為核心藥物成分。通過PubChem 數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取核心藥物成分的3D 結構，下載其SDF 格式文件，并通過OpenBabelGUI 將其轉換成mol2 格式文件。在PDB（https：//www.rcsb.org/）數據庫下載核心靶點蛋白的三維結構并應用Pymol 軟件去溶劑分子、水分子及配體，保存為pdb 格式文件，其中靶蛋白的選擇標準為來源于人蛋白且具有高分辨率。將受體蛋白文件和藥物配體文件分別導入AutoDockTools 1.5.7 軟件加全氫、分配電荷、檢測和設置扭轉鍵，并保存為pdbqt 格式文件。將受體蛋白和藥物配體的pdbqt 格式文件導入AutoDockTools 1.5.7 軟件生成對接盒子并保存為gpf 格式文件，然后運行autogrid 計算格點中相關能量，該數據保存為GLG 文件。使用半柔性對接方式進行對接，設置相關參數，并運行autodock，結果文件為GLG 文件，該文件記錄了50 種對接結果的結合自由能等信息，下載結合自由能最低的一種對接方式通過Pymol 繪制模型圖。

2 結果

2.1 藥物有效成分及靶蛋白獲取通過TCMSP 數據庫進行篩選，共獲得八珍湯組方藥物150 個有效成分，并通過UniProt 數據庫匹配基因名成功的有效成分有123 個，其中當歸藥物成分2 個、川芎藥物成分6 個、熟地黃藥物成分2 個、白芍藥物成分8 個、白術藥物成分4 個、茯苓藥物成分6 個、甘草藥物成分88 個、人參藥物成分17 個，其中重復成分有5 個。基于上述有效成分，經過篩查和注釋后獲得239 個靶點。

2.2 不同評分分組與食管癌患者預后的關系見圖1。通過TCGA 數據庫下載食管癌患者的轉錄組數據和臨床信息，經過篩選得到具有完整臨床預后信息的食管癌樣本151 例。根據食管癌樣本的免疫評分和基質評分的cut-off 值進行分組，高于cut-off 值的樣本歸為高分組，低于cut-off 值的樣本歸為低分組。免疫評分最佳cut-off 值為219.2，共96 例樣本分入高分組，另55 例樣本屬于低分組。基質評分的最佳cut-off 值為-1 164.9，同樣133 例和18 例樣本分別歸入高分組和低分組。綜合評分的cut-off 值為-663.3，同樣112 例和39 例樣本分別歸入高分組和低分組。采用Kaplan-Meier 法分析高低分組間的生存概率，并繪制生存曲線。結果發現，高評分組較低評分組預后差，差異有統計學意義（P＜0.05），說明腫瘤微環境中的免疫成分和基質成分共同影響著食管癌患者的預后。

圖1 不同評分分組生存曲線

2.3 食管癌腫瘤微環境相關差異基因篩選見圖2。通過對免疫評分和基質評分不同分組間的生存分析發現，評分高組較評分低組預后差，差異顯著，為探索重塑食管癌腫瘤微環境的相關靶點，分別根據免疫評分和基質評分進行高低分組，并通過limma 包篩選它們的差異基因，結果如下：根據基質評分分組篩選到1 096 個上調基因，488 個下調基因；根據免疫評分分組篩選到770 個上調基因，117 個下調基因；篩選標準：|log2FC|＞1，FDR＜0.05。分別將上調和下調基因以及前40 個差異基因通過火山圖和熱圖進行可視化展現。最后通過將基質評分分組及免疫評分分組的差異基因取并集，去除重復基因，共獲得1 373 個差異基因作為重塑食管癌腫瘤微環境的主要靶點。

2.4 八珍湯重塑食管癌腫瘤微環境相關藥物靶點獲取見圖3。通過上述差異分析獲得食管癌腫瘤微環境預后相關基因1 373 個。將上述基因與239 個八珍湯有效成分靶基因取交集，得到八珍湯重塑食管癌腫瘤微環境相關藥物靶點31 個。

圖3 八珍湯重塑食管癌腫瘤微環境相關靶點

2.5 構建“中藥-有效成分-靶點-疾病”可視化網絡見圖4。基于藥物有效成分及靶點信息，使用Cytoscape 3.9.0 軟件構建“中藥-成分-靶點”網絡，網絡中包含46 個節點、46 條邊，其中藍色菱形代表靶點，綠色圓形代表不同中藥，不同顏色正方形代表不同中藥的藥物有效成分。網絡顯示，甘草（GC）重塑食管癌腫瘤微環境相關靶點的有效成分有4 種，分別為：槲皮素（MOL000098）、異鼠李素（MOL000354）、柚皮素（MOL004328）、山奈酚（MOL000422）。川芎（CX）重塑食管癌微環境相關靶點的有效成分有1 種，為：楊梅酮（MOL002135）。熟地黃（SDH）重塑食管癌微環境相關靶點的有效成分有1 種，為：豆甾醇（MOL000449）。當歸（DG）重塑食管癌微環境相關靶點的有效成分有2 種，為：豆甾醇（MOL000449）、β-谷甾醇（MOL000358）。人參（RS）重塑食管癌微環境相關靶點的有效成分有4 種，為：豆甾醇（MOL000449）、β-谷甾醇（MOL000358）、人參皂苷Rh2（MOL005344）、山奈酚（MOL000422）。白芍（BS）重塑食管癌微環境相關靶點的有效成分有3 種，為β-谷甾醇（MOL000358）、山奈酚（MOL000422）、芍藥苷（MOL001924），其中茯苓（FL）、白術（BZ）無對應有效成分。甘草（GC）為連線數量最多的節點，其主要有效成分如槲皮素、山奈酚可能是八珍湯重塑食管癌腫瘤微環境并影響食管癌預后的潛在成分，其中山奈酚也是人參和白芍的有效成分之一。

圖4 中藥-有效成分-靶點-疾病網絡圖

2.6 核心蛋白互作網絡及核心蛋白獲取見圖5。將八珍湯重塑食管癌腫瘤微環境的相關靶點導入STRING 11.5 數據庫，構建PPI 網絡，網絡中共有29 個節點，112 條邊。將PPI 網絡導入Cytoscape 3.9.1 軟件進行網絡拓撲分析，基于CytoHubba 插件計算評分。得到八珍湯重塑食管癌腫瘤微環境的核心靶點PPI 網絡。網絡展示前5 個核心靶點，分別為ICAM1、CCL2、CXCL10、STAT1、VCAM1。

圖5 八珍湯重塑食管癌腫瘤微環境核心靶點

2.7 GO 功能與KEGG 通路富集分析見圖6。為了揭示篩選出的八珍湯重塑食管癌腫瘤微環境相關基因在食管癌進展中的生物學意義，使用DAVID 網站對其31 個相關靶點進行GO 功能和KEGG 通路富集分析，FDR＜0.05 被認為具有統計學意義。GO 富集分析結果顯示八珍湯重塑食管癌腫瘤微環境相關基因主要涉及以下幾方面。①MF：相同蛋白質結合、趨化因子活性、CXCR 趨化因子受體結合；②BP：炎癥反應、細胞增殖的調控、類固醇代謝過程、血管生成的正負調節、趨化因子介導的信號通路、白細胞-細胞黏附、血液循環等生物學過程；③CC：受體復合物、質膜外側、細胞外空隙等細胞組分。KEGG 通路富集分析結果顯示共有靶點主要與趨化因子信號通路、TNF 信號通路、NF-κB 信號通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性等通路相關。根據富集結果可以推測出八珍湯可能通過趨化因子信號通路、TNF 信號通路、NF-κB 信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性等重塑食管癌腫瘤微環境從而影響腫瘤的增殖、凋亡、侵襲轉移、血管生成和耐藥等。

圖6 八珍湯重塑食管癌腫瘤微環境相關基因的GO 功能和KEGG 通路富集分析

2.8 分子對接見表1、圖7。為了更明確地探求八珍湯重塑食管癌腫瘤微環境的治療機制，將上述核心靶點ICAM1、CCL2、CXCL10、STAT1、VCAM1分別與各自對應的有效成分山奈酚、槲皮素進行分子對接。各有效成分與其對應靶點的結合自由能均小于-1.2 kcal/mol，提示對接結果良好，提示八珍湯有效成分與食管癌腫瘤微環境關鍵靶點有良好的結合作用。

表1 八珍湯有效成分與食管癌腫瘤微環境預后相關靶點對接結果

圖7 八珍湯有效成分與食管癌腫瘤微環境預后相關靶點分子對接構象圖

3 討論

氣血雙補之劑八珍湯在臨床上使用廣泛，其由健脾益氣作用的四君子湯和養血活血的四物湯組成，由此方為底加減化裁，對于腫瘤患者氣血兩虛證有良好的功效。食管癌患者由于其腫瘤部位以及腫瘤形成原因特殊，患者常常表現出消瘦、氣血不足的表現，大量研究以及臨床經驗表明八珍湯對改善食管癌患者生活質量具有重要作用[13-14]，但是其具體機制尚不清楚。隨著信息時代的發展，運用生物信息學和網絡藥理學相關技術能夠從大量數據中尋找藥物的有效成分和疾病作用靶點，從而探索藥物對疾病的藥理作用及其機制。分子對接技術已廣泛運用于藥物有效成分的篩選、發現藥物-靶點相互作用的機制。“種子與土壤”假說形象地揭示了癌癥的擴散和生長很依賴周圍的“微環境”。而中醫藥的優勢在于改善整個機體的微環境從而達到治療疾病的目的，不僅可以直接消滅致癌“種子”，還可以改善腫瘤生長依賴的“土壤環境”[15]。由于八珍湯治療腫瘤旨在改善腫瘤患者生活質量、延長其生存期，尚無研究證實八珍湯能夠直接殺滅腫瘤，說明八珍湯治療食管癌的機制主要在于重塑腫瘤生長的環境從而發揮治療作用，所以，本研究基于生物信息學和網絡藥理學研究方法旨在從腫瘤微環境層面探討八珍湯治療食管癌的作用機制，并結合分子對接技術科學實現藥物有效成分與靶點的有效銜接，進一步探索八珍湯重塑食管癌更微觀的分子機制。

本研究首先基于TCGA 食管癌患者臨床信息和表達譜數據分析得到與食管癌患者預后密切相關的基因，并通過與八珍湯有效成分靶點取交集獲得八珍湯潛在的作用靶點，并對這些靶點進行GO 和KEGG 富集分析。GO 富集分析結果顯示八珍湯調節食管癌腫瘤微環境的靶點主要富集于趨化因子活性、炎癥反應、細胞增殖、類固醇代謝、血管生成、細胞黏附、血液循環等方面。KEGG 通路富集分析結果顯示八珍湯調節食管癌腫瘤微環境的靶點主要與趨化因子信號通路、TNF 信號通路、NF-κB 信號通路等密切相關。研究表明趨化因子[16]、炎癥反應[17-18]、血管生成[19]、細胞黏附[20]等與食管癌的發生發展密切相關。眾多趨化因子被證明影響腫瘤侵襲轉移、血管生成、化學耐藥等。如干細胞自分泌CXC 基序趨化因子配體12（CXCL12）/CXC 基序趨化因子受體4（CXCR4）刺激食管癌侵襲轉移[21]；癌癥相關成纖維細胞的白細胞介素-6（IL-6）通過上調CXC基序趨化因子受體7（CXCR7）的表達，從而在化療耐藥中發揮最重要的作用[22]，CXC 基序趨化因子配體5（CXCL5）通過增強結直腸癌中AKT/NF-κB 通路介導的FOXD1 表達誘導腫瘤血管生成[23]。腫瘤壞死因子（TNF）是一種主要由活化的巨噬細胞產生能直接殺傷腫瘤細胞且對正常細胞無明顯細胞毒性的細胞因子，其介導的TNF 信號通路的激活可引發腫瘤細胞溶解或細胞死亡[24]。NF-κB 通路由經典和非經典通路組成。典型的NF-κB 調節各種促炎基因的表達，是炎癥反應的關鍵介質。非經典NF-κB 通路的激活通過少數TNF 受體超家族成員發生。失調的NF-κB活性會導致炎癥相關疾病和癌癥的發生[25]。總之，GO 和KEGG 富集分析的結果中相關通路和生物功能在腫瘤發生發展過程中起到重要作用。

同時，根據八珍湯重塑食管癌中的潛在靶點進行蛋白互作網絡構建，其中錯綜復雜的網絡關系根據連接的度值排序篩選得到的關鍵靶點主要有ICAM1、CCL2、CXCL10、STAT1、VCAM1。這5 個關鍵靶點通過調節腫瘤微環境中的免疫細胞或基質細胞功能發揮相應的功能。細胞間黏附分子1（ICAM1）編碼一種在內皮細胞和免疫系統細胞上表達的細胞表面糖蛋白，腫瘤細胞表達的ICAM1 可以通過促進腫瘤免疫細胞黏附相互作用或通過傳遞由外而內的信號來調節腫瘤細胞功能而影響腫瘤的發展[26]。同時ICAM1 引起T 細胞募集會損害浸潤性T 細胞的效應功能，從而使腫瘤細胞能夠逃避免疫識別和殺傷[27]。血管細胞黏附分子1（VCAM1）編碼一種由內皮細胞表達的細胞表面唾液酸糖蛋白。炎癥中由白細胞分泌的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）上調內皮細胞表面VCAM1 的表達，活化后的VCAM1 直接與白細胞上的α4β1 整合素相互作用反過來激活VCAM1 下游信號分子最終影響白細胞遷移。VCAM1 的表達影響白細胞的黏附功能進一步影響腫瘤血管生成和轉移[28]。研究表明，癌細胞上VCAM1 的表達影響微環境中播散性腫瘤細胞（DTC）和基質細胞之間的相互作用從而影響遠端器官的腫瘤定植[29]。可見VCAM1 在通過影響腫瘤微環境中免疫細胞的黏附功能進而影響腫瘤細胞的侵襲和轉移。CC 基序趨化因子配體2（CCL2）是一種蛋白質編碼基因。CCL2 是一種有效的單核細胞吸引趨化因子，基質細胞或腫瘤細胞產生的炎癥介質（如IL-1、IL-6、TNF-α 或轉化生長因子-β）可上調腫瘤微環境中腫瘤細胞產生的CCL2，從而刺激腫瘤細胞釋放促血管生成因子VEGF-A 而誘導腫瘤血管生成，同時由基質細胞而非腫瘤細胞產生的CCL2 能夠將巨噬細胞募集到乳腺癌組織中發揮抗腫瘤作用[30]。CCL2 可能具有促進腫瘤、抑制腫瘤的活性，或兩者兼而有之[31]。其具體作用還要視具體情況而定，總體來說，CCL2 能夠調節腫瘤微環境從而影響腫瘤的發生發展。研究表明CXCL10 有望成為治療自身免疫性疾病、癌癥等的有效靶點，成為關鍵驅動趨化因子[32]。趨化因子是一類具有誘導趨化性、促進免疫細胞分化和引起組織外滲作用的蛋白質。鑒于這些特性，它們在腫瘤微環境中的作用非常重要。趨化因子CXCL9、CXCL10 以及CXCL11/CXCR3軸調節免疫細胞遷移、分化和激活，從而抑制腫瘤生長[32]。因此，趨化因子相關信號軸在調節腫瘤微環境、影響腫瘤細胞生長和轉移方面具有重要作用。STAT1 是干擾素（IFN）信號傳導的重要組成部分，主要參與細胞凋亡、細胞周期和上皮間充質轉化（EMT）[33]，研究表明，STAT1 能夠增強頭頸部鱗癌腫瘤微環境中的T 細胞抗腫瘤免疫力[34]，故激活STAT1 在癌細胞中起到抑癌作用。然而，STAT1 在特定條件下也發揮腫瘤促進作用[35]。研究表明，在人乳腺癌細胞中單獨抑制STAT1 和STAT3 激活能部分下調PD-L1，而聯合抑制則完全下調PD-L1 表達[36]。說明STAT1 可以通過調節腫瘤免疫微環境中免疫細胞和腫瘤細胞上某些蛋白的表達影響腫瘤的發生發展。

根據富集結果可以推測出八珍湯可能通過靶向ICAM1、CCL2、CXCL10、STAT1、VCAM1 激活趨化因子信號通路、TNF 信號通路、NF-κB 信號通路等重塑食管癌的腫瘤微環境，從而影響食管癌增殖、凋亡、遷移、血管生成。研究表明食管鱗狀細胞癌中的STAT1 信號下調了具有致癌潛力的NF-κB 和STAT3 的表達或活性[37]，同時STAT1 可以通過下調TNF-α 來阻斷NF-κB[37]。李閃閃等[38]通過查閱大量文獻發現，中藥可以通過調控PI3K/Akt、Wnt/βcatenin、MAPK、Notch、NF-κB、JAK2/STAT3 等多個信號通路治療食管癌。所以，富集分析的結果對于后續食管癌治療靶點和分子機制研究具有一定指導意義。Chen X M 等[39]的研究表明藏紅花的提取物羥基紅花黃色素A 可抑制ICAM1、MMP9、TNF-α和VCAM1 的表達，從而調節NF-κB 信號通路抑制食管癌細胞的惡性發展。說明基于中藥單個成分的分子機制研究有助于闡釋中藥的藥理作用機制。故本研究通過分子對接技術證實八珍湯部分有效成分確實能夠靶向食管癌腫瘤微環境預后相關靶點。同時已有大量研究證實八珍湯的有效成分槲皮素[40-41]、山奈酚[42]能夠抑制食管癌細胞的增殖、侵襲和血管生成。故基于八珍湯有效成分和食管癌腫瘤微環境相關靶點之間相互作用的分子機制的探索，有助于闡釋八珍湯治療食管癌的腫瘤微環境相關分子機制。由于中藥具有多成分、多靶點的特點，且腫瘤微環境也是復雜多變的腫瘤生態環境，故探索中藥治療腫瘤的分子機制從腫瘤微環境預后相關基因進行探索，更能從整體闡釋中藥抗腫瘤的作用機制，而不是局限于單純殺滅腫瘤。

綜上所述，本研究為探索八珍湯干預食管癌腫瘤微環境的靶點和機制，采用綜合生物信息學和網絡藥理學以及分子對接的方法進行研究，不僅為臨床應用八珍湯治療食管癌提供相應的理論基礎，還為進一步深入機制研究提供參考。本研究篩選出5 個具有重要意義的靶基因作為后續實驗研究的候選基因，即ICAM1、CCL2、CXCL10、STAT1、VCAM1。同時通過大量參考文獻也證實這些基因在調節腫瘤微環境方面具有重要意義，所以有希望成為八珍湯調節食管癌腫瘤微環境的作用靶點。