四神丸加減方對潰瘍性結腸炎模型小鼠結腸組織白細胞介素-6、白細胞介素-10及TLR4/NF-κB信號通路的影響

馮時茵，曲新艷，饒秋紅，戚揚，廖小紅，丘振文，陳斌

1. 廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東 廣州 510405 2. 齊魯工業大學（山東省科學院），山東省分析測試中心，山東 濟南 250014

潰瘍性結腸炎（UC）是常見消化系統疑難病，病理變化呈慢性炎癥反應，可累及直腸、結腸，具體病因尚未明確，一般認為與多種遺傳及環境因素關系密切，臨床以反復發作、病情遷延為特點[1]。西醫針對UC 主要以藥物治療為主，一線藥物主要包括氨基水楊酸類、皮質類固醇、免疫抑制劑等。其中氨基水楊酸類藥物的緩解率約為50%，可緩解輕、中度活動期UC 患者癥狀；而皮質類固醇和免疫抑制劑治療存在服藥周期長、毒副作用大、病情易復發、診療費用高等諸多不足，使臨床治療受到極大限制[2-3]。因此，尋找安全有效、副作用小的UC 治療方案迫在眉睫。近年來有研究表明，中醫藥治療UC 療效明確，能有效預防復發，且副作用少[4-7]。臨床上以四神丸加減方治療脾腎陽虛型UC 療效顯著，但具體治療機制尚不明確。本研究采用葡聚糖硫酸鈉（DSS）構建小鼠UC 模型，探討四神丸加減方治療UC 的療效機制。結果報道如下。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物健康雌性C57BL/6 小鼠，SPF 級，7～8 周，共30 只，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2021-0011。

1.2 主要試劑及儀器DSS 購自MP Biomedicals 公司；美沙拉嗪腸溶片（Losan Pharma GmbH 公司，國藥準字號H20171358，規格：500 mg/粒）；酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（Thermo Fisher Scientific）；Toll 樣受體4（TLR4）、p65 分子量、磷酸化P65（pp65）和β-actin 抗體購于Cell Signaling Technology公司。

2 研究方法

2.1 造模方法以7～8 周齡雌性C57BL/6 小鼠為實驗對象，在適應性喂養7 d 后，小鼠自由飲用無菌水配置的2.5% DSS 溶液，連續7 d（每3 d 更換DSS 溶液1 次）[8]。

2.2 藥液制備四神丸加減處方：黃芪、白術各20 g，補骨脂、肉豆蔻、土茯苓各15 g，五味子、烏梅、淡附子、川芎、當歸、麩炒枳殼各10 g，黃連6 g，吳茱萸5 g。取中藥飲片總質量的10 倍水浸泡藥材60 min，大火煮沸后改為文火保持沸騰狀態煮50 min，濾取煎液，然后再加中藥飲片總量的8 倍量水，大火煮沸后改為文火保持沸騰狀態煮30 min，濾取煎液，合并2 次煎液，并將其加熱濃縮至含生藥2 g/mL的藥液，冷卻后于4 ℃儲存，使用時按照各組給藥劑量進行稀釋。

2.3 給藥方法將30 只小鼠隨機分為正常組、模型組、陽性對照組、四神丸加減方高劑量組（簡稱高劑量組）和四神丸加減方低劑量組（簡稱低劑量組）各6 只，陽性對照組以美沙拉嗪腸溶片按照400 mg/kg劑量灌胃，四神丸加減方2 個劑量組分別按照400、200 mg/kg 劑量灌胃，正常組和模型組予等體積無菌水灌胃，均給藥7 d。其中，模型組、陽性對照組、高劑量組和低劑量組都給予2.5%的DSS 進行造模，正常組小鼠飲用常規飲用水。

3 觀察指標與統計學方法

3.1 觀察指標①小鼠疾病活動指數（DAI）。自造模第1 天起，每天觀察小鼠精神狀態并稱重；在實驗結束后根據體質量、大便性狀、大便隱血/肉眼血便的評分（評分標準見表1）計算DAI，DAI=體質量下降評分+糞便黏稠度評分+便血評分。②小鼠結腸長度。實驗結束后，收集各組小鼠結腸組織并對其長度進行測量記錄。③結腸組織病理學變化。實驗結束后，截取小鼠近端結腸，于4%中性甲醛溶液中固定24 h 以上，用石蠟包埋，切成5 μm 的連續切片，然后進行脫蠟處理，再進行蘇木精-伊紅染色法（HE）染色，顯微鏡下觀察小鼠結腸組織病理變化情況。④結腸組織炎癥因子表達。收集各組小鼠結腸組織，并將結腸組織和磷酸鹽緩沖液按照1∶20 的比例進行研磨、離心，取上清液，按照ELISA 試劑盒說明書檢測結腸組織研磨液中白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-10（IL-10）的表達水平。⑤結腸組織中TLR4、p65 和p-p65、β-actin 蛋白表達。提取各組小鼠結腸總蛋白，進行蛋白定量和變性后，按照每孔30 μg 的標準上樣，之后進行電泳和轉膜，分別孵育一抗和二抗，顯色后將載有目的蛋白的聚偏二氟乙烯膜置于化學發光系統中，檢測TLR4、p65 和p-p65 等蛋白表達水平，以β-actin 作為內參蛋白。

表1 小鼠體質量下降、大便性狀和便血評分標準

3.2 統計學方法所有數據采用GraphPad Prism 軟件進行處理。計量資料符合正態分布者采用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差。P＜0.05 為差異有統計學意義。

4 研究結果

4.1 5 組小鼠DAI 評分比較見表2。實驗結束后，模型組小鼠DAI 評分較正常組顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組和高劑量組小鼠DAI 評分結果均顯著下降（P＜0.05），而低劑量組小鼠DAI 評分無明顯變化（P＞0.05）。

表2 5 組小鼠DAI 評分比較（±s）分

表2 5 組小鼠DAI 評分比較（±s）分

注：①與正常組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05

DAI 0.0±0.0 9.9±0.7①7.1±0.9②6.7±2.1②9.4±1.9組 別正常組模型組陽性對照組高劑量組低劑量組鼠數66666

4.2 5 組小鼠UC 嚴重程度比較見表3。實驗結束后，模型組小鼠結腸長度較正常組縮短（P＜0.05）、糞便黏稠度及便血評分升高（P＜0.05）。與模型組比較，高劑量組小鼠結腸長度明顯增加（P＜0.05），而陽性對照組、低劑量組小鼠結腸長度略有增加，但差異無統計學意義（P＞0.05）；陽性對照組及高、低劑量組小鼠糞便黏稠度評分均明顯降低（P＜0.05）；陽性對照組及高、低劑量組小鼠便血評分無明顯變化（P＞0.05）。

表3 5 組小鼠UC 嚴重程度比較（±s）

表3 5 組小鼠UC 嚴重程度比較（±s）

注：①與正常組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05

便血評分（分）0.0±0.0 2.1±0.4①1.9±0.7 2.0±0.6 2.9±0.4組 別正常組模型組陽性對照組高劑量組低劑量組鼠數66666結腸長度（cm）7.0±0.5 5.1±0.5①5.4±0.4 6.0±0.8②5.2±0.7糞便黏稠度評分（分）0.0±0.0 4.0±0.0①2.0±0.0②2.4±0.5②3.0±1.0②

4.3 5 組小鼠結腸組織病理結果比較見圖1。與正常組比較，模型組小鼠結腸組織中杯狀細胞明顯減少，隱窩結構損傷嚴重，出現明顯的炎癥浸潤。與模型組比較，陽性對照組、高劑量組小鼠結腸組織中杯狀細胞增多，隱窩結構損傷減少，炎癥浸潤程度明顯改善；而低劑量組上述病理變化略有改善。

4.4 5 組結腸組織中IL-6、IL-10 表達水平比較見表4。實驗結束后，模型組小鼠結腸組織中IL-6水平較正常組顯著升高（P＜0.05），IL-10 水平較正常組顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，高劑量組IL-6 水平顯著降低（P＜0.05），陽性對照組及低劑量組IL-6 水平下降不明顯（P＞0.05）；高、低劑量組IL-10 水平顯著升高（P＜0.05），陽性對照組IL-10水平升高不明顯（P＞0.05）。

表4 各組小鼠結腸組織IL-6、IL-10 水平比較（±s） pg/mL

表4 各組小鼠結腸組織IL-6、IL-10 水平比較（±s） pg/mL

注：①與正常組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05

IL-10 50 242.0±7 227.0 5 645.0±1 583.0①8 078.0±1 774.0 22 267.0±6 792.0②14 275.0±2 731.0②組 別正常組模型組陽性對照組高劑量組低劑量組鼠數66666 IL-6 2 227.0±587.7 10 439.0±2 817.0①7 215.0±2 261.0 3 120.0±879.6②9 791.0±3 295.0

4.5 5 組結腸組織TLR4、p65 和p-p65 蛋白表達水平比較見圖2、表5。與正常組比較，模型組小鼠結腸組織中TLR4、p65 和p-p65 表達水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組及高、低劑量組小鼠結腸組織中TLR4、p65 和p-p65 的表達水平均明顯降低（P＜0.05）。

圖2 5 組結腸組織TLR4、p65、p-p65、β-actin 蛋白表達

表5 5 組小鼠結腸組織TLR4、p65、p-p65蛋白相對表達水平比較（±s）

表5 5 組小鼠結腸組織TLR4、p65、p-p65蛋白相對表達水平比較（±s）

注：①與正常組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05

p-p65 0.3±0.0 1.0±0.0①0.9±0.0②0.9±0.0②0.9±0.0②組 別正常組模型組陽性對照組高劑量組低劑量組鼠數66666 TLR4 0.4±0.0 1.0±0.0①0.9±0.0②0.8±0.0②0.7±0.0②p65 0.6±0.0 1.4±0.0①1.1±0.0②0.9±0.0②1.0±0.4②

5 討論

UC 是一種原因尚不完全明確的慢性非特異性大腸炎癥性疾病，病變主要限于直腸和結腸的黏膜層及黏膜下層，通常以腹痛腹瀉、膿血便、里急后重為主要臨床癥狀，該病病程綿延難愈，易反復發作，對患者的生活質量造成了嚴重影響。近年來，我國UC 發病率明顯增高，其中北方地區發病率為1.64/10 萬，南方地區發病率為2.05/10 萬[9-10]?，F代醫學一般采用口服氨基水楊酸類、糖皮質激素、免疫抑制劑等藥物治療UC，如病灶在結腸遠端可給予保留灌腸或者肛門給藥的方式，使藥物在腸道內長時間緩慢吸收。在藥物治療效果不佳且出現腸道穿孔、出血、惡變等情況下可以考慮外科治療，但也無法完全控制病情發展，故UC 已被世界衛生組織列為當代難治性疾病之一。

中醫學古籍中并無UC 對應的病名，按其癥狀表現可歸屬于中醫學腸澼、便血、腸風下血、痢疾、泄瀉、滯下、腹痛、臟毒、久痢等范疇。中醫學認為，此病與勞逸不當、外感時邪、濕熱內蘊、七情內傷、飲食不節等多種因素有關，多由于飲食不節、情志內傷、勞倦過度、脾腎陽虛、感受濕邪等所致[11]。而脾腎陽虛是UC 常見證型之一，主要是因為病程漫長、反復難愈，脾氣不升、中氣下陷，損傷脾陽，累及腎陽，最終導致脾腎陽虛。UC 為本虛標實之證，其中活動期以標實為主，多為濕熱血瘀；緩解期以本虛為主，多表現為脾陽虛，也有兼腎陽不足的情況。筆者通過對相關的文獻梳理與數據統計分析，分析古今醫家對UC 病因病機的理論認識，結合廣州中醫藥大學第一附屬醫院脾胃病名家經驗[12-13]，同時通過綜合專家經驗辨證，提取證候要素，總結該病常見證候及證候要素分布的特點[14-15]，皆發現脾腎陽虛證為慢性UC 的重要證型。四神丸是中醫治療脾腎陽虛型泄瀉的代表方劑，故本研究選用四神丸加減方作為觀察方劑進行研究。

四神丸加減方方中補骨脂補腎壯陽，溫脾止瀉；肉豆蔻溫中澀腸，主虛瀉冷痢；吳茱萸溫中助陽，專治臟寒泄瀉。三者為君藥，共奏溫脾腎陽、澀腸止瀉之功。五味子、烏梅皆性酸，五味子收斂固澀，烏梅收澀止??；附子振奮腎陽，溫暖脾土；三者共為臣藥，以助君藥溫陽收澀。黃芪、白術益氣扶正，利水除濕；川芎、當歸行氣活血；土茯苓解毒祛濕，黃連解毒清熱，六者佐治兼證，有益氣活血、解毒清熱、除濕止瀉之功。炒枳殼行氣導滯，調和諸藥，為使藥。本研究所用加減方在四神丸溫腎散寒的基礎上加入澀腸止瀉、益氣活血、清熱利濕解毒之品組成，寒溫并用，共奏祛邪扶正、氣血雙調、澀腸止痢之功。

本研究采用DSS 構建小鼠UC 模型，評估四神丸加減方緩解UC 的效果及其機制。研究發現，高劑量組小鼠DAI 均顯著下降；高劑量組能顯著減輕小鼠結腸長度縮短及腹瀉情況，低劑量組也可改善小鼠腹瀉情況。杯狀細胞減少、隱窩結構喪失和炎性細胞浸潤增加是DSS 引起的結腸損傷結果[16]，本研究結果顯示，高劑量組可明顯改善小鼠結腸組織的杯狀細胞減少、隱窩結構損傷及炎癥浸潤情況；低劑量組對小鼠結腸組織的腺體損傷的炎癥浸潤情況稍有改善。作為腸道炎癥的重要指標，促炎細胞因子IL-6 在UC 誘導后顯著增加，而IL-10 在抑制腸道炎癥中發揮重要作用[17-18]。本研究結果顯示，高劑量組小鼠結腸組織中IL-6 表達水平出現顯著下降，而高、低劑量組均可明顯提高小鼠結腸組織中的IL-10的表達水平。

TLR4/NF-κB 信號通路的激活可增加促炎細胞因子的表達，在炎癥反應過程中具有重要作用。作為TLR4/NF-κB 信號通路的效應蛋白，正常情況下p65和p52 蛋白、IκB 在胞質中形成穩定的復合體，TLR4 被配體激活后，其胞內結構域招募MyD88，磷酸化IκB 激酶（IKK），磷酸化的IKK 進一步激活IκB，激活后的IκB 會釋放復合體中的p65 并將其磷酸化，磷酸化后p65 進入細胞核發揮轉錄作用。同時，IκB 也可以進入細胞核，競爭性抑制p-p65 的轉錄活性，所以細胞中p65 的增多可以在胞質中與IκB結合，減少IκB 的入核，同時可以生成更多的p-p65進入細胞核，發揮轉錄活性，加劇炎癥反應[19]。而本實驗結果顯示，高劑量組小鼠結腸組織中TLR4、p65 和p-p65 表達水平均降低，從而減輕機體炎癥反應。以上研究不僅揭示了四神丸加減方的療效及其作用機制，也為闡釋中醫藥療效內涵提供有益借鑒。