雅解益栽(心)方對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的大鼠脂代謝和氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)作用研究

駱始華 李 易 趙麗娟 陶希睿 劉中勇 段小花 張 超*

1.云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650000；2.云南省中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650000；3.《中國民族民間醫(yī)藥》雜志社，云南 昆明 650021；4.江西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江西 南昌 3300043

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是冠心病、腦血管病和血栓栓塞性疾病等缺血性心腦血管病的主要病理基礎(chǔ)[1]。而其所引起的心血管疾病(cardio vascular disease，CVD)已經(jīng)成為威脅人類健康的首要死因。動(dòng)脈粥樣硬化是心血管病中最主要的一種，其典型的病變特征是脂質(zhì)、炎癥細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和壞死細(xì)胞碎片在血管內(nèi)壁單層內(nèi)皮細(xì)胞下方的內(nèi)膜腔內(nèi)終生積累和轉(zhuǎn)化。AS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前較一致的看法是因脂質(zhì)代謝紊亂、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、氧化應(yīng)激等多機(jī)制相互作用的結(jié)果，其發(fā)病過程十分復(fù)雜；在過去的幾十年里，廣泛的研究試圖揭示疾病背后的發(fā)病機(jī)制因此，積極尋找有效防治AS的策略，對(duì)于降低CVD的發(fā)病率和死亡率具有十分重要的科學(xué)意義[2]。西醫(yī)學(xué)針對(duì)AS及易損斑塊的治療手段主要有他汀類藥物和介入治療。介入治療雖可改善血管狹窄，但介入后再狹窄及對(duì)沒有從根本上解決血管斑塊的生物學(xué)特性；他汀類藥物可降脂、逆轉(zhuǎn)斑塊形成、抑制炎癥從而降低心腦血管事件，但其可導(dǎo)致肝腎損傷、橫紋肌溶解、肌痛及認(rèn)知能力降低等副作用。而中醫(yī)藥在防治AS療效確切，其抗AS機(jī)制具有多角度、多靶點(diǎn)干預(yù)的優(yōu)勢(shì)有望在一定程度上穩(wěn)定斑塊、減少心腦血管事件的發(fā)生。

雅解益栽(心)方(以下簡(jiǎn)稱YJYXF)是從傣醫(yī)臨床文獻(xiàn)資料中收集整理的民族有效驗(yàn)方，傣醫(yī)本科教材《傣醫(yī)臨床學(xué)》中將“食物毒”定義為：“食物毒”是指因過食導(dǎo)致“四塔”“五蘊(yùn)”的失衡，毒邪內(nèi)蘊(yùn)，內(nèi)傷臟腑而發(fā)病。臨床表現(xiàn)包括全身癥狀等，如循環(huán)系統(tǒng)表現(xiàn)為心慌、心悸、胸痛等癥，還可以表現(xiàn)為下肢紫紺、壞疽等癥。“雅解益栽(心)方”具有調(diào)節(jié)體內(nèi)“四塔、五蘊(yùn)”功能，解除人體毒素，保護(hù)臟腑功能的解毒方。YJYXF的藥物中的藥物組成，即雅解先打(傣百解)、文尚海(百樣解)性涼，入風(fēng)、火、水、土塔，調(diào)四塔，解酒毒、熱毒和其他毒，護(hù)臟腑為主藥；全方合用具有調(diào)補(bǔ)四塔、清火解毒之作用，可達(dá)調(diào)補(bǔ)氣血，解熱毒、酒毒、食物中毒及保護(hù)心肝腎之目的[3]。本研究從傣醫(yī)的“雅解”理論出發(fā)，通過高脂飼料建立動(dòng)脈粥樣硬化模型來模仿傣醫(yī)學(xué)“食物毒”的模型，觀察雅解益栽(心)方對(duì)AS大鼠脂代謝、氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的影響探討解食物毒可能是通過減輕氧化應(yīng)激損傷，減輕炎癥反應(yīng)，從而具有抗AS功效，可能是其抗AS穩(wěn)定易損斑塊的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠43只，體質(zhì)量(200±20)g，(由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供)合格證號(hào)：SCK(川)SCXK(川)2015-030。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。高脂飼料配方：2%膽固醇+0.5%膽酸鈉+3%豬油+0.2%丙硫氧嘧啶+94.3%+維生素D3粉劑(1.25×106IU/kg)喂養(yǎng)。

1.2 主要儀器 InfiniteM200PRO酶標(biāo)儀：瑞士Tecan公司；LG10-2.4A高速離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠；HW-80A旋渦混合器：上海精科實(shí)業(yè)有限公司。電子分析天平，PrecisaXS125A；LG10-2.4A高速離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；微量移液器美國ThermoElectron公司。

1.3 藥物與試劑 (YJYXF)的制備：解先打(傣百解)20 g，文尚海(百樣解)20 g，嘿濤罕(大黃藤)15 g，毫命(姜黃)15 g，蟑螂15 g，咪多領(lǐng)15 g，鄧嘿罕(定心藤)15 g，賓蒿(白花臭牡丹)15 g，帕蚌板(三七)5 g，奶子藤10 g，合罕郎跌打(葛根)20 g，管底(三葉蔓荊)10 g，芽害補(bǔ)(野甘草)10 g；將方藥用水煎煮、共煎兩次，兩次水煎液混合后濃縮成稠浸膏至含生藥2.4 g/mL，置于-18℃冰箱冷藏備用。辛伐他汀鈣片(北京雙鷺?biāo)幱邢薰荆?hào)：20181215，規(guī)格：10 mg/片)；血脂試劑盒：[總膽固醇(TC)試劑盒(批號(hào)：F006-1-1)、甘油三酯(TG)試劑盒(批號(hào)：A110-2-1)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒(批號(hào)：A113-2-1)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒(批號(hào)：A112-2-1)(南京建成生物工程研究所有限公司)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒(批號(hào)：H052-1)、白介素-6(IL-6)試劑盒(批號(hào)：H007-1-1)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號(hào)：A001-3-2)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(批號(hào)：A005-1-2)、丙二醛(MDA)試劑盒(批號(hào)：A003-1-2)、過氧化氨酶(CAT)試劑盒(批號(hào)：A007-1-1)。

1.4 造模與分組 選用清潔級(jí)SD大鼠，雌雄各半，體重(200±10)g。清潔級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，恒溫，恒濕，自由飲水，飼固體飼料。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，開始試驗(yàn)。采用腹腔注射VD3+高脂飼料(高脂飼料配方：2%膽固醇+0.5%膽酸鈉+3%豬油+0.2%丙硫氧嘧啶+94.3%維生素D3粉劑(1.25×106IU/kg)喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)開始時(shí)于右下肢肌內(nèi)注射維生素D3(3×105IU/kg)針劑，每30 d重復(fù)1次)喂養(yǎng)9周建立大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型建立食物毒致AS動(dòng)物模型，隨機(jī)分5組，每組10只。對(duì)照組：Normal；模型組：Normal+腹腔注射VD3+高脂飼料；辛伐他汀組：Normal+腹腔注射VD3+高脂飼料+辛伐他汀(4 mg/kg/d)干預(yù)4周；雅解益栽(心)方高劑量組：Normal+腹腔注射VD3+高脂飼料+雅解益栽(心)方(1.4 mg/kg/d)干預(yù)9周；雅解益栽(心)方低劑量組：Normal+腹腔注射VD3+高脂飼料+雅解益栽(心)方(0.35 mg/kg/d)干預(yù)9周。

1.5 觀察指標(biāo) 血清指標(biāo)：測(cè)定血清中甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)的含量，各組主動(dòng)脈組織中谷胱甘肽-過氧化物酶(GSH-PX)、過氧化氨酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性及丙二醛(MDA)的含量；測(cè)定大鼠血清炎癥因子IL-6、TNF-α含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)，采取方差分析。

2 結(jié)果

一般情況各組大鼠體重均明顯增加，其中以模型對(duì)照組最為明顯。YJYXF高劑量組大鼠性情較溫順，精神狀態(tài)好，毛色光澤，體態(tài)勻稱，進(jìn)食水及排尿便正常。模型對(duì)照組、低劑量組、辛伐他汀組大鼠性情較暴躁，易撕咬，體態(tài)肥胖，便溏，多數(shù)大鼠精神不同程度萎靡，運(yùn)動(dòng)有所減少，皮毛蓬松而無光澤，其中又以模型對(duì)照組更為突出，排便相當(dāng)。

2.1 雅解益栽(心)方對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠脂代謝的影響 結(jié)果表明(見表1和如圖2所示)，與正常組比較，模型組血清TG、大鼠LDL含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，HDL含量無明顯變化(P>0.05)，提示動(dòng)模型建立成功。與模型組比較，YJYXF高低劑量組血清中TG、大鼠LDL含量減少，HDL含量增加，二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。與陽性藥物組比較，高劑量血清TG、HDL含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.01)。表明YJYXF能改善大鼠血脂，在降低TG、升高HDL方面具有優(yōu)勢(shì)。詳見表1。

表1 各組血清中TG、LDL-C、HDL-C水平比較

2.2 雅解益栽(心)方對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠抗氧化的影響 雅解益栽(心)方對(duì)大鼠血清GSH-Px、SOD和CAT的活性及MDA含量的影響見表2：與空白對(duì)照組相比，模型組大鼠血清 SOD、CAT、GSH-PX活性降低，MDA 含量升高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，YJYXF高、低劑量組均能升高 GSH-PX、SOD、CAT 活性，降低 MDA 的含量，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

表2 各組主動(dòng)脈組織中GSH-PX、CAT、SOD、MDA的含量水平比較

2.3 雅解益栽(心)方對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠血清炎癥因子IL-6和TNF-α含量的影響 對(duì)AS大鼠血清TNF-α、IL-6的影響見表3：與正常組比較，模型對(duì)照組動(dòng)物血清TNF-α、IL-6含量均顯著升高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，YJYXF高劑量組、YJYXF低劑量組與辛伐他汀組TNF-α、IL-6含量均顯著下降，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

表3 表3 各組鼠血清炎癥因子IL-6和TNF-α含量比較

3 討論

傣醫(yī)學(xué)是傣族人民在兩千多年的生活和醫(yī)療實(shí)踐中形成的以“四塔”“五蘊(yùn)”為基礎(chǔ)理論的核心，“三盤”學(xué)說、“雅解”學(xué)說為理論特色的一門醫(yī)學(xué)學(xué)科。其中，傣醫(yī)“雅解”理論最具特色，其核心內(nèi)容包括“未病先解，先解后治，同解同治”及系列“雅解”方藥，而解“食物毒”是“雅解”理論的重要組成部分?！把沤狻睘榇稣Z，意譯為解藥，指能解除體內(nèi)各種毒素，平衡和協(xié)調(diào)“四塔五蘊(yùn)”以及臟腑功能的一類傣醫(yī)方藥的統(tǒng)稱。傣醫(yī)解“食物毒”歷史悠久，傣醫(yī)藥經(jīng)書和文獻(xiàn)中均有記述。如醫(yī)祖龔麻臘別用文尚海(百樣解)解“食物毒”；《阿皮踏麻基干比》《羅格牙坦》《檔哈雅龍》等傣族醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)記載醫(yī)學(xué)大師臘西達(dá)菲創(chuàng)立“雅給”方解“食物毒”；傣醫(yī)學(xué)[4- 5]認(rèn)為，人過食膏粱厚味，盡管它們是人體所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但過量對(duì)人體而言卻是一種毒，這種毒傣醫(yī)學(xué)認(rèn)為是來自于過食食物所產(chǎn)生的毒稱為“食物毒”(故采用腹腔注射VD3+高脂飼料喂養(yǎng)建立大鼠動(dòng)AS模型模仿人過食過食食物而產(chǎn)生的毒)，其可導(dǎo)致機(jī)體臟腑功能代謝失調(diào)進(jìn)而內(nèi)生毒素，在幾千年前的傣醫(yī)經(jīng)書《嘎牙山哈雅》(人體解說)一書中即有記載，說明傣醫(yī)學(xué)對(duì)臟腑及其功能很早就有了較全面的認(rèn)識(shí)。根據(jù)書中所述，食物所產(chǎn)生的毒能導(dǎo)致體內(nèi)“四塔五蘊(yùn)”功能失調(diào)而發(fā)病，傣醫(yī)學(xué)中沒有“動(dòng)脈粥樣硬化”的病名，但從病因病理和患者的癥狀方面來看，動(dòng)脈粥樣硬化可歸屬于傣醫(yī)的心慌、心悸、胸痛，傣醫(yī)認(rèn)為心慌、心悸、胸痛是由于體內(nèi)塔攏(風(fēng)、氣)不行，留滯胸中，則血運(yùn)不通，不通則痛；或感受外在的帕雅攏(風(fēng)邪)，病邪入心，阻滯血脈運(yùn)行而致。在治療上，其病位在中上盤，應(yīng)以先解后治，先服解藥，再按上病治上，中病治中的原則分別治以調(diào)補(bǔ)中上盤火，除風(fēng)通氣，活血止痛，補(bǔ)火溫心，除風(fēng)止痛和補(bǔ)水清火，養(yǎng)心止痛。

傣醫(yī)學(xué)認(rèn)為當(dāng)人體發(fā)病后應(yīng)先服用“解藥”，以解除過食食物產(chǎn)生的毒副作用，從而調(diào)節(jié)人體生理功能，保持體內(nèi)“四塔”(風(fēng)、火、水、土)、“五蘊(yùn)”(色、識(shí)、受、想、行)功能的平衡和協(xié)調(diào)[6]。“雅解益栽(心)方”是從傣醫(yī)臨床文獻(xiàn)資料中收集整理的民族有效驗(yàn)方，該方是具有調(diào)節(jié)體內(nèi)四塔、五蘊(yùn)功能，解除人體毒素，保護(hù)臟腑功能的解毒方[3]。“雅解益栽(心)方”的藥物組成中，雅解先打(傣百解)、文尚海(百樣解)性涼，入風(fēng)、火、水、土塔，調(diào)四塔，解酒毒、熱毒和其他毒，護(hù)臟腑為主藥；嘿濤罕(大黃藤)性寒涼，入四塔，有調(diào)四塔，解百毒之作用；蟑螂味咸，入土、水塔，有解毒健脾之功；咪多領(lǐng)性溫，補(bǔ)火塔，理氣止痛；毫命(姜黃)味苦、微辣，有臭氣，性平偏熱，入水、土、風(fēng)塔，具活血止痛，清火解毒之功；管底(三葉蔓荊)根味苦、性涼，入風(fēng)、水、土塔，清火解毒，治瘡癤腫痛等[7-8]。全方合用具有調(diào)補(bǔ)四塔、清火解毒之作用，可達(dá)調(diào)補(bǔ)氣血，解熱毒、酒毒、食物中毒及保護(hù)心肝腎之目的?，F(xiàn)代研究[9]表明咪多領(lǐng)具有對(duì)傷寒桿菌等較強(qiáng)抗菌作用；蟑螂能在一定程度上調(diào)節(jié)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎腸道菌群大鼠腸道微生態(tài)環(huán)境，平衡腸道菌群[10]。前期研究[11-12]表明雅解益栽(心)方對(duì)乙硫氨酸引起的小鼠肝臟脂肪蓄積有一定的預(yù)防作用，能抑制肝脂中總膽固醇的升高及肝指數(shù)的升高，表明其對(duì)脂肪輸出障礙(脂肪代謝紊亂型脂肪肝)有一定的療效；對(duì)外源性脂質(zhì)顯著增加所致的脂肪肝有一定的預(yù)防作用。該實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射VD3+高脂飼料喂養(yǎng)建立大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型模仿人過食食物而產(chǎn)生的毒(食物毒)，其可導(dǎo)致機(jī)體臟腑功能代謝失調(diào)進(jìn)而內(nèi)生毒素，造模后大鼠血脂水平明顯升高。

機(jī)體的自由基氧化作用與抗氧化防御作用處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，平衡狀態(tài)被打破時(shí)就產(chǎn)生了自由基。當(dāng)自由基的活動(dòng)超過一定量，就會(huì)發(fā)生疾病。機(jī)體抗氧化酶促系統(tǒng)包括SOD、 GSH-Px、 CAT等。 SOD是酶促防御系的一種重要的氧自由基清除劑，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。CAT是催化過氧化氫分解成氧和水的酶，過氧化氫它能夠?qū)C(jī)體造成損害。GSH-Px是一種重要的過氧化物分解酶，主要清除過氧化氫等自由基，防止脂質(zhì)過氧化物的生成，起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整性的作用。MDA是脂質(zhì)過氧化降解的中間產(chǎn)物，其含量可以反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，反映細(xì)胞的受損程度。

本研究中YJYXF干預(yù)后能顯著改善血清中TG、LDL-C、和HDL-C的含量，即YJYXF能夠有效改善模型大鼠的脂質(zhì)代謝水平。給予大鼠高脂飲食聯(lián)合維生素D3可導(dǎo)致大鼠內(nèi)皮細(xì)胞抗氧化能力下降，血清MDA含量增加、GSH-Px、CAT、SOD活性降低，自由基產(chǎn)生和清除的平衡被破壞，脂質(zhì)過氧化作用增強(qiáng)，促使形成AS，而MDA、GSH-Px、CAT和SOD是氧化應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志物之一，能夠反映機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)[13]。YJYXF各劑量組與模型組相比能夠有效降低MDA的含量，提升GSH-Px、CAT、SOD的活性，表明YJYXF能夠在AS中抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)。

高水平IL-6都是影響斑塊性質(zhì)穩(wěn)定性的重要生物學(xué)指標(biāo)。TNF-α可以激活炎癥通路而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷，進(jìn)一步加重AS[13]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6的表達(dá)水平明顯升高，提示TNF-α、IL-6炎性因子在其中起到重要作用。YJYXF干預(yù)后，大鼠血清中的IL-6和TNF-α炎性細(xì)胞因子水平與辛伐他汀類似，YJYXF各劑量組均可抑制炎性因子的表達(dá)，表明YJYXF對(duì)大鼠AS炎性反應(yīng)具有一定的緩解作用。

綜上所述，YJYXF能通過調(diào)節(jié)模型大鼠的脂質(zhì)代謝水平，降低炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激來升高AS大鼠的抗AS能力，降低動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化損傷，可改善炎癥反應(yīng)、主動(dòng)脈病變和穩(wěn)定斑塊，對(duì)大鼠AS具有明顯的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過降低動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化損傷，減輕炎癥反應(yīng)來解食物毒，從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程。