羊肚菌2 種病害病原菌的分離與鑒定*

高章會，華 蓉，孫達(dá)鋒，劉紹雄，岳萬松，張曉華，余鎖姝，李建英**

（1.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221；2.云南省食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究院，云南 昆明 650221；3.保山市科學(xué)技術(shù)情報研究所，云南 保山 678099）

羊肚菌（Morchella spp.） 隸屬于羊肚菌科（Morchellaceae） 羊肚菌屬（Morchella），是一類味道鮮美、脂肪含量低、營養(yǎng)價值高的食用菌。羊肚菌富含蛋白質(zhì)、多種礦物質(zhì)、維生素、多糖、甾醇、多酚、蛋白水解物等，具有降血脂、抗疲勞、調(diào)節(jié)免疫力、抗氧化、保肝護(hù)肝、降血糖等作用[1-3]。野生羊肚菌在我國分布廣泛，在云南、河南、西藏、山西、四川、陜西、甘肅、新疆等地均有分布，但野生資源數(shù)量稀少，因此需開展人工栽培以滿足市場需求。羊肚菌主要采用大棚栽培，但在栽培過程中仍容易受外界環(huán)境和人為栽培技術(shù)等因素的影響，且栽培時需要在土壤廂面擺放一定量的營養(yǎng)袋以提供其生長所需的營養(yǎng)，但這樣也為其他病原菌的生長和繁殖提供了有利的條件[4-5]，導(dǎo)致羊肚菌病害問題日益凸顯。

近年來，關(guān)于羊肚菌病害的研究報道較多。比如，劉偉等[6]研究了羊肚菌軟腐病和紅體病細(xì)菌性病害及蛛網(wǎng)病等真菌性病害，并給出了防控這些病害的方法。GUO 等[7]研究了梯棱羊肚菌（Morchella importuna） 的柄腐爛病的引起原因和防治措施。余苗等[8]研究了羊肚菌白腐病，發(fā)現(xiàn)是由曲霉屬（Aspergillus） 真菌引起的。HE 等[9]報道了羊肚菌白霉病是由長毛擬青霉（Paecilomyces penicillatus） 引起的。白霉病和蛛網(wǎng)病是羊肚菌栽培中較為常見且危害較大的2 種病害。白霉病表現(xiàn)為子實體菌柄、菌蓋或整體感染白色絨毛狀菌絲。蛛網(wǎng)病先是在子實體基部菌柄長出絨毛狀的菌絲，然后向菌蓋蔓延，菌絲逐漸呈棉絮狀。目前關(guān)于羊肚菌白霉病的研究報道較多，但羊肚菌蛛網(wǎng)病的研究相對較少。本次，針對中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所晉寧基地和瀘水市老窩鎮(zhèn)羊肚菌栽培基地，開展白霉病和蛛網(wǎng)病的病害調(diào)查和病原菌研究，分析病害發(fā)生的規(guī)律和原因，并進(jìn)行了病原菌的鑒定等研究，對后期針對性地進(jìn)行病害防治具有重要作用。

1 材料與方法

1.1 采樣點概況及樣品采集

1.1.1 采樣點概況

以中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所羊肚菌栽培基地（102°34′11.27″E，24°33′42.35″N，海拔1 961.6 m） 以及瀘水市老窩鎮(zhèn)羊肚菌栽培基地（99°4′2.56″E，25°53′2.62″N，海拔1 856.2 m），作為羊肚菌病害調(diào)查及病原菌的采集樣點。

1.1.2 樣品采集

采樣時間為2023 年1 月至2 月，調(diào)查并記錄羊肚菌發(fā)病時間、規(guī)律、特征及防治措施等信息，同時采集發(fā)生病害的羊肚菌子實體，將采集的標(biāo)本進(jìn)行編號后裝入9 號自封袋，帶回實驗室開展后續(xù)試驗。

1.2 病原菌分離、純化與鑒定方法

1.2.1 病原菌分離與純化方法

在超凈操作臺上，用經(jīng)酒精燈燒過冷卻后的無菌接種針，在羊肚菌子實體病害處挑取病原菌組織放在PDA 培養(yǎng)基平板（60 mm） 上，置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～7 d。之后挑取菌落的尖端菌絲放在PDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，以此方法純化3～6 次。最后將純化好的單菌落轉(zhuǎn)入斜面試管，待試管長滿后，再置于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原菌形態(tài)鑒定方法

在無菌條件下，將純化后的病原菌接種于PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)。每隔2 d 觀測記錄菌絲生長速度、菌落顏色、大小及形態(tài)變化等特征，培養(yǎng)7 d后挑取菌落并制成臨時玻片，在電子顯微鏡下觀測其菌絲形態(tài)、分生孢子梗、分生孢子形狀、大小等性狀，并進(jìn)行拍照記錄。

1.2.3 病原菌分子鑒定方法

采用rDNA ITS 序列分析[10-11]，采用磁珠法基因組DNA 提取試劑盒（武漢納磁生物科技有限公司）提取菌絲的基因組DNA，用瓊脂糖凝膠電泳法和生物分光光度計法檢測DNA 的純度和濃度。使用ITS通用引物ITS4、ITS5 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 完成后，加（6×） 上樣緩沖液（6×） 5 μL 混勻，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。檢測合格后，進(jìn)行測序。將獲得的ITS 序列，使用BLAST 軟件在NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對，同時，使用MEGA 7 軟件構(gòu)建NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹，使用默認(rèn)參數(shù)，Bootstrap 檢驗為1 000 次，以此來確定病原菌的系統(tǒng)發(fā)育地位。

所設(shè)計的進(jìn)水流道水力損失測試裝置為一立式循環(huán)系統(tǒng)，如圖3所示。由1臺200mm口徑的慣流管道泵供水，供水能力滿足試驗流量范圍的要求，通過調(diào)節(jié)閘閥的開度改變試驗流量，采用電磁流量計測試流量。兼顧減小比尺效應(yīng)和減少試驗費用這兩個方面的要求，模型進(jìn)水流道的進(jìn)口內(nèi)徑定為200mm。進(jìn)水流道模型與原型保持幾何相似，進(jìn)水流道模型采用有機(jī)玻璃制作，進(jìn)水池整體采用鋼板制作，在與進(jìn)水流道連接處兩側(cè)也采用透明有機(jī)玻璃制作觀察窗口，以便觀察和攝錄流態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊肚菌2 種病害發(fā)病癥狀及規(guī)律

羊肚菌白霉病和蛛網(wǎng)病2 種病害發(fā)病癥狀見圖1。

圖1 病害癥狀Fig.1 Disease symptoms

如圖1A 所示，羊肚菌白霉病病害癥狀為菌蓋和菌柄區(qū)域性感染，菌蓋發(fā)病較多，呈白色霉?fàn)睿铀俣容^快[12]。若羊肚菌幼菇被感染，白色菌絲會快速蔓延至整個子實體，導(dǎo)致其無法生長。白霉病發(fā)生規(guī)律為，在棚內(nèi)溫度高、通風(fēng)不暢、高溫高濕的情況下易發(fā)生。

如圖1B 所示，蛛網(wǎng)病病害癥狀表現(xiàn)為外源營養(yǎng)袋周圍發(fā)病較多，地面呈現(xiàn)大面積白色霉層，菌絲呈蜘蛛網(wǎng)狀。從菌柄基部開始逐漸向菌蓋感染，直至包裹整個子實體，其蔓延速度較快，特別是羊肚菌幼菇被感染后，菌絲會快速蔓延至整個子實體，導(dǎo)致羊肚菌子實體停止生長，甚至倒伏死亡。蛛網(wǎng)病發(fā)生規(guī)律為，在采取保溫措施后棚內(nèi)未及時通風(fēng)或揭膜較晚而導(dǎo)致棚內(nèi)通風(fēng)不夠時，以及在高溫高濕的情況下容易發(fā)生。

2.2 病原菌形態(tài)鑒定

對白霉病病原菌進(jìn)行分離純化，得到病原菌菌株YDJB-02，其形態(tài)特征見圖2。

圖2 病原菌菌株YDJB-02 的形態(tài)特征Fig. 2 Morphological characteristics of pathogenic strain of YDJB-02

由圖2 所示，菌株YDJB-02 菌落為圓形，氣生菌絲白色、生長旺盛，生長速度較慢，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中7～10 d 長滿PDA 平板（直徑60 mm）。菌絲體有膨大結(jié)構(gòu)，分生孢子梗呈側(cè)生，分生孢子為鏈?zhǔn)健㈨敹酥瑘A形，光滑，有間隔。符合《真菌鑒定手冊》[13]的擬青霉屬（Paecilomyces） 描述的形態(tài)特征，所以初步鑒定分離得到的菌株為擬青霉屬（Paecilomyces）。

對蛛網(wǎng)病病原菌進(jìn)行分離純化，得到病原菌菌株YDJB-03 其形態(tài)特征見圖3。

圖3 病原菌菌株YDJB-03 的形態(tài)特征Fig.3 Morphological characteristics of pathogenic strain of YDJB-03

由圖3 所示，該菌株菌落為圓形，氣生菌絲為絮狀，生長旺盛，菌落正面為白色，背面為淺黃色，生長速度較快，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中3～5 d 長滿PDA平板（直徑60 mm）。分生孢子梗呈帚狀或輪枝狀分枝，分生孢子單生或聚生，分生孢子卵圓形，無色，0～1 個隔，符合葡枝霉屬（Cladobotryum) 真菌[菌寄生屬（Hypomyces） 真菌的無性階段] 的形態(tài)特征[14-15]。

2.3 病原菌系統(tǒng)發(fā)育分析

經(jīng)過DNA 提取、擴(kuò)增、測序和雙向序列校對，YDJB-02 的ITS 序列與登記號為EU553300.1、KY490042.1、AY624194.1 的長毛擬青霉（P. penicillatus） 序列的相似度分別達(dá)99.42%、99.63%、100.00%。用根霉屬（Rhizopus） 作為外群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖4。

圖4 基于ITS 序列的擬青霉屬Paecilomyces 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of Paecilomyces based on ITS sequence

由圖4 可知，根霉屬（Rhizopus） 與擬青霉屬（Paecilomyces） 分為2 個大的進(jìn)化枝；病原菌菌株與長毛擬青霉聚在同一支系。結(jié)合菌落形態(tài)、顯微結(jié)構(gòu)和分子系統(tǒng)學(xué)分析，將分離純化出的病原菌YDJB-02 菌株鑒定為長毛擬青霉（P. penicillatus）。

經(jīng)過DNA 提取、擴(kuò)增、測序和雙向序列校對，病原菌YDJB-03 的ITS 序列與已發(fā)表金黃菌寄生（Hypomyces aurantius） [無性型為異形枝葡霉（Cladobotryum varium）] MH858568.1、MH855045.1、MH864222.1 的相似度分別達(dá)99.67%、99.82%、99.47%。用擬青霉屬（Paecilomyces） 作為外群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖5。

圖5 基于ITS 序列的菌寄生屬Hypomyces 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of Hypomyces based on ITS sequence

由圖5 可知，菌寄生屬（Hypomyces） 與擬青霉屬（Paecilomyces） 分為2 個大的進(jìn)化枝；病原菌菌株與金黃菌寄生聚在同一支系。結(jié)合菌落形態(tài)、顯微結(jié)構(gòu)和分子系統(tǒng)學(xué)分析，將分離純化出的病原菌鑒定為金黃菌寄生（Hypomyces aurantius） 無性型為異形枝葡霉（Cladobotryum varium）。

3 結(jié)論與討論

通過對羊肚菌白霉病病原菌進(jìn)行分離純化，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和分子鑒定結(jié)果，表明引起羊肚菌白霉病的病原菌為長毛擬青霉（P. penicillatus）。有研究人員針對羊肚菌白霉病病害進(jìn)行調(diào)查和研究，通過科赫氏驗證，發(fā)現(xiàn)其病原菌為長毛擬青霉（P.penicillatus）[16-18]。這與本試驗的結(jié)果一致，這為下一步羊肚菌的病害防治奠定了基礎(chǔ)。有研究表明枯草芽孢桿菌（Bacillus Subtilis） 制劑和多菌靈對長毛擬青霉菌絲生長有較好的抑制效果，其中，枯草芽孢桿菌制劑為生物類藥劑，不會使其菌株產(chǎn)生抗藥性，且綠色環(huán)保。因此，在羊肚菌栽培中，如果發(fā)生白霉病，可斟酌使用枯草芽孢桿菌制劑和多菌靈。

通過對蛛網(wǎng)病病病原菌進(jìn)行分離純化，結(jié)合形態(tài)特征及分子鑒定，結(jié)果表明引起羊肚菌蛛網(wǎng)病的病原菌為異形枝葡霉（C. varium），有性型為金黃菌寄生（H. aurantius），該病原菌于1860 年在多孔菌（Polyporus varius Pers.: Fr.） 上發(fā)現(xiàn)并被首次報道[14]。研究表明引起蛛網(wǎng)病的病原菌主要為凸出枝葡霉（Cladobotryum protrusum）、異型葡枝霉（Cladobotryum varium）、嗜菌葡枝霉（Cladobotryum mycophilum） 和樹狀枝葡霉（Cladobotryum dendroides） 等[19-20]，且在金針菇（Flammulina filiformis）[21-22]、斑玉蕈（Hypsizygus marmoreus）[23-24]、刺芹側(cè)耳（Pleurotus eryngii var. tuoliensis）[25]等食用菌中發(fā)現(xiàn)引起蛛網(wǎng)病的病原真菌為異形枝葡霉，與本試驗中引起羊肚菌蛛網(wǎng)病的病原菌結(jié)果一致，但異形枝葡霉引起羊肚菌蛛網(wǎng)病還是首次報道。本試驗利用分子生物學(xué)手段對羊肚菌蛛網(wǎng)病病原菌進(jìn)行了鑒定，明確了其病原菌為異形枝葡霉，為該病害的防治奠定了理論基礎(chǔ)。關(guān)于羊肚菌蛛網(wǎng)病病原菌異形枝葡霉的生物學(xué)特性、發(fā)生特點和防控技術(shù)還有待于進(jìn)一步研究。