腸道菌群失調(diào)作為始發(fā)因素參與腹瀉型腸易激綜合征的發(fā)生與發(fā)展分析

董昌昊，李超，王少鑫，王廣祥，冼銳，劉曉娜，崔立紅

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome， IBS）是一種以腹痛、腹脹等為主要癥狀，且伴隨排便習(xí)慣或糞便性狀改變的常見的胃腸道疾?。?］。臨床上按照糞便性狀將IBS 分為腹瀉型（IBS-D）、便秘型（IBS-C）、混合型（IBS-M）和不定型。據(jù)報道，在中國人群中IBS-D 約占IBS 總患者的66.3%，是最常見的亞型［2］。IBS-D 的病因和發(fā)病機制尚不明確，目前被認(rèn)為可能與腦腸調(diào)控異常、腸道微生態(tài)失衡、腸黏膜低度炎癥和精神心理等多種因素共同作用有關(guān)［3］。多個研究報道了IBS-D 患者中出現(xiàn)腸道菌群的變化［4-6］。然而，腸道菌群失調(diào)是IBS-D 的伴隨現(xiàn)象還是作為IBS-D 的誘發(fā)因素尚不十分清楚。本研究擬通過糞菌移植實驗，探討腸道菌群在IBS-D 發(fā)生發(fā)展中的具體作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 小鼠購自北京天融慧通科技有限責(zé)任公司［實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0010］，飼養(yǎng)環(huán)境溫度25 ℃，濕度40%～45%。取10 只SPF 級C57BL/6J 小鼠，并隨機取其中5 只采用避水應(yīng)激法構(gòu)建IBS-D 小鼠模型，通過檢測其糞便含水量、腸道傳輸時間、腸道敏感性等方法驗證造模是否成功，其余5 只置于相同環(huán)境中正常飼養(yǎng)作為健康對照小鼠。造模成功后另取10 只小鼠（SPF 級， C57BL/6J）進(jìn)行糞菌移植實驗。首先，按照氨芐西林1 g/L、新霉素1 g/L、甲硝唑1 g/L、萬古霉素500 mg/L 的濃度配制成四聯(lián)抗生素水溶液，給小鼠喂食含有上述4 種抗生素及甜味劑的水，共10 d，模擬腸內(nèi)無菌條件，飲用水2 d 更換1 次。然后，將經(jīng)過抗生素清掃的小鼠隨機分為實驗組和對照組，每組5 只。將IBS-D 小鼠和健康小鼠的糞便標(biāo)本分別配制成菌群PBS 混懸液（50 mg/ml）。在抗生素清掃的第11 天，通過灌胃法分別給予實驗組和對照組小鼠來源于IBS-D 和健康小鼠的菌群PBS 混懸液，200 μl/d，連續(xù)5 d。糞菌移植結(jié)束1 周后記錄小鼠的腸道傳輸時間、腸道敏感性及糞便含水量。

1.2 實驗試劑 β-actin（貨號：BM0627）和HRP 標(biāo)記羊抗兔二抗（貨號：BA1054）購自武漢博士德生物工程有限公司。兔多抗核因子κB（nuclear factor kappa-B， NF-κB）、Toll 樣受體4（toll like receptor 4，TLR4）、髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88， MyD88）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6， IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）購自Affinity公司。反轉(zhuǎn)錄試劑及實時熒光定量PCR（qRTPCR）試劑購自VAZYME 公司。

1.3 糞便含水量 采用Bristol 糞便分級量表對小鼠糞便進(jìn)行分級。隨后檢測小鼠糞便含水量，在鼠筐底部鋪上一張濾紙收集小鼠4 h 內(nèi)的糞便，此過程中應(yīng)時刻注意保持濾紙完整。收集的糞便首先稱量濕重，記為W1，然后將糞便放入烘箱中，干燥后稱量干重，記為W2。糞便含水量（%）=（W1-W2）/W1×100%。

1.4 腸道傳輸時間 通過灌胃法給予未禁食的小鼠6%的胭脂紅溶液（溶于0.5%的甲基纖維素中）并觀察傳輸時間。從灌胃開始到糞便中胭脂紅首次出現(xiàn)的時間記作該小鼠的腸道運輸時間。

1.5 腸道敏感性 采用結(jié)直腸擴張實驗測試小鼠腸道敏感性。小鼠禁食24 h 但不禁水，測試當(dāng)天用乙醚鎮(zhèn)靜小鼠，將液體石蠟油潤滑后的導(dǎo)尿管（6 Fr）置于直腸中，使氣囊末端距離肛門約2 cm 并固定。然后將小鼠放置在固定器內(nèi)，待其蘇醒適應(yīng)30 min后分別注入0.2、0.3、0.4 和0.5 ml 空氣（每個體積持續(xù)20 s，中間間隔4 min）。記錄觀察小鼠腹部回撤反射（abdominal withdrawal reflex， AWR）情況并進(jìn)行評分。

1.6 qRT-PCR 檢測 檢測小鼠結(jié)腸組織中NF-κB（P65）、TLR4、MyD88、IL-Iβ、IL-6、TNF-α 的mRNA表達(dá)水平。利用Trizol 法提取總RNA，然后進(jìn)行cDNA 的合成和qRT-PCR 檢測。PCR 檢測條件為95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s，共40 個循環(huán)。通過2-ΔΔCt法計算mRNA 相對表達(dá)量。PCR 引物序列見表1。

表1 PCR 引物序列

1.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測 檢測結(jié)腸組織中NF-κB（P65）、NF-κB（P-P65）、TLR4、MyD88、IL-Iβ、IL-6、TNF-α 的表達(dá)水平。取小鼠結(jié)腸組織置于裂解液中，勻漿后取上清液。利用BCA 試劑盒測定蛋白濃度。制備SDS-PAGE 凝膠，將制備好的凝膠固定到電泳槽上，上樣進(jìn)行電泳。電泳完成后將凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。用含5% 脫脂奶粉的TBST 浸泡PVDF 膜，室溫?fù)u床封閉2 h。孵化抗體，洗滌并去除多余的抗體，最后顯影曝光。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以±s表示，組間比較分析采用t檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 避水應(yīng)激小鼠模型構(gòu)建 與健康小鼠相比較，避水應(yīng)激小鼠腸道傳輸時間短于健康小鼠（P＜0.05），糞便含水量高于健康小鼠（P＜0.01）。見表2。避水應(yīng)激小鼠腸道敏感性高于健康小鼠，見圖1。提示造模成功。

圖1 避水應(yīng)激小鼠與健康小鼠不同壓力下AWR 評分

表2 避水應(yīng)激小鼠與健康小鼠糞便含水量、腸道傳輸時間比較（± s）

表2 避水應(yīng)激小鼠與健康小鼠糞便含水量、腸道傳輸時間比較（± s）

類別健康小鼠避水應(yīng)激小鼠P 值例數(shù)5 5糞便含水量（%）58.93 ± 4.39 67.28 ± 2.61＜0.01腸道傳輸時間（min）204.20 ± 25.15 170.80 ± 16.51 0.04

2.2 實驗組與對照組小鼠糞便含水量、腸道傳輸時間、AWR 評分比較 與移植健康糞便的小鼠相比，移植IBS-D 糞便的小鼠出現(xiàn)IBS-D 相關(guān)表現(xiàn)包括糞便含水量和AWR 評分均增加（P＜0.05）；腸道傳輸時間縮短（P＜0.05）。見表3、圖2。

圖2 實驗組與對照組小鼠不同壓力下AWR 評分

表3 實驗組與對照組小鼠糞便含水量、腸道傳輸時間比較（± s）

表3 實驗組與對照組小鼠糞便含水量、腸道傳輸時間比較（± s）

組別對照組實驗組P 值例數(shù)55糞便含水量（%）53.82 ± 3.84 63.58 ± 4.53＜0.01腸道傳輸時間（min）181.80 ± 13.77 111.20 ± 38.90＜0.01

2.3 實驗組與對照組小鼠qRT-PCR 檢測結(jié)果 實驗組與對照組小鼠結(jié)腸組織中IL-6、IL-1β、MyD88、TNF-α、NF-κB（P65）、TLR4 6 種mRNA 表達(dá)水平見圖3。實驗組小鼠結(jié)腸組織中上述指標(biāo)的mRNA表達(dá)水平均高于對照組小鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 實驗組與對照組小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β、TLR4、MyD88、NF-κB（P65）的mRNA 表達(dá)水平比較

2.4 實驗組與對照組小鼠蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果 通過對比β-actin 計算得出的相對表達(dá)量見圖4、5。實驗組小鼠結(jié)腸組織中IL-6、IL-1β、MyD88、TNF-α、NF-κB（P65）、TLR4 蛋白表達(dá)量高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4 實驗組與對照組小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β 蛋白的表達(dá)水平比較

圖5 實驗組與對照組小鼠NF-κB（P65）、磷酸化P65、MyD88、TLR4 蛋白的表達(dá)水平

3 討論

IBS-D 是最常見的功能性胃腸病之一。這種疾病雖然不會危及生命，但對患者的生活質(zhì)量有著嚴(yán)重影響，同時給醫(yī)療保健系統(tǒng)帶來巨大負(fù)擔(dān)［7］。全球估計IBS 患病率為10%～20%［8］。據(jù)報道，與西方國家相比，亞洲國家的IBS 患病率較低［9］。然而隨著生活方式和社會經(jīng)濟因素的變化，IBS-D 在亞洲地區(qū)的發(fā)病率可能不斷上升［10］。

IBS-D 的發(fā)病機制很復(fù)雜，至今尚未完全明確。研究表明，腸道菌群失調(diào)、結(jié)腸黏膜的慢性炎癥反應(yīng)以及腸道內(nèi)臟敏感性的增加在IBS-D 患者中很常見［11］。腸道菌群是人體內(nèi)最龐大最復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)之一，其與人類共生共存，在參與宿主營養(yǎng)代謝、維持腸道屏障完整性、調(diào)節(jié)免疫等方面發(fā)揮著重要作用［12］。隨著研究的不斷深入，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)相對于健康人群而言，IBS-D 患者腸道菌群的數(shù)量和組成發(fā)生了顯著變化。相關(guān)研究表明，IBS-D患者腸道菌群的豐富度顯著降低，其表現(xiàn)為2 個主要門的明顯變異，即擬桿菌門增加和厚壁菌門減少［13］。在屬水平上，表現(xiàn)為擬桿菌屬和普雷沃氏菌屬增加，雙歧桿菌屬減少［14］。但這些變化與IBS-D發(fā)生的具體因果關(guān)系尚不明確，腸道菌群改變是IBS-D 的伴隨現(xiàn)象還是作為始發(fā)因素誘導(dǎo)IBS-D 的發(fā)生值得進(jìn)一步探索。

本研究通過抗生素清掃，模擬腸內(nèi)無菌環(huán)境，通過糞菌移植探究腸道菌群在IBS-D 發(fā)生中的作用。與移植健康糞便的小鼠相比，移植IBS-D 糞便的小鼠表現(xiàn)出了明顯的腸易激癥狀，包括糞便含水量增加、腸道傳輸時間縮短以及腸道敏感性增加。同時本研究也檢測了2 組小鼠腸黏膜的炎癥因子表達(dá)情況，結(jié)果顯示接受IBS-D 糞便移植的小鼠腸黏膜炎癥因子水平高于接受健康糞便移植的小鼠。

腸道的低度炎癥和免疫激活被認(rèn)為是IBS-D 發(fā)病的重要因素之一。研究表明炎癥因子水平在IBS-D小鼠中升高，抗炎治療在IBS-D 小鼠中展示了良好的臨床前景［15］。NF-κB 是一種轉(zhuǎn)錄因子，其在免疫反應(yīng)、炎癥、凋亡等生物學(xué)過程中扮演著重要角色。結(jié)腸組織中NF-κB 及其通路相關(guān)分子TLR4、MyD88 的表達(dá)水平升高已被證明與IBS-D 發(fā)病相關(guān)，NF-κB 驅(qū)動的炎癥細(xì)胞因子，如IL-1β、IL-8 和TNF-α 等，可影響腸道分泌和運動并刺激內(nèi)臟感覺神經(jīng)末梢，導(dǎo)致內(nèi)臟高敏感性［16］。

在健康個體中，穩(wěn)定的腸道菌群在維持腸道屏障完整性和炎癥平衡方面起著關(guān)鍵作用。但這種“穩(wěn)態(tài)”在某些情況下可能會被打破［17］。腸道菌群的失衡可能會導(dǎo)致腸道黏膜屏障被破壞及通透性增加，使得促炎微生物產(chǎn)物如脂多糖（lipopolysaccharides， LPS）進(jìn)入腸黏膜，LPS 可以與腸道上皮細(xì)胞表面的TLR4 結(jié)合，從而激活腸道上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞的炎癥反應(yīng)［18］。這些免疫細(xì)胞和上皮細(xì)胞通過激活NF-κB 通路產(chǎn)生炎癥因子，如IL-6、TNF-α和IL-1β 等，引起腸道黏膜的炎癥和一系列腸道癥狀，促進(jìn)IBS-D 的發(fā)生。

綜上所述，本研究通過糞菌移植的方式成功構(gòu)建出IBS-D 小鼠模型。提示腸道菌群失調(diào)在IBS-D的發(fā)生中可能起到“啟動”作用。盡管其中的具體機制有待進(jìn)一步研究，但菌群紊亂導(dǎo)致腸黏膜低度炎癥及NF-κB 相關(guān)通路的異常激活可能在此過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。