miR-190和ANXA11對直腸癌新輔助放化療效用評估價值及相關性分析

徐 鈺, 胡錫池, 趙于天

(1.江南大學附屬醫院腹部放療科, 江蘇 無錫 214122 2.江蘇省無錫市第二人民醫院檢驗科, 江蘇 無錫 214002)

直腸癌是起源于直腸內皮細胞的惡性變異,通常發生在直腸的末段,發病率隨著年齡的增長而增加[1]。臨床研究顯示,直腸癌早期癥狀不顯著,臨床癥狀以腹痛、便秘、排便習慣改變等為主,因此多數患者就診時已處于疾病中晚期[2]。目前臨床對直腸癌治療仍以手術為主,而單純手術治療無法阻止腫瘤體積增長及復發,術前新輔助化療(neo-adjuvant chemotherapy,NAC)作為術前或術后減少腫瘤體積或預防復發的有效治療手段,可通過病理切片結果評估臨床效用,但其花費較高、檢測時間長,為臨床療效評估帶來不便[3-4]。微小核苷酸(micronucleotide,miR)作為與原癌基因激活有密切聯系的一類因子,其中miR-190長期穩定存在于機體中,并參與乳腺癌、結直腸癌等疾病發展過程[5]。膜聯蛋白A11(annexins A11,ANXA11)作為膜聯蛋白家族中的一員,其在胃癌中的表達意義已被臨床多數研究證[6]。但miR-190和ANXA11在直腸癌中的研究仍較少,基于此,本研究通過分析miR-190、ANXA11在直腸癌患者NAC治療后水平變化及對療效評估價值,為尋找評估直腸癌療效的有效腫瘤標志物提供參考依據,同時為探明直腸癌發病機制提供潛在思路研究。

1 資料與方法

1.1一般資料:以2019年6月至2022年8月在我院確診并接受治療的148例直腸癌患者作為研究對象,并納入直腸癌組,另選取同時期150例健康人作為對照組,其中直腸癌組共包含男性71例,女性77例,年齡42～69歲,平均年齡(55.71±8.06)歲,體質量指數(Body mass index,BMI)為20～27(23.57±1.90)kg/m2,TNM分期Ⅰ期21例,Ⅱ期64例,Ⅲ期63例,腫瘤直徑為3.1～7.3(4.87±1.21)cm,腫瘤下緣距肛緣距離為2.1～8.5(5.28±1.73)cm;對照組包含男性78例,女性72例,年齡40～71歲,平均年齡(54.76±8.89)歲,BMI為20～27(23.76±2.02)kg/m2,兩組受試者在年齡、性別、BMI等基線資料方面對比無顯著統計學差異,具有可比性(P>0.05),本研究經本院倫理委員會審批進行,所有受試者均知情并簽署知情同意書。納入標準:①直腸癌患者符合《直腸癌規范化診療指南》[7]中相關診斷標準;②直腸癌患者近半年無應用免疫抑制類或腎上腺皮質激素類藥物;③預計生存期>6個月;④臨床資料完整。排除標準:①合并嚴重糖尿病;②伴有免疫功能障礙;③對本研究化療藥物具有過敏史者;④合并其他腫瘤疾病;⑤合并精神系統疾病;⑥合并心臟病并發癥。

1.2方 法

1.2.1NAC方法:所有患者在術前均接受相同的NAC治療,放療前醫生通過病史、體格檢查、腸鏡檢查、組織活檢等來確定直腸癌的類型、分期和位置,根據患者具體情況制定放化療計劃,放療之前,需通過CT掃描等影像學檢查來確保準確定位目標區域,直腸腫瘤放療劑量設置為50Gy/25Fr,對于腫瘤增至盆腔患者放療劑量調整至45Gy/25Fr,每周連續治療5d,共治療5周,在放療過程中,醫生會定期監測患者的治療反應和副作用,根據患者的具體情況,可能需要進行調整治療計劃或提供支持性治療以減輕副作用和提高治療效果;放療期間同步口服卡培他濱(廠家:上海羅氏制藥有限公司,批號:國藥準字H20073023)825mg/m2,2次/d,連續服用5周,休息6～8周后行直腸癌腫瘤切除術。術后隨訪6個月觀察臨床療效。

1.2.2miR-190、ANXA11檢測:細胞系總RNA經紫外分光光度計測定RNA濃度后反轉錄為cDNA,用ABI StepOnePlus系統進行RT-PCR分析。應用擴增催化反應原料環境耐熱條件:95℃以后低溫預變性5min循環1次,95℃后高溫預變性30s,60℃退火30s,7℃延伸30s,共一個周期循環40次,采用凝膠成像儀獲取Ct值,其變化以ΔCt表示。miR-190上游5’-GGTCTTTGATGATGATTCTGG-3’,下游5’-CTAGGCACAGTATTGAAGGTT-3’;ANX A11上游5’-TGGCAGTTTTCAACGAGTATCAGA-3’,下游5’-ATATCGTGGTACAGTGACTTG-3’;U6作為內部對照,上游5’-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3’,下游5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。用2-ΔΔCT法計算miR-190、ANXA11相對基因表達量。

1.2.3療效評估標準:以腫瘤消退分級(Tumor regression grading,TRG)[8]指南作為病理評估標準,術后由兩名病理科醫生對病理切片進行TRG分級,其中光鏡檢查下無可見殘留腫瘤細胞視為TRG1級;光鏡下顯示有少量腫瘤細胞殘留,且大部分組織呈纖維化,為TRG2級;光鏡下可見腫瘤細胞且纖維化組織超過50%,視為TRG3級;光鏡下有較多腫瘤細胞殘留,且纖維化組織少于50%,視為TRG4級。光鏡下腫瘤細胞無明顯消退,且不可見纖維化,視為TRG5級。將TRG1～3級納入療效優良組(n=89),TRG4～5級納入療效較差組(n=59)。

2 結 果

2.1直腸癌組與對照組血清miR-190、ANXA11 mRNA表達對比:直腸癌組患者血清miR-190顯著低于對照組,但ANXA11 mRNA表達顯著高于對照組(均P<0.05),詳見圖1。

圖1 對比直腸癌組與對照組患者血清miR-190、ANXA11 mRNA表達

2.2療效優良組與療效較差組血清miR-190、ANXA11 mRNA表達對比:療效優良組患者血清miR-190顯著高于療效較差組,但ANXA11 mRNA表達顯著低于療效較差組(均P<0.05),詳見圖2。

圖2 對比療效優良組與療效較差組患者血清miR-190、ANXA11 mRNA表達

2.3血清miR-190、ANXA11 mRNA表達與NAC療效關系:經Spearman相關性分析顯示,miR-190表達與NAC療效呈顯著正相關(r=0.602,P<0.001),而ANXA11 mRNA表達與NAC療效呈顯著負相關(r=-0.631,P<0.001)。

2.4血清miR-190、ANXA11 mRNA表達高低對NAC療效影響:以直腸癌患者miR-190、ANXA11 mRNA表達平均數作為分界值,高于miR-190、ANXA11 mRNA表達平均數的分別納入miR-190高表達組、ANXA11 mRNA高表達組;低于miR-190、ANXA11 mRNA表達平均數的分別納入miR-190低表達組、ANXA11 mRNA低表達組,經Kaplan-meier生存曲線觀察顯示,相比于miR-190低表達組,miR-190高表達組患者NAC療效優良率顯著升高(χ2=39.120,P<0.001);相比于ANXA11 mRNA高表達組,ANXA11 mRNA低表達組患者NAC療效優良率顯著升高(χ2=8.772,P=0.003),詳見圖3、圖4。

圖3 血清miR-190表達高低對NAC療效影響

圖4 血清ANXA11 mRNA表達高低對NAC療效影響

2.5miR-190、ANXA11 mRNA單一及聯合檢測對NAC臨床效用評估價值:ROC結果顯示,miR-190、ANXA11聯合檢測的曲線下面積(area under curve,AUC)敏感度及特異度顯著高于單一檢測(P<0.05),詳見表1、圖5。

表1 miR-190 ANXA11單一及聯合檢測對NAC臨床效用預測效能

圖5 miR-190、ANXA11單一及聯合檢測對NAC臨床效用預測效能圖

3 討 論

目前臨床中對于直腸癌的病因尚不明確,經不斷研究顯示,直腸癌的病因可在遺傳、環境、飲食、生活習慣等多種因素共同作用下發病[9-10]。現階段對于直腸癌的治療主要采取個體化綜合治療的原則,根據患者不同身體狀態、腫瘤病理類型、腫瘤分期,有計劃的采取不同治療手段,其中手術作為直腸癌治療的主要方式,對于早期直腸癌患者可以達到根治目的,對于中晚期直腸癌患者,通過輔以放化療的綜合療法能夠有效提高治愈率[11]。NAC作為直腸癌手術前用于阻止癌細胞生長,從而縮小腫瘤體積或降低復發風險的一種綜合放化療手段,其療效結果與患者預后生存期之間具有重要聯系[12]。

本研究結果顯示,對照組miR-190表達顯著高于直腸癌組,同時療效優良組患者的miR-190表達也顯著高于療效較差組,對其內在機制分析表示,miR-190作為高等動物體內具有高度保守性的一項miRNA,其在腫瘤組織中常呈低表達,與Sun G[12]等學者研究一致,在該學者的研究中發現miR-190表達上調與上皮間質轉化(Epithelial mesenchymal transition,EMT)具有密切聯系,分析原因如下:隨著miR-190表達上調,其可通過抑制血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達水平,進而阻止腫瘤表面血管新生,發揮減緩腫瘤進展作用;而隨著miR-190水平的降低,其無法有效抑制VEGF對腫瘤血管新生的促進作用,從而造成直腸癌的進一步發展,此外,本研究相關性結果也同樣對該結論進行證實,相關性分析miR-190與NAC療效呈顯著正相關,即miR-190表達越高,則患者NAC療效越好,分析機制為NAC中放療可對腫瘤細胞產生直接殺傷作用,另外利用卡西他濱能夠通過介導免疫調節點從而發揮抗腫瘤效應,降低腫瘤細胞增殖、侵襲,從而達到較高的臨床療效[13]。此外,miR-190在癌細胞中上調能夠介導凋亡相關基因及細胞周期抑制因子P21的表達,從而促進細胞周期的進行并減少正常細胞凋亡速度[14]。提示臨床對于miR-190高表達組患者而言,其在應用NAC治療后的臨床療效優良率顯著高于miR-190低表達組。

ANXA11作為編碼基因位于人類染色體Xq28區域的一種膜結合蛋白,其主要通過與細胞膜相互作用,從而參與細胞信號傳導及調節,目前臨床中對于ANXA11的具體功能和機制研究尚未完全闡明,部分研究表示,其可在細胞凋亡、增殖及遷移等過程中發揮重要參與作用[15]。而本研究同樣也顯示,ANXA11在直腸癌患者及療效較差組患者中的表達顯著升高。分析其相關機制主要為:ANXA11與FPR2結合對于維持正常成纖維細胞的穩態具有重要作用,且其可與介導白細胞和內皮細胞相互作用的黏附分子發生相互作用,從而抑制白細胞遷移到炎癥部位發揮作用,ANXA11在直腸癌中作用是可通過參與磷酸化過程從而促進直腸癌的發生發展,其與NAC臨床療效之間呈負相關也能夠證實以上結論,說明ANXA11表達越低,則直腸癌患者NAC療效越好[16]。另外經Kaplan-meier分析顯示ANXA11低表達患者的NAC療效優良率顯著高于ANXA11高表達組,同樣能夠說明ANXA11可通過調節細胞凋亡、遷移過程從而介導直腸癌進展。

由于miR-190、ANXA11在直腸癌及不同NAC療效患者中均具有特異性表達水平,因此本研究通過繪制ROC,進一步分析miR-190、ANXA11聯合檢測用于評估直腸癌患者NAC療效的預測效能。結果顯示相比于單一因子檢測,miR-190、ANXA11聯合檢測的AUC顯著較高,對于評估NAC臨床效用具有較高診斷價值。雖本研究取得一定臨床研究成果,但仍存在不足之處,首先本研究屬于小樣本量研究,研究準確度及可信度還需進一步大樣本量研究證實;另外目前臨床暫未有研究闡明NXA11與直腸癌之間的關系,因此本研究對于兩者之間的機制分析還需后續的基礎研究進一步證實。

綜上所述,miR-190、ANXA11在NAC不同療效患者之間具有顯著差異,且與NAC臨床療效之間具有密切聯系,通過聯合miR-190、ANXA11檢測能夠對直腸癌患者早期療效進行有效預測,同時也能夠為探明直腸癌發病機制提供潛在靶點,值得臨床進一步研究。