雄性激素誘導(dǎo)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC01126促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡及Warburg效應(yīng)

紀(jì)金宏 馬曉倩 劉新雅 何昆侖

(衡水市人民醫(yī)院,河北 衡水 053000)

前列腺癌(PCa)具有地域性和種族性。在西方國(guó)家,尤其是歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家中的男性最為常見的,同時(shí)也是較為嚴(yán)重的一種疾病,其死亡率在所有癌癥中位居前1/3〔1〕;PCa在亞洲的發(fā)病概率較西方國(guó)家發(fā)病概率小,但是近年來PCa的病例也在逐年增加〔2〕。在我國(guó)PCa多為晚期,已發(fā)生轉(zhuǎn)移。常見給予抗雄激素治療,具有一定的治療效果,但在治療1年后幾乎全部患者均會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)槿?shì)抵抗性PCa,至今尚無較好的解決方案。PCa早期無特異性特征,導(dǎo)致大部分患者一經(jīng)發(fā)現(xiàn)已為晚期,因此早期診斷對(duì)于治療至關(guān)重要〔3,4〕。長(zhǎng)鏈非編碼 RNA存在于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中,LINC01126是其成員之一,研究發(fā)現(xiàn)〔5〕,在人體基因組中有近6萬(wàn)個(gè)lncRNA基因的表達(dá)。已有研究證實(shí)〔6〕,lncRNA在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等過程中具有重要作用,還可通過順式/反式調(diào)控其他基因水平。除此之外〔7〕,lncRNA在多種腫瘤中均存在異常表達(dá),可通過調(diào)控細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移等過程參與腫瘤的產(chǎn)生及發(fā)展。導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的主要原因是促進(jìn)及抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的因素水平失衡,癌細(xì)胞能量代謝模式(Warburg效應(yīng)解)的開啟帶來的相關(guān)效應(yīng)(癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移促進(jìn)基因的激活)在打破這種失衡中發(fā)揮了重要作用,但具體機(jī)制目前尚未完全了解。本研究雄性激素誘導(dǎo)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC01126促進(jìn)PCa細(xì)胞增殖、凋亡及Warburg效應(yīng)。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑 LINC01126、雄激素受體(AR)引物序列(上海晶能生物公司);聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(南京康維達(dá)生物公司,型號(hào):QuantStudio 3);噻唑藍(lán)(MTT)溶液(武漢普諾賽生命科技公司);結(jié)晶紫溶液(上海尚寶生物公司);流式細(xì)胞儀(北京煥彩元合科技公司,型號(hào):BD FACSCanto Ⅱ);酶標(biāo)儀(濟(jì)南霍爾德電子科技公司,型號(hào):HED-SY96S)。

1.2細(xì)胞來源及培養(yǎng) 人PCa細(xì)胞DU145、PC3、LNCaP、IA8及正常前列腺細(xì)胞RWPE-1均購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。DU145、PC3、LNCaP、IA8用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng),所有細(xì)胞均在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)胰酶消化、離心、重懸、傳代,取第3代進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3組織標(biāo)本來源 PCa組織、癌旁組織、肝癌組織、乳腺癌組織、胃癌組織、膀胱癌組織、食管癌組織、腎癌組織標(biāo)本來源于衡水市人民醫(yī)院2019年5月至2020年4月收治的上述疾病患者(已經(jīng)過病理確認(rèn)),每個(gè)疾病取5個(gè)腫瘤組織標(biāo)本,且已經(jīng)過患者及家屬同意,本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào):Y2019-010-18)。

1.4AR載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 AR載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染根據(jù)文獻(xiàn)〔8〕進(jìn)行:載體用T4 DNA Ligase酶連接AR基因與pCDNA3.1+載體進(jìn)行構(gòu)建,提取質(zhì)粒。前1 d將細(xì)胞接種至培養(yǎng)基中(無抗生素),融合至80%后,分為空白組、對(duì)照組(轉(zhuǎn)染空載體)及轉(zhuǎn)染組。將質(zhì)粒加入24孔板中,稀釋至100 μl為Z液。取1 μl Lipofectamine2000溶解于培養(yǎng)基為L(zhǎng)液,Z、L液混合后加到培養(yǎng)板中。4 h后更換培養(yǎng)基,48 h后收樣。

1.5檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1實(shí)時(shí)熒光定量(qRT)-PCR檢測(cè)LINC01126、AR水平 取各細(xì)胞及剪碎的PCa組織與癌旁組織,加入0.125%胰蛋白酶裂解后,將細(xì)胞懸液放于試管中。利用Trizol法檢測(cè)提取總RNA,按照Micro RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。LINC01126上游引物:5′-AGCGTAAGGGTGGAGAAAGC-3′,下游:5′-CTGAGGTCACCTG CTCTTGG-3′;AR上游引物:5′-ATGGAAGTGCAGTTAGGGCTGG-3′,下游:5′-TCACTGGGTGTGGA AATAGATGGG-3′;內(nèi)參GAPDH上游引物:5′-TTGATCTTCATGAGCTAGGAGCGAAGGGGA-3′,下游:5′-TGACGGTCAGGTCATGACTATCGGCAATGA-3′。PCR條件:95 ℃ 5 min、95 ℃ 5 s、59 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s以上40個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min。以2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.5.2MTT測(cè)細(xì)胞增殖 將LNCaP(4×103)接種至96孔板,上述方法將細(xì)胞分為空白組、對(duì)照組與轉(zhuǎn)染組,并給予相應(yīng)的轉(zhuǎn)染。待細(xì)胞密度至60%時(shí),換液,分別孵育12、24、48 h 后,加入MTT溶液孵育4 h,運(yùn)用酶標(biāo)儀檢測(cè)光密度(OD)值,并判斷細(xì)胞增殖能力。

1.5.3Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移及侵襲 遷移:將LNCaP細(xì)胞消化制成懸液,上室加入200 μl細(xì)胞(1×105)懸液,將750 μl含10%胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基加入下室,常規(guī)培養(yǎng)48 h,取出小室后棄上清,多聚甲醛固定,結(jié)晶紫染色,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后于顯微鏡下觀察。侵襲:預(yù)先用無血清培養(yǎng)基將Matrigel (50 mg/L)稀釋(1∶4),包被Transwell小室底部膜,4 ℃風(fēng)干,水化基底膜。其余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.5.4流式細(xì)胞儀測(cè)凋亡 將LNCaP(1×105/ml)接種至6孔板,培養(yǎng)24 h,胰酶消化后PBS清洗,離心后棄上清?；烊?00 μl結(jié)合緩沖液 重懸。加入 5 μl膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素酶(Annexin Ⅴ-FITC)混勻、 10 μl碘化丙啶(PI)混勻,室溫避光孵育5～15 min,隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5.5Warburg效應(yīng)檢測(cè) 葡萄糖攝取:將LNCaP(1×105個(gè)/孔)接種于6孔板中,加20 μg/ml PSL,24 h后將培養(yǎng)基補(bǔ)至2 ml,常規(guī)培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)液。以初始細(xì)胞葡萄糖量作為空白,制備反應(yīng)液,混勻后進(jìn)行水浴反應(yīng),酶標(biāo)儀測(cè)吸光度。乳酸生成:空白均以初始細(xì)胞為準(zhǔn),配制反應(yīng)液(樣本、酶工作液、顯色液;0.02 ml∶1 μl∶0.2 ml),混勻后水浴中進(jìn)行反應(yīng),酶標(biāo)儀測(cè)吸光度。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行方差分析,兩組間對(duì)比采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1LINC01126在不同組織中的表達(dá) 與肝癌、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、食管癌、腎癌等組織(0.85±0.06、0.82±0.07、0.84±0.06、0.86±0.05、0.83±0.03、0.81±0.08)相比,PCa組織中LINC01126表達(dá)明顯較高(1.02±0.03;P<0.001),表明LINC01126在PCa組織中呈現(xiàn)高表達(dá)。此后,用PCa組織與癌旁正常組織做了進(jìn)一步檢查,發(fā)現(xiàn)PCa組織中的LINC01126表達(dá)水平(1.97±0.14)顯著高于癌旁正常組織(1.00±0.01,P<0.05)。

2.2LINC01126在各細(xì)胞中的表達(dá) RWPE-1中LINC01126表達(dá)(1.00±0.04)明顯低于在DU145、PC3、LNCaP、IA8中的表達(dá)(2.81±0.15、2.79±0.17、3.14±0.16、2.77±0.20;F=250.500,P<0.001)。LNCaP中LINC01126表達(dá)顯著高于在PC3、DU145、IA8中的表達(dá)(P<0.05)。因此,本文選用LNCaP細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3各組LNCaP細(xì)胞LINC01126及AR mRNA比較 空白組與對(duì)照組LNCaP細(xì)胞中LINC01126、AR表達(dá)水平對(duì)比無明顯差異(P>0.05)。轉(zhuǎn)染AR后轉(zhuǎn)染組LNCaP細(xì)胞中AR mRNA水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05),提示AR轉(zhuǎn)染成功。同時(shí),LNCaP細(xì)胞中LINC01126水平也隨之增加,與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05),提示雄激素增加可誘導(dǎo)LINC01126水平升高,見表1。

2.4各組LNCaP細(xì)胞增殖比較 空白組與對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)LNCaP細(xì)胞的OD值相比均無顯著差異(P>0.05)。轉(zhuǎn)染組不同時(shí)間點(diǎn)LNCaP細(xì)胞OD值均顯著高于空白組、對(duì)照組(P<0.05),見表1。

2.5各組LNCaP細(xì)胞遷移及侵襲比較 空白組與對(duì)照組LNCaP細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)量無差異(P>0.05)。轉(zhuǎn)染組LNCaP細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)量顯著高于空白組、對(duì)照組(P<0.05),見表1、圖1。

2.6各組LNCaP細(xì)胞凋亡率比較 空白組LNCaP細(xì)胞凋亡率〔(6.54±0.58)%〕與對(duì)照組〔(6.12±0.64)%〕相比無顯著差異(t=1.191,P=0.261)。轉(zhuǎn)染組LNCaP細(xì)胞凋亡率〔(0.15±0.03)%〕顯著低于對(duì)照組(t=22.820,P<0.001),見圖2。

表1 各組LINC01126、AR mRNA水平、OD值、遷移及侵襲數(shù)量比較

圖1 各組LNCaP細(xì)胞侵襲及遷移(結(jié)晶紫染色,×200)

圖2 各組LNCaP細(xì)胞凋亡率

2.7各組LNCaP細(xì)胞Warburg效應(yīng)比較 空白組〔(3.26±0.21)、(4.84±0.31)mmol/L〕與對(duì)照組LNCaP細(xì)胞葡萄糖攝取量及乳酸生成量〔(3.01±0.32)、(4.62±0.43)mmol/L〕比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。轉(zhuǎn)染組LNCaP細(xì)胞葡萄糖攝取量及乳酸生成量〔(6.42±0.67)、(9.36±0.72)mmol/L〕顯著高于空白組、對(duì)照組(t=11.020、14.120,P<0.05)。

3 討 論

研究表明〔9〕,雄性激素是誘導(dǎo)的PCa患者死亡的主要原因。雄激素誘導(dǎo)PCa的主要機(jī)制可能是〔10〕:AR基因增加,促進(jìn)了腫瘤雄性激素增加,從而增加對(duì)抗雄激素藥物產(chǎn)生應(yīng)答;通過改變AR相關(guān)作用,使得突變的AR被激活,通過改變相關(guān)因子的表達(dá)與功能,從而使AR異常活化,促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。本研究提示,盡管LINC01126在PCa中特異性表達(dá)的機(jī)制尚不明確,但LINC01126與PCa病情發(fā)展聯(lián)系密切。將其轉(zhuǎn)染至列腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),在雄激素受體AR水平升高的同時(shí),LINC01126表達(dá)增加,這提示,LINC01126與AR可能存在一定的調(diào)控關(guān)系,本文進(jìn)一步研究提示,AR水平的增加通過影響LINC01126表達(dá)促進(jìn)PCa的發(fā)展。在浦洪雷等〔11〕的實(shí)驗(yàn)中提出,高表達(dá)的LINC01126促進(jìn)前列腺癌的發(fā)展,減少癌細(xì)胞凋亡。曾穎科等〔12〕研究中提出,AR受體水平增加會(huì)使雄性激素水平增加,AR的表達(dá)與PCa細(xì)胞的惡性程度呈正相關(guān)。胡晶晶等〔13〕研究中提出,雄激素受體AR與長(zhǎng)鏈非編碼RNA PCRL存在一定的調(diào)控關(guān)系,AR通過提高PCRL水平可促進(jìn)PCa的發(fā)展,減少癌細(xì)胞凋亡。本研究與上述研究結(jié)果相似,因此本文推測(cè),雄性激素可能通過誘導(dǎo)LINC01126水平增加,促進(jìn)PCa細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移并抑制凋亡。

Warburg效應(yīng)是腫瘤代謝異常的表現(xiàn),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移〔14,15〕。這種能量代謝方式的轉(zhuǎn)變受許多復(fù)雜因素的調(diào)控,主要表現(xiàn)為增強(qiáng)糖酵解作用,抑制線粒體的氧化磷酸化。其中,葡萄糖的極大吸收和乳酸生成是腫瘤Warburg效應(yīng)的重要特征〔16〕。研究顯示〔17〕,腫瘤將大量乳酸釋放到細(xì)胞外時(shí),由于細(xì)胞內(nèi)的乳酸濃度比率發(fā)生變化,使得免疫細(xì)胞不能釋放自身乳酸,從而使自身乳酸窒息而亡,導(dǎo)致免疫逃逸,從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)中給予AR轉(zhuǎn)染后,LINC01126水平增加同時(shí)癌細(xì)胞代謝的乳酸生成量及葡萄糖攝取量明顯增加。吳守振等〔18〕研究提出,在PCa中葡萄糖攝取量及乳酸生成量會(huì)增加,通過抑制Warburg效應(yīng),可抑制癌細(xì)胞的活性。張勇等〔19〕在實(shí)驗(yàn)中提出,長(zhǎng)鏈非編碼 lncRNA-p21通過增強(qiáng)PCa Warburg效應(yīng),促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖及遷移能力。本研究與上述研究結(jié)果類似,因此本文推測(cè),雄性激素可能是通過誘導(dǎo)LINC01126水平增加后,增強(qiáng)了Warburg效應(yīng),從而促進(jìn)了PCa細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移能力并減少細(xì)胞凋亡。