雞血藤萃取部位的抗腫瘤活性篩選

李童 謝欣 李麗媛 李愛鵬 雷智冬 黃鎖義

(1右江民族醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院,廣西 百色 533000;2廣西中醫(yī)藥大學藥學院;右江民族醫(yī)學院 3藥學院;4廣西高校右江流域特色民族藥研究重點實驗室)

雞血藤廣泛分布于福建、廣西和廣東等地,其味苦,性溫,其常用來治療女性痛經(jīng)、閉經(jīng)和月經(jīng)不調(diào)等癥,不僅可以補血活血,而且可以舒筋活絡(luò)。現(xiàn)代藥理學證明,雞血藤具有促進造血功能、抗腫瘤、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、對酪氨酸酶雙向調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)靜催眠等藥理作用〔1〕,特別是在促進造血功能方面。在抗氧化方面雞血藤具有較強的效果,黃酮類化合物作為雞血藤的主要活性成分,具有很強的清除自由基和抗氧化的活性。研究表明,雞血藤不僅可以增強人的免疫能力,還能提高抗病能力,這都源于其較的強抗氧化能力和豐富的藥理作用,其有著非常強的應(yīng)用前景和研究價值〔2〕。有研究〔3,4〕對雞血藤的乙酸乙酯部位及雞血藤的組方提取物對抗腫瘤作用進行研究,發(fā)現(xiàn)其乙酸乙酯部位及組方提取物均可抑制腫瘤細胞活力,且都存在明顯優(yōu)勢,其可能是通過阻斷血小板衍生生長因子(PDGF)-B的釋放并逆轉(zhuǎn)小鼠結(jié)腸癌細胞MC38-血小板的相互作用的這一過程中上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的增強,其中以乙酸乙酯部位作用最強來作為其抗腫瘤的作用機制。目前對雞血藤作用的研究大多停留在抗炎、保護心血管系統(tǒng)、抗氧化等藥理作用、化學成分研究和分子鑒定等方面,臨床常用于治療貧血、血液系統(tǒng)疾病、婦科疾病等,對其各個部位抗腫瘤活性的研究非常少。本實驗研究雞血藤乙醇提取物的4個萃取部位對SGC-7901、MCF-7和BEL-7404細胞抗腫瘤活性的影響。

1 材料與方法

1.1材料 細胞:胃癌(SGC-7901)、人乳腺癌(MCF-7)和人肝癌(BEL-7404)均采購于中國科學院昆明細胞庫。試劑和藥品:從百色市田林縣隸屬于廣西壯族自治區(qū)采購雞骨草,經(jīng)右江民族醫(yī)學院覃道光副教授鑒定為豆科植物廣州相思子的干燥全株雞骨草藥材。碧云天公司生產(chǎn)的CCK-8試劑盒。美國Gibco公司生產(chǎn)的DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640,美國GEMINI公司生產(chǎn)的胎牛血清(FBS)。儀器:DMi8M倒置顯微鏡,德國Leica公司產(chǎn)品,Mithras LB 943多功能酶標儀,德國Berthold公司產(chǎn)品。

1.2雞血藤各部位的提取 以常規(guī)方法將晾干的雞骨草全草粉碎成小顆粒,制備成25 kg,用6倍量體積的乙醇(95%)按照以下實驗步驟進行回流提取,并加熱回流在80 ℃恒溫水浴條件下,每次2 h,重復(fù)3次,將濾液合并之前先進行抽濾,回收溶劑于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器內(nèi),得到浸膏,加入等體積的純水,形成混懸液,再用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次進行萃取,分別抽濾合并石油醚、正丁醇、乙酸乙酯和水溶劑萃取液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑,得到乙酸乙酯和水溶劑萃取液、正丁醇和石油醚4個溶劑的浸膏,即正丁醇萃取物、乙酸乙酯萃取物及水溶劑提取物和石油醚萃取物,然后在真空冷凍干燥機進行干燥,保存于4 ℃冰箱中,備用。使用前用二甲基亞砜(DMSO)溶解后再用完全培養(yǎng)基調(diào)整至實驗所需的濃度,現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.34個樣品對SGC-7901、MCF-7和BEL-7404細胞增殖抑制作用

1.3.1細胞的培養(yǎng)與鋪板 胃癌(SGC-7901)、人乳腺癌(MCF-7)和人肝癌(BEL-7404)3種癌細胞的培養(yǎng)條件:含10%胎牛血清(FBS)、1×青鏈霉素的RPMI1640和DMEM培養(yǎng)基,靜置狀態(tài)下培養(yǎng)于飽和濕度培養(yǎng)箱中條件為37 ℃、5%CO2。取對數(shù)生長期的3種腫瘤細胞株,用胰酶消化并計數(shù),調(diào)整細胞濃度為5×104個/ml,100 μl等量接種于96孔板,在培養(yǎng)箱中靜置24 h,待細胞貼壁生長,給藥前觀察細胞生長狀態(tài)(細胞狀態(tài)生長良好)。

1.3.2藥物分組與給藥 每株細胞分空白對照組、調(diào)零組、陰性對照組和實驗組。僅富含培養(yǎng)液的調(diào)零組,含培養(yǎng)液及細胞液的空白對照組,含培養(yǎng)液、細胞液及藥物的實驗組,含細胞液及含對應(yīng)實驗組中各濃度DMSO的培養(yǎng)液的陰性對照組〔2〕。培養(yǎng)24 h后,待細胞貼壁生長,然后繼續(xù)培養(yǎng)更換為含不同濃度的(每孔加入100 μl培養(yǎng)基,培養(yǎng)基含不同藥物濃度)藥物的培養(yǎng)基,48 h后觀察結(jié)果,每種萃取物由低到高分為6組(0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60 μg/ml)。調(diào)零組、對照組和實驗組均設(shè)3個復(fù)孔。

1.3.3以CCK8法檢測細胞活力 藥物作用48 h后,觀察其生長狀態(tài),并棄去舊的培養(yǎng)基,讀取每個孔的OD值于450 nm處前先避光孵育1～2 h于37 ℃條件前每孔加入DMEM液90 μl或DMEM液90 μl。通過GraphPad Prism5軟件計算藥物作用于3種細胞株(SGC-7901、MCF-7和BEL-7404)的半抑制濃度(IC50)值。

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗和方差分析。

2 結(jié) 果

2.1比較4種組分對SGC-7901、MCF-7、BEL-7404細胞株增殖的抑制作用 雞血藤4個萃取部位均可抑制3種腫瘤細胞的生長,腫瘤細胞的存活率與給藥濃度呈反比,4種萃取組分中,正丁醇萃取部位對3種腫瘤細胞抗腫瘤活性最好(P<0.05),雞血藤乙醇提取物的石油醚、正丁醇、乙酸乙酯和水溶劑萃取部位體外抗腫瘤活性大小依次為:正丁醇萃取部位>水溶劑萃取部位>乙酸乙酯萃取部位>石油醚萃取部位。見表1。

2.2比較4個萃取部位對SGC-7901、MCF-7、BEL-7404細胞株的IC50值 雞血藤正丁醇萃取部位對SGC-7901、MCF-7、BEL-7404細胞的體外增殖均有明顯抑制作用,其細胞存活率隨著藥物濃度增大從而減小。正丁醇萃取物對3種腫瘤細胞人胃癌(SGC-7901)、人乳腺癌(MCF-7)和人肝癌(BEL-7404)細胞的IC50值最低,提示其對3種細胞的增殖抑制作用最好。見表1。

表1 雞血藤4個萃取部位對SGC-7901、MCF-7、BEL-7404細胞增殖的影響

3 討 論

廣西壯族自治區(qū)作為我國藥材資源極其豐富的地區(qū),其中許多藥物在預(yù)防和治療腫瘤方面具有一定療效〔5〕。抗腫瘤藥物主要通過抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移、破壞細胞的DNA結(jié)構(gòu)、影響腫瘤微環(huán)境及誘導(dǎo)其凋亡等途徑,從而起到抑制作用。天然免疫系統(tǒng)是幫助宿主抵抗病原體入侵的第一道防線,巨噬細胞、淋巴細胞在天然免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用,能夠抵抗微生物感染、預(yù)防癌癥和免疫疾病的發(fā)生。雞血藤有抗貧血的功效,其有效部位的作用可能是通過調(diào)節(jié)促紅細胞生成素水平和促進機體分泌白細胞介素(IL)-3。雞血藤黃酮類化合物具有直接的抗腫瘤作用,其水提取物能抑制6種癌癥細胞增殖。雞血藤黃酮部位改變A549細胞丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、活性氧(ROS)水平,通過誘導(dǎo)腫瘤細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮抗腫瘤作用。綜上,雞血藤治療肝細胞癌的作用機制為雞血藤中眾多有效成分調(diào)控肝細胞癌的相關(guān)基因,從而影響多種信號通路,最終在多種信號通路的綜合作用下,人體表現(xiàn)出相應(yīng)的表型〔6〕。

唐旗羚等〔7〕實驗結(jié)果表明,雞血藤組方提取物可抑制骨肉瘤143B細胞、肺癌A549細胞和急性早幼粒細胞白血病HL60等細胞;程悅等〔8〕對雞血藤提取物干預(yù)后的乳腺癌MCF-7和結(jié)腸癌HT-29細進行測定,發(fā)現(xiàn)正丁醇萃取物可能明顯抑制這兩種細胞的生長〔5〕,且抑制活性最強。有研究〔9〕發(fā)現(xiàn),雞血藤正丁醇部位、乙酸乙酯部位和水提取部位對腫瘤細胞均有很強的抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移和侵襲的作用,并得出以乙酸乙酯部位抑制腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用最強,與本實驗結(jié)果一致。雞血藤提取物含藥學清對Hela細胞有抑制作用〔10〕。

本研究結(jié)果表明,雞血藤乙醇提取物正丁醇萃取部位是抗腫瘤活性最佳的部位。本課題組對雞血藤等壯藥藥材的抗氧化研究已經(jīng)做了大量前期研究和鋪墊工作,在此基礎(chǔ)上,現(xiàn)進一步對其雞血藤的抗腫瘤作用進行研究,并篩選出其活性部位,為進一步分離抗腫瘤活性單體化合物及研究抗腫瘤作用機制奠定堅實的基礎(chǔ),后期可參考劉森等〔11～13〕試驗設(shè)計,探討其作用機制。