祛風清熱涼血方介導CTGF、TGFβ1參與銀屑病的治療

馬曉惠 王增強 程曉蕾 毛婷婷 陳宏

(天津市人民醫院皮膚科,天津 300121)

銀屑病是由免疫介導的嚴重影響患者的身心健康和生活質量的慢性、炎癥性、復發性、系統性疾病〔1〕。其發病機制尚未明確,遺傳、免疫、環境、精神等因素均可能是其發病因素。近年來研究發現其發病可能與角質形成細胞的過度增殖、炎癥細胞的浸潤和新生血管的形成有關〔2〕。銀屑病皮損處存在血管異常和微循環障礙,而銀屑病的病理過程最早發生于真皮血管的異常增生〔3〕,所以對銀屑病機制的研究越來越多的集中在血管新生對銀屑病的影響。轉化生長因子(TGF)β1具有免疫抑制作用,是角質形成細胞(KC)的負調控因子,通過 TGFβ1/活化素受體樣激酶(ALK)1/Smad同源物1/5重組蛋白(Smad1/5)途徑參與新生血管形成〔4〕。銀屑病、傷口愈合障礙、瘢痕形成及皮膚腫瘤等多種皮膚病的發病機制均與TGFβ1表達異常有關〔5〕。結締組織生長因子(CTGF)一方面可通過改變細胞外基質(ECM)的結構或穩定性,促進血管的新生。另一方面,CTGF也可以促進膠原蛋白合成,進而合成ECM,支持新形成的血管床結構〔6〕。CTGF是TGFβ1的下游介質,CTGF與TGFβ1具有較為相似的生物學特征并相互作用〔7〕。

有研究報道,祛風清熱涼血方對尋常型銀屑病血熱毒熱證患者療效確切,但其作用機制尚不清楚〔8〕。本研究通過分析銀屑病面積嚴重程度指數(PASI)評分及外周血中CTGF、TGFβ1水平以探討祛風清熱涼血方治療銀屑病的潛在機制。

1 材料與方法

1.1病例診斷及入選標準 選取2018年1月至2019年7月天津市人民醫院皮膚性病科就診患者40例(治療組),依據中國銀屑病診療指南(2018完整版)〔9〕制定的尋常型銀屑病診斷標準,治療前1個月未服用或外用其他治療銀屑病藥物者。男25例,女15例,年齡23～78歲,平均(45.50±17.26)歲。8 w后隨訪治療組20例,失訪率約為50%,失訪原因涉及皮損消退及病情好轉自動停用中藥、旅居外地、更改其他治療方案等。健康對照組20 例,均來自同期在天津市人民醫院體檢的正常健康人,其中男11例,女9例,年齡24～59歲,平均年齡(33.90±8.78)歲。兩組性別、年齡差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。入組對象均簽署知情同意書,且本研究經過醫院醫學倫理委員會審查通過。

1.2排除標準 嚴重的心肺功能不全、嚴重的心律失常者;合并嚴重感染、惡性腫瘤、自身免疫病、肝、腎、神經、造血系統等嚴重原發性疾病者;妊娠、哺乳期婦女;嚴重內臟功能不全、傳染性疾病;對本課題中藥制劑過敏者;中重度抑郁或精神病患者等不能配合治療方案者。退出實驗:不按規定按時服藥者;自行合并使用對研究治療有影響藥物的受試者;因嚴重不良事件必須停止治療者;無不良反應但因其他原因而中斷治療者。

1.3標本免疫組織化學染色 采用免疫組織化學染色方法檢測CTGF、TGFβ1在兩組中的表達。染色步驟按照鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法(SP)試劑盒方法,磷酸鹽緩沖液(PBS)液代替一抗作陰性對照。 一抗為兔抗人CTGF多克隆抗體(工作濃度為1∶300)及兔抗人TGFβ1多克隆抗體(工作濃度為1∶200)。 石蠟切片常規脫蠟至水,抗原修復10 min (98 ℃),5 ml/L過氧化氫封閉30 min(37 ℃),山羊血清封閉30 min (37 ℃),一抗過夜(4 ℃),二抗30 min(37 ℃),三抗30 min(37 ℃),二氨基聯苯胺(DAB)顯色3 min,蘇木素染色4 min,鹽酸酒精分化5 s,自來水沖洗40 min,脫水、透明、封片。以健康對照組皮膚組織為陰性對照。用顯微鏡(OLYMPUS BX51)采集圖片,用圖像分析軟件(Image-Pro Plus6.0)測定陽性細胞光密度值及染色面積。每張切片隨機選取3個視野(400倍)分別測定記錄陽性細胞的累積光密度值(IOD)和面積(area)值,計算出平均光密度(IOD/area)值,平均光密度值越大代表兩因子相對表達量越高。

1.4治療方法 治療組給予中藥湯劑祛風清熱涼血方,方藥組成:赤芍10 g,金銀花15 g,黃柏10 g,白茅根20 g,炒牛蒡子10 g,生地20 g,連翹15 g,知母10 g,黃芩10 g,白鮮皮10 g,玄參10 g,苦參10 g,荊芥15 g,升麻2.5 g,甘草5 g,防風10 g。每日1劑,水煎分早晚2次溫服。連續治療8 w。同時配合鹵米松,卡泊三醇外用。治療前,治療4、8 w后各抽血樣離心的血清,另收集健康對照組外周血清保存于-80 ℃冰箱。

1.5療效評判 皮損情況根據PASI評分法評分,治療前及治療4、8 w后分別進行1次PASI評分。分值0～72分〔10〕。

1.6實時熒光定量PCR(qPCR) 參照Trizol試劑(美國Invitrogen公司)說明書進行總RNA的提取。采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis試劑盒(美國Thermo公司)將總RNA逆轉錄為cDNA,再進行qPCR檢測。實時熒光定量PCR特異性引物序列:GAPDH正義:5′-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3′,反義:5′-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′,CTGF正義:5′-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′,反義:5′-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′,TGFβ1正義:5′-ACACCAACTATTGCTTCAG-3′,反義:5′-ACAC CAACTATTGCTTCAG-3′。采用熒光定量PCR儀(美國ABI公司)進行相對定量分析。GAPDH作為內參,采用2-ΔΔCt公式對CTGF、TGFβ1基因表達進行相關計算。每組試驗重復3次。

1.7CTGF、TGFβ1水平檢測 采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA),操作步驟按試劑盒說明書。

1.8統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、秩和檢驗、χ2檢驗、Pearson相關分析。

2 結 果

2.1兩組CTGF、TGFβ1表達 健康對照組CTGF和TGFβ1在表皮全層及真皮中通常無表達或較低表達;治療組皮損組織中CTGF和TGFβ1呈顯著高表達(P<0.001),可見表皮角化不全,棘細胞層明顯增厚,真皮毛細血管增生。見圖1、表1。

圖1 兩組皮膚組織GTFG、TGFβ1表達(免疫組化染色)

表1 兩組皮膚組織CTGF及TGFβ1表達比較

2.2祛風清熱涼血方可降低尋常型銀屑病患者PASI評分 治療組經祛風清熱涼血方治療4、8 w后PASI評分較首診顯著下降(t=9.162、12.556,均P<0.05)。見表2。

2.3祛風清熱涼血方可降低尋常型銀屑病患者外周血CTGF、TGFβ1表達 治療組首診和治療4 w血清中CTGF、TGFβ1表達量明顯高于健康對照組(P<0.05),首診、治療4、8 w CTGF、TGFβ1表達量呈逐漸下降趨勢,治療4 w與首診,治療8 w與首診相比,差異均存在統計學意義(P<0.05)。ELISA結果顯示,首診、治療4、8 w治療組CTGF、TGFβ1 mRNA明顯高于健康對照組(P<0.05),且治療4、8 w顯著低于首診(P<0.05)。見表2。

表2 治療組首診、治療4、8 w PASI評分及兩組CTGF、TGFβ1表達比較

2.4CTGF、TGFβ1表達水平與尋常型銀屑病患者PASI評分相關性 尋常型銀屑病患者CTGF與TGFβ1呈顯著正相關(r=0.802),外周血CTGF表達水平(r=0.903)、TGFβ1表達水平與PASI評分均呈顯著正相關(r=0.545,均P<0.001)。

3 討 論

銀屑病是以局限或全身分布的鱗屑性紅斑或斑塊為典型臨床表現,銀屑病皮損的組織病理表現為表皮角化過度、角化不全、棘層肥厚,真皮乳頭血管擴張和淋巴細胞為主的炎細胞浸潤〔11〕。故多數研究認為其發病與角質形成細胞的過度增殖、炎癥細胞的浸潤和新生血管的形成有關,且最先發生病變的為微血管的形成,而隨著疾病的緩解這種血管新生的病理改變也會隨之消退〔12〕。

CTGF是血管重構的必要因子,本研究結果顯示,尋常型銀屑病患者血清中CTGF呈高表達,且隨著病情的好轉,CTGF的表達亦逐漸下降。考慮其機制可能由于CTGF的高表達,從而促進了血管新生,導致并加重了銀屑病的皮損〔13〕。TGFβ1可以通過刺激成纖維細胞的增殖,誘導血管新生及舒張,從而參與銀屑病的發生〔14〕。報道顯示TGFβ1能夠通過對Smads通路的激活而提升CTGF的表達量,CTGF表達上調則會進一步激活TGFβ1和增強其的生物學效應〔7〕。

銀屑病屬中醫學“白疕”范疇,本方由祛風清熱解毒藥和涼血活血藥組成,現代藥理研究表明,祛風清熱解毒類中藥具有抗菌消炎,調節免疫和抑制表皮細胞過度增殖作用〔15〕。涼血活血類中藥具有促進組織的修復與再生,調節機體細胞因子的水平和抗血管新生的作用〔16〕。之前的研究發現祛風清熱涼血方治療能夠明顯改善銀屑病患者的PASI評分,中藥辨證治療銀屑病療效肯定〔9〕,但是由于缺乏足夠的現代分子生物學證據得不到廣泛推廣和運用。 本研究顯示隨著中藥祛風清熱涼血方對患者癥狀和證候的改善,外周血CTGF、TGFβ1表達水平下調,這意味著祛風清熱涼血方可能通過介導銀屑病患者CTGF、TGFβ1的表達下調發揮治療作用,推測中藥可能通過抑制血管新生相關因子,從而糾正銀屑病患者天然免疫功能紊亂,抑制變態免疫反應,進而抑制銀屑病患者角質形成細胞的增殖,達到治療作用。但這些推測有待進一步的細胞生物學相關實驗研究探索相關因子作用通路,以確定血管新生在銀屑病中的確切機制及中藥的具體作用靶點。