黃芩素通過(guò)抑制NF-κB/STAT3/ERK信號(hào)通路改善過(guò)敏性鼻炎小鼠的炎癥反應(yīng)

胡青 顏微微 王文廣 彭凌艷

(湖北省中醫(yī)院 1健康管理中心,湖北 武漢 430074;2耳鼻喉科;3兒科)

過(guò)敏性鼻炎是一種常見的呼吸系統(tǒng)疾病,由免疫球蛋白(Ig)E、IgG1等介導(dǎo)和炎癥相關(guān)細(xì)胞及因子參與生成,在全球范圍內(nèi)具有很高的發(fā)病率,發(fā)病后往往難根治,逐漸形成慢性病狀,長(zhǎng)期影響患者的呼吸功能,對(duì)日常生活造成極大的困擾,嚴(yán)重時(shí)還會(huì)產(chǎn)生一系列并發(fā)癥,引發(fā)鼻竇炎、支氣管哮喘等〔1〕。過(guò)敏性鼻炎可由多種因素誘導(dǎo)產(chǎn)生,食用或吸入致敏物質(zhì)、先天遺傳、空氣污染和體外感染均可誘導(dǎo)該疾病的發(fā)作,目前主要通過(guò)抗炎類治療藥物延緩發(fā)作,減輕病情〔2〕。開發(fā)具有針對(duì)性的治療藥物成為當(dāng)前的重中之重。已知過(guò)敏性鼻炎受多種影響因子的調(diào)控,核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB是調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要調(diào)控因子,可參與影響神經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),促進(jìn)炎癥相關(guān)因子表達(dá),加劇炎癥反應(yīng)〔3〕。信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中同樣發(fā)揮重要作用,在加速神經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的同時(shí),增強(qiáng)炎癥相關(guān)因子的表達(dá)水平〔4〕。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)表達(dá)也被證實(shí)可促進(jìn)炎癥因子釋放,加劇炎癥反應(yīng)擴(kuò)散〔5〕。黃芩素是一種常見的重要提取物,是黃芩中的主要有效成分,具有抗病毒、抗炎、抗血小板凝結(jié)等多種藥物作用,已被證實(shí)對(duì)于炎癥引發(fā)的多種疾病具有良好的治療效果〔6〕。黃芩素可以顯著抑制多種因素引發(fā)的肺部炎癥,以黃芩素為主要成分的蒼耳子鼻炎膠囊已被應(yīng)用于治療鼻炎〔7〕,推測(cè)黃芩素對(duì)于過(guò)敏性鼻炎具有良好的治療效果,但仍需實(shí)驗(yàn)加以證實(shí),具體的作用途徑也有待進(jìn)一步探索。本研究通過(guò)構(gòu)建過(guò)敏性鼻炎小鼠模型,探究黃芩素是否通過(guò)調(diào)控NF-κB/STAT3/ERK信號(hào)通路參與治療相關(guān)疾病。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 氯雷他定(國(guó)藥準(zhǔn)字H20040393)購(gòu)于昆明積大制藥股份有限公司,黃芩素(貨號(hào)DH0024)購(gòu)于成都德思特生物科技有限公司,NF-κB激活劑脂多糖(LPS,貨號(hào)QN0166)購(gòu)于百奧萊博生物科技有限公司,ERK激活劑DMU-212(貨號(hào)HY-137977)購(gòu)于MCE公司,卵清蛋白(OVA,貨號(hào)LQ104622)購(gòu)于酷爾化學(xué)科技有限公司,氫氧化鋁(貨號(hào)145300)購(gòu)于上海江萊生物科技有限公司,白細(xì)胞介素(IL)-12酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)BMS616)購(gòu)于北京諾為生物科技有限公司,血清腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)TW8111)購(gòu)于上海通蔚科技有限公司,IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)ml063160)購(gòu)于上海酶聯(lián)生物科技有限公司,Diff染色試劑盒(貨號(hào)LM-364D)購(gòu)于上海聯(lián)邁生物工程有限公司,蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(貨號(hào)AR1180)購(gòu)于博士德生物科技有限公司,磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體(貨號(hào)ab9485)、NF-κB p65抗體(貨號(hào)ab239882)、NF-κB p-p65抗體(貨號(hào)ab76302)、STAT3抗體(貨號(hào)ab76315)、ERK抗體(貨號(hào)ab32537)、p-ERK抗體(貨號(hào)ab201015)購(gòu)于Abcam公司,熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(7500,ABI公司),凝膠成像系統(tǒng)(CA-268,上海精密儀器儀表有限公司)。

1.2構(gòu)建動(dòng)物模型 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)自河南環(huán)宇康禾生物科技有限公司〔許可證號(hào)SCXK(豫)2020-0004〕,72只SPF級(jí)BALB/c小鼠,5周齡,平均體質(zhì)量(20±2)g。隨即將小鼠分為健康對(duì)照組、過(guò)敏性鼻炎組、氯雷他定組、黃芩素處理組、黃芩素+ERK激活組、黃芩素+NF-κB激活組,每組各12只。除健康對(duì)照組外,其余各組于1、5、10、15 d腹腔注射OVA 2.5 mg/kg和氫氧化鋁〔溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)〕50 mg/kg,健康對(duì)照組腹腔注射等劑量的生理鹽水。末次注射OVA致敏5 d后,除健康對(duì)照組外,各組每日OVA鼻內(nèi)激發(fā)(0.5 mg/鼻孔)1次,連續(xù)激發(fā)7 d,健康對(duì)照組不做處理。末次激發(fā)24 h后進(jìn)行過(guò)敏性鼻炎癥狀評(píng)分〔8〕。癥狀評(píng)分≥5時(shí)認(rèn)定為具有明顯過(guò)敏性鼻炎癥狀,為造模成功,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下:①抓撓情況:0分,無(wú)抓撓舉動(dòng);1分,有抓撓現(xiàn)象,但不頻繁;2分,出現(xiàn)頻繁性的抓撓現(xiàn)象;3分,反復(fù)抓撓并摩擦。②噴嚏情況:0分,觀察時(shí)間內(nèi)無(wú)打噴嚏;1分,觀察時(shí)間內(nèi)噴嚏數(shù)少于4個(gè);2分,觀察時(shí)間內(nèi)噴嚏數(shù)4～10個(gè);3分,觀察時(shí)間內(nèi)噴嚏不斷,噴嚏數(shù)多于10個(gè)。③鼻孔流涕情況:0分,無(wú)鼻孔流涕;1分,有鼻孔流涕現(xiàn)象,僅在鼻孔附近;2分,有鼻孔流涕現(xiàn)象,流至鼻孔下;3分,涕流滿面。癥狀評(píng)分為各觀察情況得分總和。評(píng)估結(jié)束后,氯雷他定組腹腔注射氯雷他定2 mg/kg,黃芩素處理組腹腔注射黃芩素40 mg/kg,黃芩素+ERK激活組腹腔注射黃芩素40 mg/kg和ERK激活劑DMU-212 10 mg/kg,黃芩素+NF-κB激活組腹腔注射黃芩素40 mg/kg和NF-κB激活劑LPS 20 mg/kg,健康對(duì)照組、過(guò)敏性鼻炎組腹腔注射等劑量的生理鹽水。1次/d,連續(xù)注射10 d,末次注射24 h后進(jìn)行過(guò)敏性鼻炎癥狀評(píng)分。

1.3炎性細(xì)胞及相關(guān)因子檢測(cè) 過(guò)敏性鼻炎癥狀評(píng)分結(jié)束后麻醉各組小鼠,從氣管處插入導(dǎo)管直至鼻咽部,用1 ml生理鹽水清洗鼻腔,收集液體,多次重復(fù)操作后收集鼻腔灌洗液,4 ℃ 6 000 r/min離心5 min,收集上層清液用于檢測(cè)炎癥相關(guān)因子水平。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)各組鼻腔灌洗液中IL-12、TNF-α、IL-6水平。細(xì)胞沉淀重懸于PBS中,按照Diff染色試劑盒說(shuō)明書方法進(jìn)行染色,置于顯微鏡下利用血球計(jì)數(shù)法觀察并計(jì)數(shù),記錄不同類型細(xì)胞數(shù)。

1.4染色觀察鼻黏膜組織病理學(xué)變化 收集鼻腔灌洗液后迅速處死各組小鼠,剪下各組鼻組織,剝離鼻黏膜組織,部分用4%多聚甲醛固定,部分剪碎后液氮處理研磨成粉末,凍存于冰箱備用。組織固定24 h后取出,不同濃度酒精脫水處理,石蠟常規(guī)包埋制作切片,厚度為4 μm,脫蠟至水后按照HE染色試劑盒說(shuō)明書染色,酒精再次脫水處理,中性樹脂封片,置于顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5鼻黏膜組織NF-κB、STAT3、ERK蛋白檢測(cè) 取出凍存?zhèn)溆玫谋丘つそM織粉末,加入蛋白裂解液后振蕩,充分裂解蛋白,加入蛋白提取液提取總蛋白并檢測(cè)濃度,與上樣緩沖液混合后加熱變性,加入凝膠孔道中電泳跑膠,取出經(jīng)半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜,脫脂牛奶封閉2 h,加入一抗(GAPDH抗體、NF-κB p65抗體、ERK抗體、NF-κB p-p65抗體、p-ERK抗體,1∶1 000),4 ℃孵育過(guò)夜。Tris鹽酸緩沖液吐溫(TBST)清洗3次后加入二抗(1∶400),室溫下孵育40 min,TBST清洗3次,混合發(fā)光試劑A液和B液,均勻倒于膜上,短暫處理,取出后擦干多余水分,置于Syngene光密度掃描系統(tǒng)上掃描,分析條帶灰度。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件行單因素方差分析(one-way ANOVA)和SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1黃芩素對(duì)過(guò)敏性鼻炎小鼠炎性細(xì)胞及相關(guān)因子含量的影響 與健康對(duì)照組相比,過(guò)敏性鼻炎組鼻腔灌洗液中IL-12、TNF-α、IL-6含量和血清中IgE、IgG1含量顯著升高,嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著升高(P<0.05);與過(guò)敏性鼻炎組相比,氯雷他定組、黃芩素處理組鼻腔灌洗液中IL-12、TNF-α、IL-6含量和血清中IgE、IgG1含量顯著降低,嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著降低(P<0.05);與黃芩素處理組相比,黃芩素+ERK激活組、黃芩素+NF-κB激活組鼻腔灌洗液中IL-12、TNF-α、IL-6含量和血清中IgE、IgG1含量顯著升高,嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著升高(P<0.05);氯雷他定組與黃芩素處理組鼻腔灌洗液中以上指標(biāo)無(wú)顯著差異(P>0.05),見表1、表2。

表1 各組鼻腔灌洗液IL-12、TNF-α、IL-6和血清IgE、IgG1含量比較

表2 各組鼻腔灌洗液中不同細(xì)胞數(shù)量比較

2.2治療前后過(guò)敏性鼻炎癥狀評(píng)分比較 治療前后,與健康對(duì)照組相比,過(guò)敏性鼻炎組過(guò)敏性鼻炎癥狀評(píng)分顯著升高(P<0.05)。與治療前相比,治療后過(guò)敏性鼻炎組、氯雷他定組、黃芩素處理組、黃芩素+ERK激活組、黃芩素+NF-κB激活組過(guò)敏性鼻炎癥狀評(píng)分顯著降低(P<0.05)。治療后,與過(guò)敏性鼻炎組相比,氯雷他定組、黃芩素處理組過(guò)敏性鼻炎癥狀評(píng)分顯著降低(P<0.05);與黃芩素處理組相比,黃芩素+ERK激活組、黃芩素+NF-κB激活組過(guò)敏性鼻炎癥狀評(píng)分顯著升高(P<0.05);氯雷他定組與黃芩素處理組過(guò)敏性鼻炎癥狀評(píng)分無(wú)顯著差異(P>0.05),見表3。

2.3黃芩素對(duì)過(guò)敏性鼻炎小鼠鼻黏膜組織NF-κB、STAT3、ERK蛋白表達(dá)的影響 與健康對(duì)照組相比,過(guò)敏性鼻炎組鼻黏膜組織NF-κB p-p65/NF-κB p65、p-STAT3/STAT3、p-ERK/ERK顯著升高(P<0.05);與過(guò)敏性鼻炎組相比,氯雷他定組、黃芩素處理組鼻黏膜組織上述指標(biāo)顯著降低(P<0.05);與黃芩素處理組相比,黃芩素+ERK激活組鼻黏膜組織p-ERK/ERK顯著升高,黃芩素+NF-κB激活組鼻黏膜組織NF-κB p-p65/NF-κB p65、p-STAT3/STAT3顯著升高(P<0.05);氯雷他定組與黃芩素處理組鼻黏膜組織以上指標(biāo)無(wú)顯著差異(P>0.05),見表3、圖1。

表3 各組治療前后過(guò)敏性鼻炎癥狀評(píng)分及鼻黏膜組織NF-κB p-p65/NF-κB p65、p-STAT3/STAT3、p-ERK/ERK比較

1～6:健康對(duì)照組、過(guò)敏性鼻炎組、氯雷他定組、黃芩素處理組、黃芩素+ERK激活組、黃芩素+NF-κB激活組圖1 各組鼻黏膜組織NF-κB、STAT3、ERK、 NF-κB p-p65、p-STAT3、p-ERK蛋白表達(dá)

2.4黃芩素對(duì)過(guò)敏性鼻炎小鼠鼻黏膜組織病理變化的影響 健康對(duì)照組鼻黏膜組織完整,上皮細(xì)胞完好,細(xì)胞間均勻排列,無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);過(guò)敏性鼻炎組鼻黏膜組織具有明顯病理學(xué)變化,上皮組織明顯缺損,細(xì)胞間間隙擴(kuò)大,有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);氯雷他定組、黃芩素處理組鼻黏膜組織逐漸恢復(fù),上皮組織增生,細(xì)胞間隙縮小,僅有少量炎性細(xì)胞存在;與黃芩素處理組相比,黃芩素+ERK激活組、黃芩素+NF-κB激活組鼻黏膜組織恢復(fù)較慢,上皮細(xì)胞數(shù)量較少,細(xì)胞間仍有大量空隙,充斥著大量炎性細(xì)胞,見圖2。

圖2 各組鼻黏膜組織病理(HE染色,×400)

3 討 論

過(guò)敏性鼻炎主要指由IgE、IgG1介導(dǎo)引發(fā)的炎癥反應(yīng),環(huán)境中存在的多種致敏物質(zhì)均可與特異性的IgE抗體結(jié)合,兩者進(jìn)一步發(fā)生反應(yīng)引發(fā)機(jī)體不適,而IgG1在過(guò)敏性炎癥中發(fā)揮重要作用,與炎癥因子結(jié)合加重炎癥反應(yīng)〔9〕。過(guò)敏性鼻炎伴隨著機(jī)體自身的免疫調(diào)節(jié)作用,引起陣發(fā)性噴嚏、鼻癢、鼻孔流涕等癥狀,可根據(jù)這些癥狀評(píng)判過(guò)敏性鼻炎的嚴(yán)重程度〔10〕。在自身免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中炎癥因子含量激增,細(xì)胞因子充斥在鼻黏膜附近,增強(qiáng)炎癥反應(yīng),加重患者病情。因此在評(píng)估表面癥狀的同時(shí),還可根據(jù)炎癥反應(yīng)檢測(cè)判斷病情〔11〕。本研究表明,構(gòu)建模型后小鼠存在明顯的炎癥反應(yīng),且伴隨明顯的過(guò)敏性鼻炎癥狀,構(gòu)模成功。

中醫(yī)藥治療近年來(lái)成為熱點(diǎn)話題,其中大部分中醫(yī)藥材具有良好的抗炎消菌作用,且無(wú)副作用,作用明顯且藥效持久。黃芩素是常見中藥材黃芩中的主要有效成分,被證實(shí)具有顯著的抗炎作用〔12〕。黃芩素可參與調(diào)控肺炎小鼠體內(nèi)炎癥相關(guān)因子含量,減少肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞數(shù)量,抑制肺部炎癥反應(yīng)從而緩解病情〔13〕。黃芩素與柴胡混合使用可減輕頭痛,清除病菌,已被應(yīng)用于治療鼻竇炎等多種呼吸性疾病〔14〕。結(jié)合以上研究,推測(cè)黃芩素可參與減輕過(guò)敏性鼻炎炎癥反應(yīng),緩解病情,并選用對(duì)鼻炎具有良好治療效果的氯雷他定作為陽(yáng)性對(duì)照評(píng)估黃芩素的治療效果〔15〕。本研究表明,黃芩素可以顯著減輕炎癥反應(yīng),改善過(guò)敏性鼻炎癥狀,緩解病情。有文獻(xiàn)指出,過(guò)敏性鼻炎會(huì)導(dǎo)致鼻黏膜組織充斥大量炎癥細(xì)胞,破壞組織結(jié)構(gòu),加劇炎癥反應(yīng)的同時(shí)激活體內(nèi)免疫反應(yīng),導(dǎo)致鼻孔流涕不止〔16〕。因此對(duì)于鼻黏膜組織的病理學(xué)觀察是探究相關(guān)疾病致病機(jī)制和恢復(fù)狀況的重要依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn),過(guò)敏性鼻炎組小鼠鼻黏膜組織具有明顯病理學(xué)變化,有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),而氯雷他定和黃芩素處理后,鼻黏膜組織逐漸恢復(fù),僅有少量炎性細(xì)胞存在,進(jìn)一步驗(yàn)證黃芩素的作用,但具體的作用途徑有待探索。

有研究指出,NF-κB是調(diào)控炎癥反應(yīng)的重要調(diào)控因子,參與介導(dǎo)多種疾病的炎癥反應(yīng)。NF-κB在過(guò)敏性鼻炎患者體內(nèi)高表達(dá),協(xié)助誘導(dǎo)產(chǎn)生大量炎癥因子〔17〕。NF-κB可進(jìn)一步促進(jìn)下游STAT3蛋白的表達(dá)和激活,如健脾益肺湯可通過(guò)調(diào)控NF-κB表達(dá),進(jìn)一步抑制STAT3的表達(dá),緩解哮喘大鼠的肺部炎癥〔18〕;新魚腥草素鈉也可抑制相關(guān)通路緩解小鼠炎癥性腸病〔19〕。ERK同樣參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控,研究發(fā)現(xiàn)促紅細(xì)胞生成素介導(dǎo)ERK的表達(dá),抑制其激活,從而緩解心肌梗死大鼠的炎癥反應(yīng),保護(hù)心肌細(xì)胞〔20〕。此外,黃芩素被證實(shí)可降低ERK、NF-κB、STAT3的磷酸化水平,抑制炎性細(xì)胞活性,從而改善小鼠腸炎〔21〕。因此推測(cè)黃芩素通過(guò)調(diào)控NF-κB/STAT3/ERK信號(hào)通路發(fā)揮作用。本研究表明,黃芩素很可能通過(guò)調(diào)控NF-κB/STAT3/ERK信號(hào)通路發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)黃芩素通過(guò)抑制NF-κB/STAT3/ERK信號(hào)通路蛋白的激活發(fā)揮作用。

綜上,黃芩素通過(guò)調(diào)控NF-κB/STAT3/ERK信號(hào)通路,抑制NF-κB p65、STAT3、ERK蛋白磷酸化,緩解炎癥反應(yīng),加速小鼠鼻黏膜組織恢復(fù),改善過(guò)敏性鼻炎癥狀,從而緩解病情。黃芩素是否通過(guò)調(diào)控其他通路間接參與影響過(guò)敏性鼻炎,仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)加以說(shuō)明。