電針對老年大鼠激素性股骨頭壞死骨細胞凋亡的影響

金紅光 石樁 王新華 尼瑪 付勇

(1江西中醫藥大學附屬醫院針灸科,江西 南昌 330006;2內蒙古民族大學附屬醫院骨傷科)

類固醇是非創傷性股骨頭壞死的主要誘發因素。隨著糖皮質激素在治療風濕性免疫性疾病中的廣泛應用,且我國老齡化人口增多,激素性股骨頭壞死(SANFH)患病率逐年增加,如不及時治療,最終可導致骨結構的塌陷。當前,SANFH 的發病機制并不明確,有研究表明激素導致的骨細胞凋亡與股骨頭壞死關系密切〔1〕。針灸在治療骨科疾病方面具有顯著作用〔2〕。電針屬于針灸的一種,也是傳統醫學針刺麻醉或針刺鎮痛的獨特治療方式,具有客觀、定量地設定刺激頻率和強度的優點。電針可影響細胞凋亡改善疾病狀態。電針調節大鼠肉瘤蛋白-原癌基因絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶-分裂原活化抑制劑(Ras-RaF-MEK)1/2-細胞外調節蛋白激酶(ERK)1/2信號通路抑制軟骨細胞凋亡〔3〕。電針足三里(ST36)和懸鐘(GB39)穴位可通過調節p53信號通路和誘導細胞凋亡,顯著改善大鼠佐劑性關節炎損傷〔4〕。電針可抑制脊髓損傷后細胞凋亡,減輕脊髓繼發性損傷,有利于神經功能的恢復〔5〕。然而,電針療法是否具有防治激素性股骨頭壞死作用尚不清楚。故本文擬采用脂多糖(LPS)聯合激素處理構建大鼠股骨頭壞死模型,并從細胞凋亡方面考察電針緩解SANFH的機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物 隨機選取健康雄性SD大鼠30只(6～8周齡、體質量200～220 g)。大鼠置于環境溫度為(25±2)℃、相對濕度為50%±10%、通風良好且晝夜交替12 h的屏障環境中適應1 w,將其飼養到80周齡。

1.2動物分組、模型構建 將大鼠隨機分成3組,每組10只,分別為:正常組、模型組和模型+電針組。采用LPS(Solarbio公司,L8880)聯合甲潑尼松龍(MPS,比利時輝瑞,AP5394)構建大鼠SANFH 模型〔6〕,具體方法:給大鼠臀肌注射慶大霉素16×104U/次,連續3次,每次間隔24 h;于第4、5天腹腔分別注射LPS(20 μg/kg),并在第5～7天臀肌注射劑量為40 mg/kg的 MPS,注射時間間隔24 h。第8天開始連續7 d臀肌注射慶大霉素16×104U/次。

1.3電針干預 模型構建成功后,模型+電針組每天用電針治療儀(蘇州醫療,SDZ-Ⅱ)依次電針環跳、居髎、陽陵泉(雙側穴位)穴位,強度0.5 mA,頻率2 Hz/15 Hz,每次30 min,總共電針25 d。然后處死大鼠,收集血液和股骨頭,將股骨頭分別保存于固定液和液氮中。

1.4組織病理學觀察 將股骨頭先用10%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣,接著浸入蒸餾水中清洗,最后以流水沖洗后采用蘇木素-伊紅(HE)染色〔8〕,光鏡下拍照觀察股骨頭組織病理學變化。

1.5實時熒光定量-聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測凋亡相關基因 取大鼠兩側股骨頭0.1 g,放入已裝有1 ml Trizol的離心管內,參照TRIzol試劑說明書提取股骨頭組織中總的RNA,再按照TaKaRa反轉錄試劑盒(RR047A)和熒光定量試劑盒(RR820A)對各組組織中B細胞淋巴瘤(Bcl)-2和Bcl-2相關X蛋白(Bax)mRNA表達情況進行定量,以2-△△Ct法計算目的基因相對表達量,引物序列見文獻〔7〕。

1.6TUNEL法觀察細胞凋亡數 參照文獻〔7,9〕所述方法,將股骨頭從固定液中取出,自來水沖洗,分別以不同濃度乙醇、二甲苯和石蠟脫水,再行石蠟包埋,切片機切厚度為5 μm切片;依次進行烤片(65 ℃ 2 h),二甲苯(10 min ×2次),不同濃度乙醇洗(100%、95%、80%,各5 min);37 ℃條件下以50 μg/ml蛋白酶 K孵育切片30 min,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次,每次5 min;根據TUNEL試劑盒操作說明書(碧云天生物,C1088),于熒光顯微鏡下觀察綠色陽性細胞數。

1.7免疫組化法觀察細胞凋亡相關蛋白 參照金紅光等〔7〕所述方法獲得脫水的大鼠股骨頭切片后,水洗,高壓抗原修復(3 min),滴加3% H2O2除過氧化物酶活性,PBS洗3次,每次5 min,室溫孵育盒內封閉2 h,分別加Bax(Abcam公司,ab32503)和Bcl-2(Abcam公司,ab196495)一抗工作液,稀釋比例均為1∶1 000,過夜孵育;PBS洗3次,每次5 min;室溫孵育二抗2 h;PBS洗3次,每次5 min;加辣根過氧化物酶,孵育15 min;再以含吐溫20的PBS(PBST)洗3次,每次5 min;最后加二氨基聯苯胺(DAB)顯色液,孵育100 s,于顯微鏡下觀察切片上的顏色變化;一旦出現棕色,以自來水沖洗切片;再依次進行蘇木素染色、分化、脫水和封片。顯微鏡下從每張切片中隨機選擇5個陽性視野,按如下公式計算陽性染色區的光密度值:陽性區平均光密度度值/陽性區面積=凋亡蛋白表達水平。

1.8Western印跡檢測 以液氮研磨股骨頭成粉末狀,以每0.1 g粉末加入1 ml放射免疫沉淀法裂解緩沖液(RIPA)裂解液置于離心管中,充分混合后于冰上孵育30 min;低溫高速離心10 min,收集上清并檢測蛋白濃度。取40 μg總蛋白依次進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、濕法轉膜、一抗溶液過夜孵育〔甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)濃度1∶2 000,Caspase-3濃度1∶1 000(Abcam公司,ab184787),Bcl-2濃度1∶1 000〕、漂洗、二抗溶液孵育2 h和成像系統內曝光拍攝;檢測蛋白條帶灰度值,目的蛋白相對表達量計算公式如下:目的蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值。

1.9統計學分析 采用GraphPad prism8.0軟件進行獨立樣本t檢驗和單因素方差分析。

2 結 果

2.1電針對大鼠激素性股骨頭壞死的影響 正常組股骨頭軟骨細胞排列規則整齊,周圍可見成骨細胞和少量破骨細胞,骨細胞內空骨陷窩和核固縮較少,未見壞死區。模型組股骨頭空骨陷窩增加,部分軟骨細胞呈簇狀肥大,排列不整齊,骨細胞內可見大量核固縮和壞死區。電針組股骨頭有少量空骨陷窩,軟骨細胞規則尚整齊。見圖1。

2.2電針對骨細胞凋亡的影響 與正常組骨細胞凋亡數〔(76.7±16.8)個〕比較,模型組骨細胞凋亡數〔(385.00±27.39)個〕顯著增加(t=16.640,P<0.000 1);與模型組比較,模型+電針組骨細胞凋亡數〔(217.7±33.6)個〕顯著減少(t=21.900,P=0.000 5)。見圖2。

圖1 各組股骨頭形態(HE染色,×100)

圖2 各組骨細胞凋亡(×100)

2.3電針對股骨頭組織中Bax和 Bcl-2蛋白表達的影響 與正常組比較,模型組Bax蛋白表達顯著升高(P<0.05);與模型組相比,模型+電針組Bax蛋白表達顯著降低(P<0.05)。而Bcl-2蛋白在模型組股骨頭組織中表達量顯著低于正常組(P<0.05);與模型組相比,模型+電針組Bcl-2蛋白表達顯著增加(P<0.05)。見圖3、表1。

2.4電針對骨細胞凋亡相關基因表達水平的影響 與正常組相比,模型組Bax mRNA表達水平顯著增加,Bcl-2 mRNA表達顯著減少(P<0.05);與模型組相比,模型+電針組Bax mRNA表達顯著降低,抑凋亡基因Bcl-2 mRNA表達顯著增加(P<0.01)。見表1。

2.5電針對骨細胞凋亡相關蛋白的影響 與正常組比較,模型組Bcl-2蛋白表達水平顯著下調(P<0.01),Caspase-3蛋白表達顯著增加 (P<0.01);與模型組相比,模型+電針組Caspase-3蛋白表達顯著降低(P<0.01),Bcl-2表達顯著增加(P<0.05)。見表1、圖4。

表1 各組股骨頭Bax、Bcl-2基因及Caspase-3表達比較

圖4 Western印跡檢測3組骨細胞凋亡相關蛋白

3 討 論

SANFH患者多為中老年人,其數量居非創傷性股骨頭壞死患者的首位,在臨床上常見,發病率高達40%〔10〕。SANFH是雙側對稱的,壞死范圍廣,致殘率高,給患者及其家人帶來了災難性的負擔。目前SANFH臨床尚缺乏切實有效的治療方法,疾病預后較差。本文結果表明,電針可通過抑制骨細胞凋亡,抑制促凋亡蛋白Bax表達、促進抑凋亡蛋白Bcl-2表達顯著緩解老年大鼠SANFH。

電針作用于穴位,持續刺激穴位,促進體內內源性阿片肽的釋放〔11〕。內源性阿片肽可與阿片肽受體結合,產生鎮痛作用〔12〕。調整穴位的電流強度、頻率和作用時間可以增強針刺誘導,改善局部微循環,疏通局部經絡,并達到抑制壞死的效果。電針可抑制皮質缺血半暗帶區小膠質細胞的變性和壞死,改善線粒體損傷〔13〕,還能促進神經功能的恢復〔14〕。

凋亡是一種細胞程序性死亡過程,可由促凋亡和抗凋亡蛋白如Caspase家族和Bcl-2家族調節〔15〕。骨細胞凋亡是激素性股骨頭缺血性壞死的主要表現〔16〕。研究表明,電針通過抑制Notch信號通路促進脊髓損傷大鼠的恢復,促進神經干細胞的增殖和分化〔17〕。電針通過降低神經元凋亡與氧化應激減輕慢性腦灌注不足導致的大鼠認知損害〔18〕。電針大椎(GV14)和命門(GV4)后,通過磷脂酰激酶-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路影響細胞生長、凋亡和自噬改善大鼠脊髓損傷〔19〕。電針通過調節TNF-α/NF-κB信號通路抑制創傷大鼠脾淋巴細胞凋亡〔20〕。本研究表明,電針可下調促凋亡蛋白Caspase-3和Bax表達,上調抑凋亡Bcl-2表達,抑制骨細胞的凋亡。至于電針通過何種機制影響促凋亡和抗凋亡蛋白的表達有待進一步研究。