PAX1檢測(cè)在子宮頸癌篩查及預(yù)后判定中的臨床價(jià)值及相關(guān)分子機(jī)制

劉頁(yè)玲 王凌云 賴(lài)海麗 陳精銳 周潔 尹春華

(1江西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院,江西 南昌 330052;2贛州市婦幼保健院婦產(chǎn)科;3南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科)

子宮頸癌(CC)是女性常見(jiàn)惡性腫瘤,其患病率及死亡率均處于較高水平〔1〕。我國(guó)作為CC高發(fā)地區(qū),每年約有13萬(wàn)人群發(fā)病,給女性身心健康帶來(lái)嚴(yán)重威脅〔2〕。CC發(fā)生及進(jìn)展比較緩慢,通常需要持續(xù)10～30年,故經(jīng)積極有效的干預(yù)后,早期CC患者治愈率高達(dá)100%〔3〕。人乳頭瘤病毒(HPV)持續(xù)感染是引發(fā)CC的關(guān)鍵原因,HPV-DNA檢測(cè)應(yīng)用于CC篩查敏感性較高,然而其特異性較低〔4〕。有研究證實(shí),僅不到1%的HPV感染人群可進(jìn)展為CC〔5〕。HPV-DNA檢測(cè)方式的不足引發(fā)的漏診及過(guò)診對(duì)臨床造成極大困擾,故探究新型檢測(cè)方式以辨別高級(jí)病變隨CC早期篩查尤為重要。DNA甲基化是DNA的一種表觀遺傳修飾,其可導(dǎo)致抑癌基因轉(zhuǎn)錄失活,進(jìn)而引發(fā)腫瘤〔6〕。研究證實(shí),多個(gè)基因異常甲基化與CC發(fā)展直接相關(guān)。配對(duì)盒家族基因(PAX)1可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)而阻斷基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)程〔7〕,已有研究證實(shí),PAX1在CC標(biāo)本中發(fā)生異常甲基化,說(shuō)明該基因在CC早期發(fā)現(xiàn)中意義重大〔8,9〕。然而目前針對(duì)PAX1與CC研究報(bào)道較少,本研究探討PAX1甲基化在子宮頸癌篩查及預(yù)后判定中的臨床價(jià)值及相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1組織標(biāo)本 選擇2018年12月至2021年6月在贛州市婦幼保健院就診的CC患者90例,取其腫瘤組織,平均年齡(51.13±9.51)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)經(jīng)病理學(xué)檢查明確診斷為CC;(2)年齡>20歲;(3)臨床病理資料完整;(4)術(shù)前未進(jìn)行任何治療;(5)患者或家屬均知曉本研究并簽署知情同意書(shū);(6)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并惡性腫瘤者;(2)代謝異常者;(3)中途退出研究者;(4)合并精神障礙、依從性差者。納入同期于醫(yī)院進(jìn)行治療的宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(CIN)患者74例,并取其CIN組織,CIN Ⅰ 19例,CIN Ⅱ 25例,CIN Ⅲ 30例,平均年齡(51.13±6.12)歲。納入同期于醫(yī)院實(shí)施子宮全切除術(shù)的患者45例,取其正常宮頸組織,平均年齡(48.75±7.89)歲。3組年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2細(xì)胞 正常宮頸細(xì)胞系ECT1/E6 E7購(gòu)于上海冠導(dǎo)生物細(xì)胞庫(kù);宮頸癌細(xì)胞系Hela購(gòu)于無(wú)錫欣潤(rùn)生物細(xì)胞庫(kù)。

1.3QMSP定量檢測(cè)PAX1甲基化 提取組織標(biāo)本DNA并采用亞硫酸氫鹽處理,然后將處理后的DNA作為模板。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)條件:95 ℃預(yù)變性10 min,94 ℃ 30 s,48 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共50個(gè)循環(huán)。甲基化率采用甲基化指數(shù)(PMR)量化。

1.4免疫組化法檢測(cè)PAX1表達(dá) 取石蠟標(biāo)本進(jìn)行切片并通過(guò)免疫組化法檢測(cè)其中PAX1表達(dá)情況。將切片分別置于二甲苯及梯度酒精中浸泡,經(jīng)PBS液沖洗后置于0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液中行抗原修復(fù),采用血清封閉,PAX1 1∶100稀釋,滴加一抗并于4 ℃環(huán)境下孵育過(guò)夜,滴加二抗于37 ℃環(huán)境下孵育,經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑顯色后終止反應(yīng),經(jīng)蘇木素復(fù)染、脫水透明后自然風(fēng)干,然后封片。

1.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 將所需細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)24 h,然后以1 500 r/min的速度離心10 min,將沉淀取出并采用DMEM重懸,孵育24 h并傳代,取第3代細(xì)胞以4×106/孔的密度植于培養(yǎng)基,代細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)更換培養(yǎng)基(無(wú)胎牛血清)。

將Hela細(xì)胞分為空白對(duì)照組(不進(jìn)行處理常規(guī)培養(yǎng))、PAX1 mimics NC組(轉(zhuǎn)染PAX1 mimics NC)、PAX1 mimics組(轉(zhuǎn)染PAX1 mimics)、PAX1 inhibition NC組(轉(zhuǎn)染PAX1 inhibition NC)、PAX1 inhibition 組(轉(zhuǎn)染PAX1 inhibition )。每組均設(shè)置3個(gè)重復(fù),48 h采集細(xì)胞以待檢測(cè)。

1.6細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 噻唑藍(lán)(MTT)法:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化后制備細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù),放入培養(yǎng)箱中孵育,分別于24、48、72 h時(shí)在每孔中添加10 ml 5 g/L MTT溶液,加二甲基亞砜后于550 nm處檢查各孔吸光度(OD)值。

1.7細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,采用絲裂霉素C處理,1 h后取200 μl移液槍頭進(jìn)行劃痕處理,清洗細(xì)胞表面后鏡檢標(biāo)記細(xì)胞原始位置,孵育24 h后拍照并計(jì)算遷移細(xì)胞數(shù)。

1.8Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 采用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋基質(zhì)膠,將稀釋后的基質(zhì)膠涂于上層小室,在37 ℃環(huán)境下培養(yǎng)4 h,然后放入不含血清的DMEM溶液中重懸。上層小室每孔中均加入100 μl細(xì)胞懸液,下層小室加含胎牛血清的培養(yǎng)基,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后取出小室,經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后擦拭膜上基質(zhì)膠和未穿過(guò)的細(xì)胞,采用吉姆薩(Giemsa)染色后置于倒置顯微鏡下觀察。

1.9細(xì)胞相關(guān)基因蛋白表達(dá)檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光定量(RT-q)PCR、Western印跡檢測(cè)細(xì)胞PAX1及Wnt/β-catenin 信號(hào)通路相關(guān)分子〔上皮鈣依賴(lài)黏附蛋白(E-cadherin)、β-catenin〕mRNA及蛋白表達(dá)水平。RT-qPCR法:提取細(xì)胞總RNA,然后經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后實(shí)施PCR擴(kuò)增,同時(shí)測(cè)定條帶亮度,PAX1、E-cadherin、β-catenin基因mRNA表達(dá)量為目的基因參與內(nèi)參β-actin條帶亮度比值。Western印跡:提取細(xì)胞總蛋白并進(jìn)行濃度測(cè)定,按照蛋白Marker確定時(shí)間實(shí)施電泳,轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,置于5%脫脂牛奶行封閉處理,加一抗、二抗后洗膜,加電化學(xué)發(fā)光(ECL)進(jìn)行膠片曝光、顯影、定影后分析目標(biāo)蛋白PAX1、E-cadherin、β-catenin表達(dá)量。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn);采用受試者工作特征(ROC)曲線分析PAX1檢測(cè)在子宮頸癌篩查及預(yù)后判定中的價(jià)值。

2 結(jié) 果

2.1PAX1在不同宮頸組織中的甲基化水平比較 正常宮頸(3.17±2.85)、CIN Ⅰ(5.09±4.16)、CIN Ⅱ(7.49±4.72)、CIN Ⅲ組織中PAX1 PMR值(13.10±10.91)均較CC組織(76.38±31.72)顯著降低(P<0.05);CIN Ⅰ、CIN Ⅱ、CIN Ⅲ組織中PAX1 PMR值均較正常宮頸組織顯著升高,且隨CIN分級(jí)增加而明顯升高(P<0.05)。

2.2PAX1基因甲基化診斷CC的價(jià)值 PAX1甲基化診斷CC的曲線下面積(AUC)、靈敏度、特異度分別為0.97、93.20%、62.25%。見(jiàn)圖1。

圖1 ROC曲線分析PAX1診斷CC的效能

2.3PAX1在不同宮頸組織中的表達(dá) 正常宮頸〔41例(9.11%)〕、不同CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ組織PAX1陽(yáng)性表達(dá)率〔17例(89.47%)、18例(72.00%)、19例(63.33%)〕均較CC組織〔35例(38.89%)〕顯著升高(P<0.05);CIN Ⅱ、CIN Ⅲ組織PAX1陽(yáng)性表達(dá)率均較正常宮頸組織顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.4PAX1蛋白對(duì)CC患者預(yù)后的價(jià)值 PAX1蛋白對(duì)CC患者預(yù)后的AUC、靈敏度、特異度分別為0.829、90.00%、62.40%。見(jiàn)圖3。

2.5PAX1在正常宮頸細(xì)胞及宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá) Hela細(xì)胞系PAX1 mRNA(0.11±0.02)及蛋白表達(dá)水平(0.09±0.01)較ECT1/E6 E7細(xì)胞系mRNA及蛋白表達(dá)(0.38±0.01、0.36±0.02)顯著降低(t=46.765、46.765,均P<0.001)。見(jiàn)圖4。

圖2 PAX1在不同宮頸組織中的表達(dá)(免疫組化,×400)

2.6各組細(xì)胞增殖能力比較 在24、48、72 h時(shí),PAX1 mimics組細(xì)胞增殖能力較空白對(duì)照組顯著降低(P<0.05);PAX1 inhibition 組細(xì)胞增殖能力較空白對(duì)照組顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞增殖能力(OD值)比較

2.7各組細(xì)胞遷移及侵襲能力比較 PAX1 mimics組細(xì)胞遷移及穿膜數(shù)均較空白對(duì)照組顯著降低(P<0.05);PAX1 inhibition組細(xì)胞遷移及穿膜數(shù)均較空白對(duì)照組顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖5。

2.8各組Wnt/β-catenin 信號(hào)通路相關(guān)因子mRNA及蛋白表達(dá)比較 PAX1 mimics組β-catenin mRNA及蛋白表達(dá)水平均較空白對(duì)照組顯著降低,E-cadherin mRNA及蛋白表達(dá)水平均較空白對(duì)照組顯著升高(P<0.05);PAX1 inhibition組β-catenin mRNA及蛋白表達(dá)水平均較空白對(duì)照組顯著升高,E-cadherin mRNA及蛋白表達(dá)水平均較空白對(duì)照組顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖6。

表2 各組細(xì)胞遷移、侵襲能力和β-catenin、E-cadherin mRNA及蛋白表達(dá)比較

圖5 各組細(xì)胞遷移、侵襲能力

1～5:空白對(duì)照組、PAX1 mimics NC組、PAX1 mimics組、PAX1 inhibition NC組、PAX1 inhibition組圖6 各組細(xì)胞β-catenin、E-cadherin蛋白表達(dá)比較

3 討 論

DNA甲基化在腫瘤發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,有報(bào)道證實(shí),基因組DNA基因異常甲基化可參與腫瘤起病及演變過(guò)程,且與患者臨床預(yù)后相關(guān)〔10〕。采用CC特定DNA高度甲基化測(cè)定結(jié)果可判斷CC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),在CC患者篩查、分流和隨訪測(cè)定過(guò)程中具有重要作用。

多項(xiàng)研究顯示,PAX1甲基化與CC發(fā)展密不可分,有研究顯示,PAX1基因在CC組織中發(fā)生異常甲基化,且甲基化異常頻率為94.5%,說(shuō)明該基因在CC早期診斷中意義重大〔11〕。Xu等〔12〕通過(guò)研究PAX1在CC組織中的甲基化情況發(fā)現(xiàn),PAX1甲基化陽(yáng)性率高達(dá)87.50%,且其陽(yáng)性率隨疾病進(jìn)展呈顯著增加趨勢(shì)。PAX1在宮頸病變組織中甲基化程度較正常宮頸組織存在明顯區(qū)別,故PAX1甲基化檢測(cè)有望成為CC臨床評(píng)估中極為重要指標(biāo)。

有學(xué)者通過(guò)對(duì)比PAX1甲基化與HPV在高度鱗狀上皮內(nèi)病變及鱗狀細(xì)胞癌中的檢測(cè)效率發(fā)現(xiàn),PAX1甲基化檢測(cè)具有較高的靈敏度,且進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn),PAX1甲基化可明顯增加CC檢測(cè)靈敏度,提示該基因甲基化可參與CC發(fā)生發(fā)展過(guò)程〔13〕。本研究結(jié)果說(shuō)明,在CC起病過(guò)程中PAX1可能是作為腫瘤抑制基因發(fā)揮作用,PAX1甲基化在CC早期診斷中價(jià)值較高。本研究結(jié)果顯示,PAX1在子宮頸病變發(fā)展過(guò)程中,PAX1表達(dá)陽(yáng)性率逐漸減少,且CC組織最低,這可能是由于PAX1甲基化可導(dǎo)致啟動(dòng)子沉默進(jìn)而阻斷基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)程,與此同時(shí),其自身蛋白PAX1表達(dá)亦被阻斷,而PAX1表達(dá)下調(diào)在CC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)作用。

PAX1可參與胚胎發(fā)育環(huán)節(jié)并調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、凋亡等生物學(xué)行為,可作為細(xì)胞系特定調(diào)節(jié)因子之一〔14〕。近年來(lái)針對(duì)PAX1的研究顯著增多,其已被證實(shí)在腫瘤生長(zhǎng)環(huán)節(jié)中扮演重要角色〔15,16〕。臨床研究顯示,PAX1在口腔鱗癌細(xì)胞HN4中的表達(dá)量顯著減少,且下調(diào)細(xì)胞內(nèi)PAX1表達(dá)后,HN4細(xì)胞增殖率、穿膜細(xì)胞數(shù)及遷移細(xì)胞數(shù)顯著增加,說(shuō)明下調(diào)PAX1表達(dá)可促進(jìn)HN4增殖、侵襲及遷移〔17〕。本研究結(jié)果說(shuō)明,低表達(dá)PAX1對(duì)Hela細(xì)胞增殖、侵襲及遷移發(fā)揮一定正向調(diào)控作用。Wnt/β-catenin通路可促進(jìn)細(xì)胞上皮間質(zhì)化,有報(bào)道顯示,β-catenin及E-cadherin在該通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用,可與相關(guān)蛋白于膜上產(chǎn)生復(fù)合物,若前者胞外區(qū)域發(fā)生水解,后者即被分泌,進(jìn)而阻斷 E-cadherin轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生上皮細(xì)胞間質(zhì)化〔18,19〕。有研究敲低魚(yú)類(lèi)PAX1表達(dá)后發(fā)現(xiàn),Wnt通路被激活,但上調(diào)PAX1表達(dá)后Wnt通路被抑制〔20〕。本研究結(jié)果提示,PAX1對(duì)宮頸癌發(fā)生、進(jìn)展的調(diào)節(jié)可能與Wnt/β-catenin通路密不可分。

綜上,PAX1檢測(cè)在CC臨床篩查及早期病情評(píng)估方面具有較高價(jià)值,且上調(diào)PAX1表達(dá)可阻斷CC細(xì)胞增殖、侵襲及遷移,其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin通路實(shí)現(xiàn)的,可為PAX1在CC靶向治療提供理論依據(jù)。然而本次研究只是針對(duì)Wnt/β-catenin這一具有代表性的通路對(duì)CC起病及進(jìn)展機(jī)制進(jìn)行分析,在以后的研究中將針對(duì)更多與CC有關(guān)的信號(hào)通路及基因進(jìn)行探究。