香椿子多酚經STAT3/COX-2信號通路對大鼠缺血性腦卒中損傷的保護作用機制

陳祥科 張雪海 孫恒聰 吉曉天 邢莉菊

(三亞市人民醫院 1康復醫學科,海南 三亞 572022;2神經內科;3廣州中醫藥大學附屬粵海醫院康復科)

缺血性腦卒中容易導致患者死亡或致殘〔1〕,靜脈溶栓聯合阿替普酶或動脈內取栓是臨床上治療缺血性腦卒中的有效策略〔2〕,但是也可能在進行腦缺血再灌注時加重腦損傷〔3〕。因此,尋找高效、低毒的新藥防治缺血性腦卒中損傷具有重要意義。香椿子多酚(PTSS)是從香椿子中提取的一種化合物,已有研究發現PTSS對心肌缺血再灌注大鼠具有一定的保護作用〔4〕。下調信號轉導與轉錄激活因子(STAT)2/環氧合酶(COX)-2信號通路中的p-STAT3、COX-2的表達可減輕大鼠急性腦缺血再灌注損傷〔5〕。眾所周知,缺血性腦卒中的病理生理過程是復雜的,涉及氧化應激、細胞凋亡等〔6〕。而PTSS能否通過調控STAT3/COX-2信號通路改善缺血性腦卒中鮮見報道。本研究探究PTSS對缺血性腦卒中大鼠的保護作用,并探究可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1動物 75只SPF級雄性SD大鼠購自肇慶市瑞思元生物科技有限公司,生產許可證號為SCXK(粵)2020-0053,鼠齡6周齡,體質量200～210 g,大鼠均生活在(25±3)℃,濕度60%,12 h光/暗循環的環境中,并可自由獲取食物和水。該研究得到醫院動物倫理委員會的批準,并遵循3R原則。

1.2主要試劑 STAT3/COX-2通路激活劑白細胞介素(IL)-6中和抗體(貨號:Ab0001)購自北京匯智泰康醫藥技術有限公司;2,3,5氯化三苯基四氮唑(TTC)染色液(2%,貨號:G3005)購自北京索萊寶生物科技有限公司;大鼠超氧化物歧化酶(SOD,貨號:RJ16643)、丙二醛(MDA,貨號:RJ16659)試劑盒購自上海仁捷生物科技有限公司;TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(貨號:KTA2010)購自武漢安賽思生物醫藥技術有限公司;兔源一抗p-STAT3(貨號:ab267373)、STAT3(貨號:ab68153)、COX-2(貨號:ab169782)、β-actin(貨號:ab5694)、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗(貨號:ab205718)均購自英國Abcam公司。

1.3藥物 香椿子購自亳州市聚春堂中藥材銷售有限公司,稱取香椿子重量,經乙醇提取及AB-8大孔樹脂純化后,通過真空干燥獲取PTSS粉末。利用5%羧甲基纖維素鈉溶解PTSS粉末并配制成所需濃度。

1.4缺血性腦卒中模型的構建及分組 利用改良的Longa線栓法構建缺血性腦卒中大鼠模型〔7〕,用戊巴比妥鈉麻醉大鼠,并將大鼠進行仰臥位固定,分離大鼠左頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈,用微動脈夾阻閉頸總動脈,栓線結扎頸外動脈,將從頸外動脈插入的栓線調整至頸內動脈,當栓線進入約18 mm時能感受到有阻力感,表明栓線已經進入大腦中動脈,此時固定栓線,縫合傷口。通過Zea-Longa評分法進行大鼠神經功能評分,若神經功能評分為1～3分則為造模成功〔8〕。

按照隨機數字表法將SD大鼠分為NC組、Model組、PTSS組、IL-6組、PTSS+IL-6組,每組15只。除NC組外,其他組均需構建缺血性腦卒中模型,NC組大鼠不插入線栓,其余操作同Model組。本研究建模成功率為100%,造模成功后,PTSS組按照200 mg/kg的劑量灌胃PTSS〔9〕,同時還需尾靜脈注射0.5 mg/kg生理鹽水;IL-6組按照0.5 mg/kg的劑量尾靜脈注射IL-6抗體〔10〕,同時還需灌胃200 mg/kg 0.5%羧甲基纖維素鈉;PTSS+IL-6組除需灌胃200 mg/kg PTSS外,還需尾靜脈注射0.5 mg/kg IL-6抗體;NC組、Model組以200 mg/kg的劑量灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉,還需按照0.5 mg/kg的劑量尾靜脈注射生理鹽水,每天1次,連續7 d。

1.5標本收集 造模結束及末次給藥結束后,采用Zea-Longa評分系統評估大鼠的神經功能評分;神經功能評分完成后,處死大鼠,收集大鼠海馬CA1區腦組織,均分為3部分,一部分用于TTC染色,一部分用于蘇木素-伊紅(HE)和TUNEL染色,剩余部分用于SOD、MDA水平的檢測及Western印跡實驗。

1.6神經功能評分的測定 根據Zea-Longa評分系統〔11〕進行神經功能評分:0分為無神經功能障礙癥狀;1分為不能伸展對側前爪;2分為走路時轉向偏癱側;3分為向偏癱側傾倒;4分為無法自主行走,失去知覺。

1.7TTC染色檢測腦梗死體積百分率 取出腦組織,用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗并切成2 mm厚的切片,將切片置于2% TTC溶液中,并在37 ℃下避光30 min,然后在4%甲醛中固定24 h并拍照,未染色區域定義為腦梗死區域,通過 Image-Pro Plus6.0軟件評估腦梗死體積,并計算腦梗死體積百分率(%)=(腦梗死體積/全部腦體積)×100%。

1.8HE染色檢測大鼠腦組織海馬CA1區病理變化 將用4%多聚甲醛固定的海馬CA1區腦組織經石蠟包埋、切片后進行HE染色,最后觀察海馬CA1區腦組織病理變化。

1.9大鼠腦組織中SOD、MDA水平的檢測 根據試劑盒說明書操作步驟檢測腦組織勻漿中SOD、MDA水平變化。

1.10TUNEL染色神經細胞凋亡 將石蠟包埋的腦組織切成4 μm厚的切片,固定在二甲苯中,用乙醇梯度水合后再用蛋白酶K透化30 min。然后將腦組織切片置于TUNEL試劑中,37 ℃處理1 h,再加入0.05 μg/ml 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色10 min,最后利用熒光顯微鏡觀察并拍照,綠色熒光標記的細胞為TUNEL陽性細胞。并計算細胞凋亡率(%)=(TUNEL染色陽性細胞數/DAPI染色陽性細胞數)×100%。

1.11Western印跡檢測p-STAT3、STAT3、COX-2蛋白 使用RIPA裂解緩沖液提取腦組織勻漿總蛋白,將蛋白進行定量、電泳、轉膜、封閉后,加入一抗p-STAT3、STAT3、COX-2、β-actin在4 ℃下過夜。第2天,再加入二抗在室溫下孵育2 h。通過電化學發光(ECL)試劑觀察蛋白印跡,ImageJ軟件評估目的蛋白灰度值。

1.12統計學分析 采用SPSS25.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1PTSS對各組神經功能評分的影響 與NC組相比,Model組神經功能評分顯著升高(P<0.05);與Model組相比,PTSS組神經功能評分明顯降低,IL-6組神經功能評分明顯升高(P<0.05);與PTSS組相比,PTSS+IL-6組神經功能評分明顯升高(P<0.05),見表1。

2.2PTSS對各組腦梗死體積百分率變化的影響 與NC組比較,Model組腦梗死體積百分率顯著升高(P<0.05);與Model組比較,PTSS組腦梗死體積百分率顯著降低,IL-6組腦梗死體積百分率顯著升高(P<0.05);與PTSS組比較,PTSS+IL-6組腦梗死體積百分率顯著升高(P<0.05),見表1、圖1。

2.3PTSS對各組腦組織海馬CA1區病理變化的影響 NC組腦組織海馬CA1區神經細胞排列整齊,結構完整;Model組海馬CA1區神經元結構嚴重受損,核變形、萎縮,神經細胞數量減少,細胞排列松散;與Model組比較,PTSS組腦組織海馬CA1區病理變化得到顯著改善,而IL-6組腦組織海馬CA1區病理損傷加劇;與PTSS組比較,PTSS+IL-6組腦組織海馬CA1區病理損傷加重,見圖2。

2.4PTSS對各組腦組織中SOD、MDA水平變化的影響 與NC組相比,Model組SOD活性明顯降低,MDA水平明顯升高(P<0.05);與Model組相比,PTSS組SOD活性明顯升高,MDA水平明顯降低,IL-6組SOD活性明顯降低,MDA水平明顯升高(P<0.05);與PTSS組相比,PTSS+IL-6組腦組織中SOD水平顯著降低,MDA水平顯著升高(P<0.05),見表1。

2.5PTSS對各組腦組織中神經細胞凋亡變化的影響 與NC組相比,Model組神經細胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與Model組相比,PTSS組神經細胞凋亡率顯著降低,IL-6組神經細胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與PTSS組比較,PTSS+IL-6組神經細胞凋亡率顯著升高(P<0.05),見表1、圖3。

2.6PTSS對各組腦組織中STAT3/COX-2通路蛋白表達變化的影響 與NC組相比,Model組p-STAT3/STAT3、COX-2蛋白表達顯著升高(P<0.05);與Model組相比,PTSS組p-STAT3/STAT3、COX-2蛋白表達水平顯著降低,IL-6組腦組織中p-STAT3/STAT3、COX-2蛋白表達水平顯著升高(P<0.05);與PTSS組比較,PTSS+IL-6組腦組織中p-STAT3/STAT3、COX-2蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),見表1、圖4。

表1 各組神經功能評分、腦梗死體積百分率、腦組織神經細胞凋亡率、SOD和MDA水平及 p-STAT3、COX-2蛋白表達比較

圖1 TTC染色檢測各組腦梗死

圖2 各組腦組織海馬CA1區病理(HE染色,×400)

圖3 各組腦組織神經細胞凋亡(TUNEL染色,×200)

1～5:NC組、Model組、PTSS組、IL-6組、PTSS+IL-6組圖4 各組腦組織中p-STAT3、STAT3、COX-2蛋白表達

3 討 論

缺血性腦卒中是一種與細胞凋亡和氧化應激反應相關的多因素疾病,缺血性腦卒中的后續氧化應激會導致神經元細胞凋亡、血腦屏障受損、神經血管損傷、水腫和出血〔12〕。據報道,腦卒中后的細胞凋亡和氧化應激是缺血性腦損傷的重要分子機制〔13〕。本研究通過利用改良的Longa線栓法進行缺血性腦卒中大鼠模型的構建,結果證明缺血性腦卒中大鼠模型構建成功。SOD、MDA分別是常用于衡量機體抗氧化、氧化能力的重要標志物,已有研究證實在缺血性腦卒中大鼠模型中SOD水平降低,MDA水平升高〔14〕。本研究得出了類似的結論,提示氧化應激及神經細胞凋亡可能參與了缺血性腦卒中大鼠腦組織損傷過程。

香椿子是香椿的果實,具有抗炎、抗氧化、神經保護等作用〔15〕。PTSS是從香椿子中提取的一種化合物,已有研究報道,PTSS可減輕帕金森病大鼠的神經炎癥反應〔16〕;PTSS可減輕心肌缺血再灌注大鼠心肌梗死程度〔17〕。而關于PTSS對缺血性腦卒中大鼠的影響尚不清楚。本研究結果表明,PTSS可能通過抑制氧化應激及神經細胞凋亡來發揮對缺血性腦卒中大鼠的保護作用。

STAT3是STAT信號蛋白家族的成員之一,促進STAT3的磷酸化可激活COX-2進而促進炎癥性疾病的發展〔18〕。據報道,葛根素對腦梗死大鼠的神經功能及神經細胞凋亡具有改善作用,該作用與抑制STAT3表達有關〔19〕;COX-2在伴有糖尿病的腦梗死患者中高表達〔20〕。本研究結果推測PTSS可能通過抑制STAT3/COX-2通路減輕大鼠缺血性腦卒中損傷。為了驗證該推測,本研究利用STAT3/COX-2通路激活劑IL-6抗體進行干預,證實了STAT3/COX-2通路確實參與了缺血性腦卒中的氧化應激及細胞凋亡過程,PTSS可能通過抑制STAT3/COX-2通路減輕大鼠缺血性腦卒中損傷。

綜上所述,PTSS可能通過抑制STAT3/COX-2通路減輕大鼠缺血性腦卒中損傷。但PTSS保護缺血性腦卒中大鼠涉及的機制較為復雜,具體通過STAT3/COX-2通路下游的哪些蛋白來發揮作用有待后續實驗進一步驗證。