人參皂苷Rg1通過miR-144/Nrf2/ARE通路對糖尿病大鼠肝損傷的影響

郭學軍 陳苑 高欣

(廣州中醫藥大學動物實驗中心,廣東 廣州 510400)

糖尿病(DM)是一種以胰島素缺乏和(或)胰島素抵抗為主要病因的常見慢性病,DM患者長期的代謝紊亂會導致肝臟、心臟等多器官損傷〔1〕。肝臟是機體的主要代謝器官,在葡萄糖穩態方面具有重要作用,有研究發現,持續的高糖環境會促使機體產生氧化應激,堆積大量氧化產物,從而對肝組織造成損傷,因此緩解氧化應激對DM致肝損傷的改善極其重要〔2〕。有證據表示,核因子E2相關因子(Nrf)2/抗氧化反應元件(ARE)通路激活可促進抗氧化基因表達,從而改善DM〔2,3〕。微小RNA(miR)-144可通過與Nrf2 3′非翻譯區(UTR)結合來靶向抑制其表達,而miR-144在DM患者血清中表達異常增加〔4,5〕。人參皂苷(G)-Rg1作為人參的主要活性物質具有強大的抗氧化作用,多項研究表明,其在DM及其所致并發癥中具有明顯的治療作用〔6,7〕。有研究發現,G-Rg1可通過抑制miR-144/Nrf2/ARE通路來改善缺血/再灌注誘導的神經細胞(PC12)損傷〔4〕,但其是否可能通過該通路改善DM致肝損傷還未可知。本研究通過構建DM大鼠模型,探究G-Rg1通過miR-144/Nrf2/ARE通路對DM大鼠肝損傷的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 將從昆明醫科大學購得的80只SD大鼠(SPF級,體質量205～245 g)進行恒溫分籠飼養7 d,12 h晝夜循環,許可證:SCXK(滇)K2020-0004。

1.2試劑和儀器 G-Rg1、鏈脲佐菌素(STZ,YG11172、YTK0048,上海韻泰);Nrf2激活劑(Hesperin,HY-101371,Med Chem Express LLC);二甲雙胍(MET,國藥準字H20103615,迪沙藥業集團有限公司,0.25g/片);丙二醛(MDA)試劑盒(KA6029,上海群己生物);雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(F6075S,上海百賽生物);超氧化物歧化酶(SOD,BB-4710,貝博-Bestbio);蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(GV360321,上海一基實業);實時熒光定量-聚合酶鏈反應(RT-qPCR)試劑盒(F-430,北京美科美生物);辣根過氧化物酶(HRP)-IgG、兔抗血紅素加氧酶(HO)-1、β-actin、Nrf2抗體(SA00001-2、10701-1-AP、60008-1-Ig、16396-1-AP,Proteintech);凝膠成像儀GelSMART、酶標儀WD-2102A(上海易匯生物);全自動生化分析儀Selectra E(上海玉研科學儀器);RT-qPCR儀ABI StepOnePlus(北京希凱恩生物)。

1.3分組及糖尿病模型構建 隨機將大鼠分成control組、model(模型)組、MET(100 mg/kg MET)組、G-Rg1-L(10 mg/kg G-Rg1)組、G-Rg1-H(30 mg/kg G-Rg1)組〔8〕、G-Rg1-H+mimics NC(2×1011TU/L mimics NC慢病毒液100 μl)組、G-Rg1-H+miR-144 mimics(2×1011TU/L miR-144 mimics慢病毒液100 μl)組、G-Rg1-H+miR-144 mimics+Hesperin(30 mg/kg G-Rg1+100 μl miR-144 mimics+10 mg/kg Hesperin)組〔9〕;除control組外,其余組構建DM模型:大鼠給予高脂高糖飼料(3%花生米,豬油10%,蛋黃粉3%,蔗糖10%,74%普通飼料)喂養4 w后禁食24 h,按40 mg/kg腹腔注射STZ溶液(STZ溶于0.1 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液中配制濃度為1%),分別于3 d及2 w后檢查大鼠空腹血糖(FBG),若均大于11.1 mmol/L則造模成功,control組飼喂基礎飼料,注射等劑量的檸檬酸鈉緩沖液〔8〕;于造模成功后,MET組、G-Rg1-L組、G-Rg1-H組、G-Rg1-H+mimics NC組、G-Rg1-H+miR-144 mimics組、G-Rg1-H+miR-144 mimics+Hesperin組灌胃相應劑量MET或G-Rg1,并于灌胃后在相應組大鼠尾靜脈注射100 μl mimics NC、miR-144 mimics慢病毒液或腹腔注射10 mg/kg Hesperin,1次/w;control組、model組灌胃、尾靜脈及腹腔注射等劑量生理鹽水,為期8 w。

1.4血糖、肝功能及抗氧化指標測定 末次灌胃12 h后取全部大鼠尾靜脈血,使用血糖測試儀檢測其FBG;然后水合氯醛麻醉大鼠,取其腹主動脈血4 ml,進行3 500 r/min離心,5 min后取上清液,一部分血清置于全自動生化分析儀中檢測谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)水平,另一部分通過MDA、SOD試劑盒檢測MDA、SOD含量。

1.5HE染色檢測肝組織病理形態 取血后頸椎脫臼處死大鼠,隨機取5只大鼠肝組織浸泡于多聚甲醛中固定3 d,石蠟包埋后使用切片機進行切片(厚度4 μm),水化后行HE染色,光鏡(×200)觀察肝組織病理情況。

1.6過碘酸-雪夫(PAS)染色觀察肝組織中糖原含量變化 取1.5中脫蠟至水后的切片,經蒸餾水清洗后添加過碘酸(10 g/L)氧化15 min,蒸餾水清洗后孵育雪夫染液(10 min),沖洗后蘇木素核染(1 min),經鹽酸酒精分化后沖洗(5 min)脫水封片及鏡檢(×400)。

1.7RT-qPCR分析肝組織中miR-144、HO-1、Nrf2表達 經Trizol法提取每組所剩余5只大鼠肝組織總RNA,反轉錄得cDNA后,按比例加入反應物,以U6及GAPDH分別作為miR-144及HO-1、Nrf2內參進行qRT-PCR擴增(預變性:95 ℃、2 min,變性:95 ℃、30 s,退火:58 ℃、30 s,延伸:72 ℃、30 s,循環數為38個),引物序列(5′-3′)為U6:上游CTCGCTTCGGGCAGCACA,下游AACCGCTTCACGAATTTGC GT;miR-144:上游GGCCGGCGTACAGTATAGATGA,下游GTGCAGGGTCCGAGGT;GAPDH:上游CCGTATTCAGCATTCTATGCTCTC,下游TGGATACACAC TCTGGGGCT;HO-1:上游AGCGAAACAAGCAG AAC CCA,下游ACCTCGTGGGACGCTTTAC;Nrf2:上游CACATCCAGACAGACACCAGT,下游CTACAAATGGGAATGTCTCTGC。2-ΔΔCt分析miR-144及HO-1、Nrf2表達水平,其余組織行Western印跡實驗。

1.8Western印跡檢測肝組織HO-1、Nrf2表達 將肝組織置于含裂解液的勻漿器中勻漿,離心(3 500 r/min,5 min)后提取上清中總蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法定量濃度,于蛋白中添加上樣緩沖液后經95 ℃、5 min變性,以30 μg/孔行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),轉移蛋白至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,封閉1 h后4 ℃下過夜孵育HO-1、β-actin、Nrf2抗體(1∶1 000),二抗(HRP-IgG)孵育(1∶2 000)1 h,電化學發光(ECL)顯影,凝膠成像系統觀察,Image Lab分析HO-1、β-actin、Nrf2灰度值,計算HO-1、Nrf2表達。

1.9雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-144與Nrf2的靶向關系 starBase預測miR-144與Nrf2的結合位點;在pMir-Report載體上插入含miR-144結合位點的Nrf2 3′UTR區域,構建野生型Nrf2-wt載體,替換與miR-144結合的Nrf2片段,構建Nrf2-mut突變型載體;將293T細胞分為Nrf2-wt+miR-144 mimics組、Nrf2-wt+miR-NC組、Nrf2-mut+miR-144 mimics組、Nrf2-mut+miR-NC組,將miR-NC、miR-144 mimics分別與重組質粒Nrf2-wt、Nrf2-mut轉染到239T細胞中培養24 h,雙熒光素酶報告系統分析293T細胞中海腎及螢火蟲熒光值,以計算其相對熒光素酶活性。

1.10統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行One-way ANOVA分析及SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1各組FBG及肝功能比較 與control組比,model組FBG、ALT、AST水平顯著增加(P<0.05);與model組比,MET組、G-Rg1-L組、G-Rg1-H組FBG、ALT、AST水平顯著減少(P<0.05);MET組與G-Rg1-H組比較FBG、ALT、AST水平無明顯差異(P>0.05);與G-Rg1-H組、G-Rg1-H+mimics NC組相比,G-Rg1-H+miR-144 mimics組FBG、ALT、AST水平顯著增加(P<0.05);與G-Rg1-H+miR-144 mimics組比,G-Rg1-H+miR-144 mimics+Hesperin組FBG、ALT、AST水平顯著減少(P<0.05),見表1。

2.2各組血清MDA、SOD含量比較 與control組比,model組血清MDA含量顯著增加,SOD含量顯著減少(P<0.05);與model組比,MET組、G-Rg1-L組、G-Rg1-H組MDA含量顯著減少,SOD含量顯著增加(P<0.05);MET組與G-Rg1-H組比較MDA、SOD含量無明顯差異(P>0.05);與G-Rg1-H組、G-Rg1-H+mimics NC組相比,G-Rg1-H+miR-144 mimics組MDA含量顯著增加,SOD含量顯著減少(P<0.05);與G-Rg1-H+miR-144 mimics組比,G-Rg1-H+miR-144 mimics+Hesperin組MDA含量顯著減少,SOD含量顯著增加(P<0.05),見表1。

表1 各組FBG、肝功能指標及血清MDA、SOD含量比較

2.3各組肝組織病理形態觀察 control組肝組織結構完整且肝小葉輪廓清楚,肝細胞有序排列且呈現放射狀,無壞死及炎性浸潤現象;model組肝細胞腫脹且排列紊亂,肝索結構模糊,存在局部的脂肪空泡及炎癥細胞浸潤;與model組比,MET組、G-Rg1-L組、G-Rg1-H組肝組織結構較為清晰,脂肪及炎性浸潤減少;與G-Rg1-H組比,G-Rg1-H+mimics NC組上述現象無明顯變化,G-Rg1-H+miR-144 mimics組上述病理癥狀加重;與G-Rg1-H+miR-144 mimics組比,G-Rg1-H+miR-144 mimics+Hesperin組病理癥狀減輕(P<0.05),見圖1。

2.4各組肝組織糖原分布情況 control組肝細胞胞質中存在大量均勻分布的紫紅色糖原顆粒;model組糖原數量減少且染色變淺、分布不均;與model組比,MET組、G-Rg1-L組、G-Rg1-H組糖原數量增加且染色加深;與G-Rg1-H組比,G-Rg1-H+mimics NC組糖原數量無明顯變化,G-Rg1-H+miR-144 mimics組糖原數量減少;與G-Rg1-H+miR-144 mimics組比,G-Rg1-H+miR-144 mimics+Hesperin組糖原數量增加(P<0.05),見圖2。

圖1 各組肝組織病理形態(HE染色,×400)

圖2 各組肝組織糖原分布(PAS染色,×400)

2.5各組肝組織miR-144、HO-1 mRNA、Nrf2 mRNA及蛋白表達比較 與control組比,model組肝組織miR-144表達顯著增加,HO-1及Nrf2 mRNA和蛋白表達顯著減少(P<0.05);與model組比,MET組、G-Rg1-L組、G-Rg1-H組miR-144表達顯著減少,HO-1及Nrf2 mRNA和蛋白表達顯著增加(P<0.05);MET組與G-Rg1-H組相比,肝組織miR-144、HO-1及Nrf2 mRNA和蛋白表達無明顯差異(P>0.05);與G-Rg1-H、G-Rg1-H+mimics NC組相比,G-Rg1-H+miR-144 mimics組肝組織miR-144表達顯著增加,HO-1及Nrf2 mRNA、蛋白表達顯著減少(P<0.05);與G-Rg1-H+miR-144 mimics組比較,G-Rg1-H+miR-144 mimics+Hesperin組肝組織miR-144表達無明顯變化(P>0.05),HO-1及Nrf2 mRNA、蛋白表達顯著增加(P<0.05),見表2、圖3。

表2 各組肝組織miR-144表達、HO-1、Nrf2 mRNA及蛋白表達比較

1～8:control組、model組、MET組、G-Rg1-L組、G-Rg1-H組、G-Rg1-H+mimics NC組、G-Rg1-H+miR-144 mimics組、G-Rg1-H+miR-144 mimics+Hesperin組圖3 各組肝組織中HO-1、Nrf2蛋白表達比較

2.6miR-144與Nrf2靶向關系驗證 starBase預測miR-144與Nrf2存在結合位點,見圖4。熒光素酶報告基因實驗顯示,與Nrf2-wt+miR-NC組(0.92±0.15)相比,Nrf2-wt+miR-144 mimics組熒光素酶活性(0.45±0.13)顯著減少(t=5.295,P=0.001),Nrf2-mut+miR-NC組(0.91±0.14)、Nrf2-mut+miR-144 mimics組熒光素酶活性(0.90±0.15)無明顯差異(t=0.109,P=0.0916)。

圖4 miR-144與Nrf2結合位點

3 討 論

DM患者持續的高血糖及代謝紊亂會造成全身組織器官損傷,從而導致嚴重的并發癥,其中,肝病是DM患者死亡的主要原因〔2,10〕。2型DM致肝損傷占全部DM患者的90%以上,由于其發病機制的復雜性,目前尚無針對DM致肝損傷治療的特效藥物,因此其治療藥物的尋找仍十分迫切〔11〕。機體過度的氧化應激對DM致肝損傷具有促進作用,因此,抑制氧化應激可能是其治療的一個有前景的方向〔11〕。

由于天然活性成分的安全性,天然成分療法可能是一條有前途的途徑,而且其在治療DM方面表現出良好的治療效果〔10〕。G-Rg1是人參中具有藥理活性的一種主要有效成分,其具有強大的抗氧化、抗炎作用,并且已被證明對DM患者肝、腎及心血管損傷具有潛在的防治作用〔12,13〕。G-Rg1可通過降低轉化生長因子(TGF)-β1/Smads信號級聯反應來抑制氧化應激,改善DM腎病大鼠腎纖維化〔6〕。G-Rg1可通過抗炎及抗氧化作用對DM大鼠肝損傷起到保護作用〔13〕。在STZ誘導的DM大鼠模型中,G-Rg1可通過降血糖、血脂,抑制胰島素抵抗及肝細胞凋亡來起到保肝作用〔14〕。本研究結果前人研究結果相似〔14〕,并且高劑量的G-Rg1可起到與MET相同的作用,表明G-Rg1在DM大鼠中能夠促進肝臟中的糖原合成,以此起到降血糖的作用,此外,G-Rg1還可改善肝功能及抑制氧化應激,改善DM大鼠肝損傷。還有研究表明,G-Rg1可能通過激活Nrf2-ARE信號通路在DM大鼠中起到抗氧化作用,從而改善肝損傷〔15〕。Nrf2是一個能夠防御氧化應激的轉錄因子,可通過與ARE結合促進抗氧化因子HO-1表達,從而起到抗氧化作用,多項研究報道稱,Nrf2及HO-1表達在氧化應激下受到限制〔4,8〕。黃芪多糖能夠通過激活Nrf2/HO-1通路來達到改善DM大鼠肝損傷的目的〔11〕。本研究結果表明,G-Rg1能夠激活Nrf2/ARE信號通路,與前人研究結果相一致〔15〕。

miRNA作為長度僅有20～24個核苷酸的單鏈非編碼RNA,與靶基因mRNA結合后可在轉錄后水平上調節基因的表達,其參與DM等疾病的發生〔16〕,并且在DM致肝臟糖原代謝功能障礙及肝臟氧化應激損傷中具有重要作用〔17,18〕。miR-144在妊娠期糖尿病患者血漿中表達顯著上調,并且與胰島素抵抗明顯正相關〔19〕。研究發現,miR-144-3p在DM患者的循環外泌體中呈高表達狀態,其與心肌梗死小鼠新生血管形成受損有關〔20〕。miR-144在非酒精性脂肪性肝病小鼠肝臟中表達異常升高,抑制其表達可恢復其抗氧化能力〔21〕。有報道稱,Nrf2是miR-144的靶基因,G-Rg1可通過抑制miR-144激活Nrf2/ARE通路改善缺血/再灌注大鼠神經元損傷〔4〕。但G-Rg1是否可通過調控該通路改善DM大鼠肝損傷還未可知,本研究結果提示,G-Rg1對肝損傷的改善可能與其抑制miR-144表達來激活Nrf2/ARE通路有關。

綜上,G-Rg1通過抑制miR-144表達來激活Nrf2/ARE通路,以此抵抗氧化應激,從而起到改善DM大鼠的肝損傷的作用。目前本研究僅限于體內研究,因此接下來會著重于體外細胞實驗。