2型糖尿病氣陰兩虛證大鼠模型證候表現(xiàn)與血清代謝組學的相關(guān)性

黃曉巍 賈江維 李錦巍 張譯心 王鑫 劉博 紀鳳蘭 溫富春 徐惠波 丁濤

(長春中醫(yī)藥大學 1東北亞中醫(yī)藥研究院基礎(chǔ)研究所,吉林 長春 130117;2藥學院;3吉林省中醫(yī)藥科學院藥效毒理評價中心;4湖北省中醫(yī)院放射科;5吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院Ⅰ期臨床試驗研究室)

2型糖尿病是一種與衰老密切相關(guān)的疾病,65歲以上人群患糖尿病的風險高于其他年齡段人群〔1,2〕。老年2型糖尿病患者的治療策略應(yīng)個體化,力求維持或改善患者的生活質(zhì)量,并應(yīng)避免糖尿病治療產(chǎn)生的不良反應(yīng)〔3,4〕。中醫(yī)藥強調(diào)整體平衡和個體差異,注重疾病的根本原因和整體調(diào)節(jié),同時不良反應(yīng)較少,因此在老年人2型糖尿病的治療中具備獨特的優(yōu)勢〔5〕。證候作為中醫(yī)辨證論的核心,認識中醫(yī)證候的現(xiàn)代內(nèi)涵對于揭示中醫(yī)辨證論治具有重要意義〔6〕。臨床實踐及實驗研究發(fā)現(xiàn),2型糖尿病往往伴隨著氣陰兩虛的證候,但目前對于2型糖尿病氣陰兩虛證的研究大多停留在宏觀體征方面,較少有研究在微觀代謝物層面對其進行深究〔7,8〕。本課題組前期已建立2型糖尿病氣陰兩虛證病證結(jié)合動物模型〔9〕。本研究應(yīng)用對氣陰兩虛所致的消渴病具有確切治療效果的消渴靈片作為該模型的佐證藥,旨在進一步提高模型的客觀性與可重復(fù)性。基于血清代謝組學技術(shù)研究2型糖尿病氣陰兩虛證大鼠模型證候表現(xiàn)與血清差異代謝物及相關(guān)代謝通路之間的變化關(guān)系。

1 材料與方法

1.1動物、藥物、主要試劑和儀器 健康SPF級雄性SD大鼠44只,6周齡,體質(zhì)量150～160 g,購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司〔動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(遼)-2020-0001〕,飼養(yǎng)于吉林省中醫(yī)藥科學院屏蔽環(huán)境動物室〔動物使用許可證號:SYXK(吉)2022-0004〕,環(huán)境溫度18～25 ℃,相對濕度50%～60%,動物自由進食飲水。動物實驗經(jīng)過吉林省中醫(yī)藥科學院動物倫理委員會批準實施(JLSZKYDWLL2019-012)。消渴靈片(云南白藥,ZCA1901);鏈脲佐菌素(STZ,Sigma,WXBC7268V)。CD4+、CD8+、環(huán)腺苷酸(cAMP)和環(huán)鳥苷酸(cGMP)試劑盒(美國RD,202007);丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(南京建成,批號分別為:20200513、20200701、20200623)。YLS-13A大鼠抓力測定儀(濟南益延);ELx800酶標儀(美國BioTek);QUBIT 2.0 熒光計、Vanquish UHPLC系統(tǒng)、Orbitrap Q Exactive HF-X質(zhì)譜儀(美國賽默飛世爾)。

1.2模型制備、分組及給藥 將大鼠隨機分為對照組12只,模型組和消渴靈組各16只。對照組用普通飼料喂養(yǎng),模型組和消渴靈組用高糖高脂飼料喂養(yǎng)并于第4周末腹腔注射35 mg/kg STZ,對照組注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH4.2)。1 w后禁食12 h,尾靜脈采血測定模型組和消渴靈組空腹血糖,選取空腹血糖>11.1 mmol/L的大鼠按照血糖均衡原則重新分為模型組與消渴靈組各12只,第6周開始給予消渴靈組大鼠消渴靈2.2 g/(kg·d),實驗持續(xù)至第21周。

1.3大鼠一般狀態(tài)的采集方法與評分 依據(jù)《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》中2型糖尿病氣陰兩虛證患者臨床證候表現(xiàn),分別用運動狀態(tài)評分、精神狀態(tài)評分、體質(zhì)量、進食量、飲水量及抓力等指標,評價模型大鼠倦怠乏力、口渴喜飲、多食易饑等證候表現(xiàn)。對于運動及精神狀態(tài)評分:大鼠運動狀態(tài)為活躍,輕微聲響即抬頭,精神狀態(tài)正常為0分;行動遲緩,聲響加重才抬頭,精神狀態(tài)呆滯為1分;對聲響無反應(yīng),抓起再放下后無行動,精神狀態(tài)為萎靡時,評分為2分。

1.4大鼠空腹血糖測定 分別在實驗第6、9、13、17、21 w測定大鼠空腹血糖值。

1.5大鼠血清中CD4+、CD8+、cAMP、cGMP、MDA、SOD及GSH-Px含量測定 末次給藥后,禁食12 h,麻醉大鼠,采血,試劑盒檢測血清中CD4+、CD8+、cAMP、cGMP、MDA、SOD及GSH-Px水平。

1.6代謝組學分析 大鼠麻醉后腹主動脈取血,采集血樣后室溫靜置60 min,4 ℃條件下3 000 r/min離心10 min,吸取血清分裝于離心管中,-80 ℃保存?zhèn)溆谩⒋笫笱鍢悠愤M樣到Accucore HILIC柱(100×2.1 mm,2.6 μm),以0.3 ml/min的流速線性梯度進樣20 min。正極性模式的洗脫液為A液(含0.1% 甲酸的95%乙腈,10 mmol/L乙酸銨)和B液(含0.1%甲酸的95%乙腈,10 mmol/L乙酸銨)。負極性模式的洗脫液為洗脫液A(95%乙腈,10 mmol/L乙酸銨,pH9.0)和洗脫液B(50%乙腈,10 mmol/L乙酸銨,pH9.0)。溶劑梯度:2% B,1 min;2%升至50% B,16.5 min;50%降至2% B,2.5 min。質(zhì)譜儀在正/負極性模式下工作,噴霧電壓為3.2 kV,毛細管溫度為320 ℃,鞘氣流量為35 arb,輔助氣體流量為10 arb。使用Compound Discover V3.1(CD)軟件進行數(shù)據(jù)提取處理,化合物通過mzCloud和ChemSpider數(shù)據(jù)庫及CD內(nèi)置數(shù)據(jù)庫鑒定,樣品標準化采用Constant sum算法實現(xiàn),采用對數(shù)Log2轉(zhuǎn)化后并用Auto scaling算法完成歸一化。將標準化處理后的數(shù)據(jù)進行多元統(tǒng)計分析,依據(jù)VIP>1,P<0.05 篩選潛在的差異代謝物,通過HMDB數(shù)據(jù)庫鑒定內(nèi)源性差異代謝物,將得到的差異代謝物導(dǎo)入Metabo Analyst5.0進行代謝通路分析。

1.7統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組運動、精神狀態(tài)及體質(zhì)量、空腹血糖、進食量、飲水量、抓力 在第21周時,與對照組比較,模型組精神狀態(tài)、運動評分、進食量、飲水量及空腹血糖顯著升高,體質(zhì)量及抓力顯著降低(均P<0.05);與模型組比較,消渴靈組精神狀態(tài)及運動評分顯著降低,抓力顯著增加(P<0.05),而體質(zhì)量、空腹血糖、進食量及飲水量無顯著差異(均P>0.05)。見表1。

表1 各組各時間點運動、精神狀態(tài)評分、體質(zhì)量、空腹血糖、進食量、飲水量、抓力比較

續(xù)表1 各組各時間點運動、精神狀態(tài)評分、體質(zhì)量、空腹血糖、進食量、飲水量、抓力比較

2.2各組血清中CD4+、CD8+、cAMP、cGMP、MDA、SOD及GSH-Px水平 與對照組比較,模型組血清中CD4+、cGMP、SOD、GSH-Px含量及CD4+/CD8+顯著降低,cAMP、MDA含量及cAMP/cGMP顯著升高(均P<0.05);與模型組比較,消渴靈組血清中 CD4+、cGMP含量及CD4+/CD8+顯著升高,cAMP/cGMP顯著降低(均P<0.05)。見表2。

表2 各組血清 CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、cAMP、cGMP、cAMP/cGMP、MDA、SOD和GSH-Px水平

2.3主成分分析(PCA) PCA圖展現(xiàn)了樣品及組別間的大致距離關(guān)系,對照組與模型組、消渴靈組有明顯的組間分離趨勢。見圖1。

圖1 各組血清代謝物PCA

2.4正交偏最小二乘-判別分析(OPLS-DA)及置換檢驗 由于模型組與消渴靈組代謝輪廓未完全分離,故采用OPLS-DA進一步分析。可知Q2值均大于0.5,R2Y值均接近1,說明該模型的數(shù)據(jù)有效可靠且具有較好的預(yù)測能力(正離子模式下,模型組與對照組比較,R2Y=0.99,Q2=0.922,消渴靈組與模型組比較,R2Y=0.991,Q2=0.797;負離子模式下,模型組與對照組比較,R2Y=0.999,Q2=0.945,消渴靈組與模型組比較,R2Y=0.978,Q2=0.737)。從OPLS-DA得分圖中可以看出對照組、模型組和消渴靈組明顯相互分離,組內(nèi)相互靠近。見圖2。對OPLS-DA模型進行驗證,重復(fù)200次排列置換檢驗,Q2的回歸線在縱坐標上的截距均小于0,說明此模型不存在過擬合現(xiàn)象。

圖2 各組血清代謝物OPLS-DA分析

2.5差異代謝物的篩選 模型組與對照組、消渴靈組與模型組進行比較,符合P<0.05,VIP>1的差異代謝物,可用于進一步分析。模型組與對照組比較,消渴靈組與模型組比較,篩選得到具有相反變化趨勢的差異代謝物有27個,其中包括L-谷氨酸、花生四烯酸等。模型組上調(diào)了19個差異代謝物,下調(diào)了8個差異代謝物,給予消渴靈后可將這些差異代謝物的變化趨勢逆轉(zhuǎn)。見表3。對差異代謝物進行聚類分析以展現(xiàn)其變化趨勢。見圖3。

表3 大鼠血清差異代謝物的變化

2.6代謝通路分析 將篩選到的差異代謝物導(dǎo)入MetaboAnalyst5.0進行代謝通路分析,Pathway Impact>0.1認為是潛在的關(guān)鍵代謝通路,包括D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝,花生四烯酸代謝,丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝,精氨酸生物合成。見圖4。

1:D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝;2:花生四烯酸代謝;3:丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝;4:精氨酸生物合成圖4 2型糖尿病氣陰兩虛證大鼠血清代謝通路的變化

3 討 論

中醫(yī)學將糖尿病歸于“消渴病”范疇,消渴病基本病機在于氣陰虧虛。2型糖尿病氣陰兩虛證候是一個動態(tài)變化的過程,本研究在持續(xù)實驗過程中發(fā)現(xiàn),模型組大鼠從飼養(yǎng)第9周開始,逐漸出現(xiàn)疲勞乏力、精神萎靡、倦怠、口渴喜飲、多食易饑等氣陰兩虛證候的特征;并以宏觀體征的評價標準定期檢測,連續(xù)兩次檢測的各項指標變化穩(wěn)定,后結(jié)合生化、病理等指標,認為2型糖尿病氣陰兩虛證動物模型制備成功。本研究引入消渴靈作為反證組,目的是通過模型組與對照組比較,消渴靈組與模型組比較,從證候宏觀表現(xiàn)、實驗室判定指標、微觀差異代謝物3個維度客觀、系統(tǒng)地研究2型糖尿病氣陰兩虛證的本質(zhì)特征。本實驗結(jié)果說明,模型組大鼠的體征表現(xiàn)基本符合2型糖尿病氣陰兩虛證中醫(yī)臨床表現(xiàn)。2型糖尿病氣陰兩虛證往往表現(xiàn)出機體免疫功能障礙,當患者氣虛或免疫力降低時,CD4+數(shù)量下降,CD8+數(shù)量上升,CD4+/CD8+比值降低,臨床研究發(fā)現(xiàn)氣虛患者的免疫指標具有相同的變化趨勢〔10〕。環(huán)核苷酸對調(diào)節(jié)機體細胞代謝和免疫應(yīng)答有重要作用,陰虛時常伴隨cAMP升高或cAMP/cGMP升高,說明機體的環(huán)核苷酸代謝發(fā)生紊亂和免疫力下降〔11〕。這與本研究結(jié)果一致,表明2型糖尿病氣陰兩虛證病機在于機體代謝紊亂和免疫力低下。通過代謝組學技術(shù)篩選得到顯著性差異代謝物包括花生四烯酸、L-谷氨酸等;模型組大鼠血清代謝物較對照組產(chǎn)生波動,且給予消渴靈后,發(fā)生變化的代謝物整體上向?qū)φ战M回調(diào),提示2型糖尿病氣陰兩虛證大鼠機體代謝過程發(fā)生變化。

L-谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì),在免疫應(yīng)答、能量供應(yīng)和調(diào)節(jié)信號通路等過程中發(fā)揮重要作用〔12〕。L-谷氨酸參與丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝,D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝通路。機體內(nèi)丙氨酸水平降低會導(dǎo)致疲勞乏力和食欲變化,谷氨酸在谷氨酸脫羧酶催化下生成中樞抑制性遞質(zhì)γ-氨基丁酸產(chǎn)生中樞疲勞,天冬氨酸可加強機體抵抗疲勞及協(xié)助神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)定情緒〔13,14〕。有研究表明,谷氨酰胺可調(diào)節(jié)PI3K/AKT/GLUT4信號通路起降血糖作用〔15〕。本課題組前期已發(fā)現(xiàn)2型糖尿病氣陰兩虛證大鼠肝臟PI3K、AKT、GLUT4 較對照組表達顯著降低,消渴靈組肝臟PI3K、AKT、GLUT4較模型組表達有升高趨勢〔16〕。本文代謝組學結(jié)果表明,消渴靈干預(yù)后使該代謝通路的代謝水平趨向于對照組大鼠。結(jié)合實驗結(jié)果,推測2型糖尿病氣陰兩虛證大鼠出現(xiàn)疲勞乏力、精神萎靡、倦怠等氣陰兩虛證候表現(xiàn)與丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝,D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝通路密切相關(guān)。

花生四烯酸是人體組織中最豐富的多不飽和脂肪酸之一,這種多不飽和脂肪酸具有非常重要的生化作用〔17〕。有研究發(fā)現(xiàn),在STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病動物模型中,口服花生四烯酸可以恢復(fù)正常的抗氧化狀態(tài)來預(yù)防高血糖和提高機體對胰島素的敏感性〔18,19〕。本文代謝組學結(jié)果表明,消渴靈組大鼠血清中花生四烯酸含量顯著升高,使機體的花生四烯酸代謝水平趨向正常。在本研究中,2型糖尿病氣陰兩虛證大鼠血糖較對照組明顯升高,給予消渴靈后使大鼠空腹血糖在實驗第21周時有下降的趨勢,這可能與花生四烯酸代謝通路的變化有關(guān)。

精氨酸是先天免疫和適應(yīng)性免疫的重要營養(yǎng)物質(zhì),可以刺激免疫球蛋白M和免疫球蛋白a抗體產(chǎn)生〔20〕。有研究發(fā)現(xiàn),通過向創(chuàng)傷患者或小鼠輸注高劑量L-精氨酸來補充機體L-精氨酸,可使T細胞功能恢復(fù)和CD4+細胞數(shù)量增加〔21,22〕。精氨酸在細胞的氧化還原作用和抗氧化作用中也發(fā)揮重要作用,有研究發(fā)現(xiàn)精氨酸能夠增加促進大鼠的谷胱甘肽合成,提高機體抗氧化水平〔23〕。本文代謝組學結(jié)果表明,模型組免疫應(yīng)答能力下降和氧化應(yīng)激反應(yīng)增強與精氨酸生物合成相關(guān)。結(jié)合實驗結(jié)果,從微觀代謝物角度進一步說明2型糖尿病氣陰兩虛證大鼠證候表現(xiàn)與機體的免疫功能障礙和代謝紊亂有關(guān)。中醫(yī)藥側(cè)重通過調(diào)控宏觀證候、多靶點、多途徑來增強機體的免疫力和對疾病的抵抗力,從而辨治2型糖尿病氣陰兩虛證。

綜上,2型糖尿病氣陰兩虛證病證結(jié)合大鼠模型的證候表現(xiàn)可能與D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝,花生四烯酸代謝,丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝,精氨酸生物合成通路相關(guān);L-谷氨酸和花生四烯酸可能為2型糖尿病氣陰兩虛證潛在的特征代謝產(chǎn)物。