通心絡對高糖高脂誘導人主動脈內皮細胞損傷的保護作用

位庚 石夢瑩 鄭文麗 趙玉莎 劉贊朝

(1石家莊市第二醫院內分泌科,河北 石家莊 050001;2河北省糖尿病基礎醫學研究重點實驗室;3石家莊市糖尿病精準診療技術創新中心)

糖尿病可引起多組織和器官的損傷,其中糖尿病引發的心血管病變是其危害極大的一類并發癥,臨床中諸多糖尿病患者死于此并發癥〔1〕。已有研究表明血管內皮細胞受損是血管性疾病的觸發點〔2〕,而糖尿病患者大多為高糖和高脂狀態并存,這對血管內皮細胞有明顯的損傷作用〔3〕,可見,就防治糖尿病心血管并發癥而言,保護血管內皮細胞意義重大。中成藥通心絡可通絡止痛、活血散瘀,對心腦血管疾病防治效果極佳,對血管、血管內皮細胞及心臟組織均有保護作用,同時對血脂具調節功能〔4～7〕,但現今還未明確此藥能否有效保護高糖高脂所致的血管內皮細胞損傷。本研究體外培養人主動脈內皮細胞(HAECs),選用高糖高脂誘導其損傷,以模擬糖尿病心血管并發癥的主動脈血管內皮細胞狀態,觀察通心絡的干預作用。

1 材料和方法

1.1細胞來源 HAECs采購自美國Sciencell公司

1.2實驗用藥物 通心絡藥粉由以嶺藥業(石家莊)提供,參照文獻〔8〕,制備出10 mg/ml濃度的貯存液,先分裝,再冷凍存放,待用。

1.3試劑和儀器 棕櫚酸〔PA,Sigma公司(USA)〕;內皮細胞培養基(ECM)〔Gibco公司(USA)〕;活性氧簇(ROS)、乳酸脫氫酶(LDH)和三磷酸腺苷(ATP)試劑盒(均購于南京建成生物工程研究所);細胞計數試劑盒(CCK)-8〔購于同仁化學研究所(日本)〕;線粒體膜電位探針(JC)-1試劑盒〔購于Cayman公司(USA)〕;細胞色素(Cyt)-C抗體(美國Abcam公司);半干轉膜儀與垂直電泳儀〔Bio-Rad公司(USA)〕;流式細胞儀〔型號FACSAria Ⅲ, BD公司(USA)〕;多功能酶標儀〔Thermo公司(USA)〕;凝膠掃描儀(美國UVP公司)。

1.4實驗分組 HAECs 用含10%胎牛血清的ECM培養基培養,胰蛋白酶對對數生長期HAECs消化處理,每毫升的細胞量應控制在1×105個,細胞的接種器具為細胞培養皿(直徑6 cm)或細胞培養96孔板,待細胞增至80%融合,正式進入實驗。實驗分為5組,各組設置的平行復孔3～4個:(1)空白對照組:正常培養細胞;(2)高糖高脂組:換為葡萄糖和棕櫚酸含量依次為30 mmol/L和100 μmol/L的ECM培養基培養細胞;(3)通心絡低濃度組:換為通心絡(TXL)、葡萄糖和棕櫚酸含量依次為100 μg/ml、30 mmol/L和100 μmol/L的ECM培養基培養細胞;(4)通心絡中濃度組:換為TXL、葡萄糖和棕櫚酸含量依次為200 μg/ml、30 mmol/L和100 μmol/L的ECM培養基培養細胞;(5)通心絡高濃度組:換為TXL、葡萄糖和棕櫚酸含量依次為400 μg/ml、30 mmol/L和100 μmol/L的ECM培養基培養細胞。放至培養箱內,繼續培養24 h,待測定指標用。

1.5CCK-8法測定細胞生存活性 待在96孔板內培養的HAECs結束實驗,將舊培養基倒掉,向各孔內皆添加0.1 ml不含血清成分但含CCK-8的杜氏改良Eagle培養基(DMEM),在培養箱內,繼續培養60 min,由酶標儀對OD450 nm值展開測定。

1.6可見分光光度法測定細胞上清LDH含量 培養于96孔板的HAECs終止實驗后,吸取細胞上清液,于離心機上1 000 r/min離心2 min,吸取上清液,用可見分光光度法對其LDH水平展開測定,規范遵循說明書實施具體操作。

1.7試劑盒檢測細胞內ATP含量 待在6 cm培養皿內培養的HAECs結束實驗,用試劑盒對細胞ATP含量展開測定,規范遵循說明書實施具體操作。

1.8JC-1試劑盒測定細胞內線粒體膜電位(MMP) 待在96孔板內培養的HAECs結束實驗,去除上清液,其他實驗操作規范遵循說明書實施。

1.9流式細胞儀測定細胞中ROS含量 待在6 cm皿培養的HAECs結束實驗,留上清,再向細胞培養皿中加入2 ml不含血清成分但有DCFH-DA的DMEM培養基,放至培養箱中,繼續培養0.5 h,棄去上清,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗兩次,Trypsin消化后制備出細胞懸液,用流式細胞儀測定。

1.10Western印跡檢測細胞Cyt-C蛋白表達 培養于6 cm皿的HAECs終止實驗后,將培養液清理掉,移至冰上,使細胞完全裂解,待完成蛋白定量,取等量蛋白實施凝膠電泳處理,先轉膜,再封閉,結合Cyt-C一抗,于4 ℃溫度下,搖床過夜,結合二抗,用化學發光法對灰度值展開測定,甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參,用各目標蛋白和GAPDH的灰度值之比進行分析。

1.11統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1各組內皮細胞生存活性比較 與空白對照組比較,高糖高脂組細胞生存活性明顯減弱(P<0.05);通心絡干預后生存活性升高,與高糖高脂組相比,通心絡中、高濃度組有統計學差異(P<0.01)。見表1。

2.2各組內皮細胞上清液LDH漏出對比 與空白對照組相比,高糖高脂組細胞上清內LDH漏出顯著增多(P<0.01);與高糖高脂組比較,通心絡各濃度組細胞上清內LDH漏出明顯下降(P<0.01)。見表1。

2.3各組內皮細胞ATP含量比較 與空白對照組相比,高糖高脂組內皮細胞ATP含量明顯降低(P<0.01);與高糖高脂組比較,通心絡中、高濃度組孵育后細胞內ATP含量明顯升高(P<0.01)。見表1。

2.4各組內皮細胞MMP對比 與空白對照組相比,高糖高脂組細胞MMP顯著下降(P<0.01);與高糖高脂組比較,通心絡中、高濃度組細胞MMP明顯升高(P<0.01)。見表1。

2.5各組內皮細胞ROS比較 圖1流式圖中,橫軸為相對熒光強度,縱軸為細胞數目,P2門的位置固定,所以P2門中樣本與總體樣本的比例越大,則表明相對熒光強度越高。與空白對照組相比,高糖高脂組內皮細胞ROS熒光強度顯著上升(P<0.01),與高糖高脂組比較,通心絡中、高濃度組ROS熒光強度明顯降低(P<0.05,P<0.01)。見表1、圖1。

2.6各組內皮細胞Cyt-C蛋白表達比較 與空白對照組相比,高糖高脂組內皮細胞Cyt-C蛋白表達明顯上調(P<0.01);與高糖高脂組相比,通心絡不同濃度組Cyt-C蛋白表達明顯下降(P<0.05)。見表1、圖2。

表1 各組內皮細胞生存活性和細胞上清液LDH漏出、ATP含量及MMP、ROS及Cyt-C蛋白表達比較

圖1 各組內皮細胞ROS水平

1～5:空白對照組、高糖高脂組、通心絡低濃度組、通心絡中濃度組、通心絡高濃度組圖2 Western印跡檢測各組內皮細胞Cyt-C蛋白表達

3 討 論

糖尿病屬于一類代謝性病變,其病理基礎在于高血糖,會誘發多器官受損,危害極大。糖尿病導致的心血管病變是其危害極大的一類血管并發癥,眾多2型糖尿病病人一經確診就已有心血管病變存在〔9〕。已有研究表明,血管內皮細胞及平滑肌細胞功能障礙是糖尿病血管病變的初期表現,該損傷可逐步引發炎癥和血栓形成,最終導致血管病變形成〔10〕。血管內皮細胞的位置是在血流、血管壁兩者間,由一層扁平單核細胞構成,除了可合成與釋放諸多不同活性成分,使得血管調節功能與張力得以維持,同時直接接觸血液內各類刺激因子〔11〕。糖尿病病人在高血糖的病基上,通常合并脂代謝失調現象,而高糖高脂會導致血管內皮細胞受損〔12,13〕。通心絡膠囊在絡病理論的指導下研制而成,治療心腦血管疾病療效顯著。

細胞功能正常的基礎在于生存活性,本研究對HAECs行高糖高脂孵育,結果顯示HAECs生存活性大幅減弱,將通心絡添加至培養基內,能夠大幅增強細胞生存活性,同時以通心絡高濃度效果最佳。LDH為胞質標志酶,是細胞受損的敏感指標,若細胞膜受損,LDH向細胞外釋放,同時其釋放率正向相關于細胞受損程度〔14〕。本研究還對細胞上清液內LDH水平進行了測定,發現高糖高脂可引起LDH釋放量明顯增加,待和通心絡聯合孵育結束,LDH水平會大幅下降。臨床研究亦證實,通心絡膠囊能夠使冠心病病人的LDH含量大幅減少〔15〕。因此,以上研究結果提示,高糖高脂對HAECs有明顯的損傷作用,而通心絡可明顯減輕該損傷,且呈濃度依賴性。

線粒體為細胞提供能量,在細胞合成ATP、有氧呼吸方面,發揮著核心作用。若外界因素刺激細胞,胞膜通透性會提高,MMP是線粒體發揮功能的前提,MMP同時下降,使得細胞內外膜的氫(H)離子濃度差為零,線粒體見滲透性水腫現象,可導致線粒體外膜喪失完整性,進而線粒體中分布的Cyt-C向胞質轉移〔16〕,Cyt-C于線粒體內的水平下降,導致呼吸鏈電子傳遞中斷,ATP水平進而下降,導致細胞受損,乃至壞死〔17〕。若線粒體發生損傷,可釋放眾多ROS,聚集的ROS導致線粒體呼吸鏈解耦聯,由此釋放更多ROS,產生惡性循環〔18〕。本研究結果提示,通心絡能夠改善HAECs線粒體功能,抑制細胞的損傷。

綜上,高糖高脂能夠使人主動脈血管內皮細胞受損,通心絡可明顯抑制該損傷,其保護機制可能與通心絡通過降低線粒體內ROS以改善線粒體功能,進而保護血管內皮細胞有關。