鹽脅迫對不同苜蓿品種種子萌發(fā)的耐鹽性綜合評價

朱 琨,劉驊峻,馮成龍,李 波,劉鑫宇,馬浩然

(1.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院,抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室,黑龍江 齊齊哈爾 161006;2.黑龍江省扎龍國家級自然保護區(qū)管理局,黑龍江 齊齊哈爾 161002)

土壤鹽漬化引起的土壤退化是限制我國農(nóng)業(yè)的發(fā)展的主要因素之一,化肥大量施用及不合理灌溉等因素導(dǎo)致我國土壤次生鹽漬化程度不斷加劇[1-3],鹽漬化土地面積增多,這對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境均造成了不同程度的影響[4]。鹽脅迫是一種普遍存在的非生物脅迫,主要通過滲透效應(yīng)和離子毒害極大地限制植物的生長、發(fā)育和抑制種子萌發(fā)。種子萌發(fā)階段對鹽脅迫最為敏感,是決定植物能否在鹽堿土壤中生長發(fā)育的最關(guān)鍵時期,具有重要的生物學(xué)和生產(chǎn)實踐意義[5-6]。

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是一種營養(yǎng)價值豐富的優(yōu)質(zhì)的豆科牧草,其葉片具有排鹽機制,表現(xiàn)出較強的耐鹽堿。但是不同苜蓿品種間耐鹽性差異較大,選育耐鹽苜蓿品種對利用并改良鹽漬化土地具有重要意義[7-8]。前人研究NaCl鹽溶液對萌發(fā)期的苜蓿種子進行脅迫處理表明,低濃度鹽脅迫對種子萌發(fā)具有促進作用,脅迫強度增強則會抑制種子萌發(fā);且發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、發(fā)芽勢可作為紫花苜蓿萌發(fā)期耐鹽性評價指標[9-10]。本研究利用隸屬函數(shù)法,采用種子萌發(fā)多個鑒定指標,對10個苜蓿種質(zhì)材料進行萌發(fā)期耐鹽性綜合評價,初步篩選出抗鹽脅迫能力強的品種,為后期耐鹽脅迫苜蓿新品種選育和耐鹽脅迫基因的挖掘提供種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以 10 種國內(nèi)外不同的紫花苜蓿品種種子為試驗材料,均由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院提供,種子于 2020 年獲得,期間保存于 4℃冰箱中,材料的原產(chǎn)地和主要特性的信息見表1。

表1 苜蓿品種原產(chǎn)地和特性Table 1 Origin and characteristics of alfalfa

1.2 試驗方法

挑選籽粒飽滿的不同紫花苜蓿品種種子各100粒,均勻擺放在充分潤濕濾紙的發(fā)芽盒(12 cm×12 cm×6 cm)中,每組重復(fù) 3次。擺放完畢后稱重,記錄重量以便每天通過補水維持脅迫溶液的濃度,每天觀察并記錄發(fā)芽種子的個數(shù)。試驗于開始7 d后結(jié)束。隨機選取 10 株芽苗測量每個芽苗的胚根長、胚軸長及 10 株芽苗的總鮮重。測量完畢的芽苗置于濾紙上陰干 5 d,后在 60℃烘干箱中烘干至恒重,測量芽苗干重。

將配置好的不同濃度NaCl溶液倒入平鋪有濾紙的發(fā)芽盒中,使濾紙充分潤濕(約20 mL)。脅迫濃度分別為 50,100,150,200 和 250 mmol·L-1,對不同苜蓿品種種子進行不同濃度鹽脅迫,對照組(CK)用蒸餾水。將發(fā)芽盒置于HPG-280BX光照培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)溫度為 25℃,光周期為光照 16 h/黑暗 8 h,光照強度為 108 μmol·m-2·S-1。

1.3 測定指標

試驗期間每天調(diào)查記錄種子發(fā)芽數(shù),種子發(fā)芽以胚根達到種子長度的一半為準,統(tǒng)計發(fā)芽率、發(fā)芽勢、胚根長、胚軸長、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)等指標。發(fā)芽率(Germination rate,GR)=G7/N×100%(G7為發(fā)芽種子數(shù),N為供試種子數(shù));發(fā)芽勢(Germination potential,GP)=G3/N×100%(G3為第三天發(fā)芽種子數(shù));發(fā)芽指數(shù)(Germination index,GI)=ΣGt/Dt×100%(Dt表示相應(yīng)的發(fā)芽日數(shù),Gt為與Dt相對應(yīng)的每天發(fā)芽種子數(shù));活力指數(shù)(Vigor index,VI)=GI×S(S表示平均主根長)。

種子萌發(fā) 7 d后,在每個發(fā)芽盒中取 10 株長勢基本一致的芽苗,用直尺測量每一株的胚根長(Radicle length,RL)和胚軸長(Hypocotyl length,HL),對不同處理下的 10 株芽苗的胚根長和胚軸長取平均值。同時,對上述每個發(fā)芽盒中取 10 株長勢基本一致的芽苗,用吸水紙吸干芽苗上的水分,后用天平稱量 10 株芽苗的總鮮重,對稱量完鮮重的 10 株芽苗在 60℃下烘干至恒重,天平稱量后即為總干重,3次重復(fù)的平均值即為芽苗的鮮重(Fresh weight,FW)和干重(Dry weight,DW)。

1.4 耐鹽性評價及分析

耐鹽系數(shù)=(不同鹽濃度處理下平均測定值/對照組測定值)×100%

數(shù)據(jù)標準化:運用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法對耐鹽系數(shù)進行標準化處理,對測定數(shù)據(jù)運用模糊數(shù)學(xué)隸屬度公式進行轉(zhuǎn)換,隸屬函數(shù)公式為:

U(Xijk)= (Xijk-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(1)

式(1)中U(Xijk)為第i個品種第j個脅迫濃度的k項指標的隸屬度,Xmax,Xmin分別為k項指標的最大值和最小值。

權(quán)重和綜合評價D值[11]的確定:采用標準差系數(shù)法,用公式(2)計算標準差系數(shù)Vj,經(jīng)公式(3)歸一化后得到各個耐鹽指標的權(quán)重系數(shù)Wj。

(2)

Wj=Vj/ΣVj

(3)

種質(zhì)耐鹽綜合評價D值的計算公式為:

D=Σ(Xij×Wj)

(4)

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行顯著性分析(P<0.05 時有統(tǒng)計學(xué)意義)、主成分分析和相關(guān)性分析,用Excel 2020 對數(shù)據(jù)進行計算,數(shù)值為平均值±標準差。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對苜蓿種子萌發(fā)的影響

2.1.1種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢 除 50 mmol·L-1NaCl脅迫下的‘龍牧806’‘阿迪娜’和‘WL343HQ’的發(fā)芽率與CK比較略有增加外,其它各苜蓿品種種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢均隨鹽脅迫濃度的增加呈下降的變化趨勢(圖1A,1B)。NaCl脅迫濃度為 150 mmol·L-1時,‘阿迪娜’‘WL319HQ’和‘WL343HQ’種子發(fā)芽率在 66.667%～79.000%之間,‘阿迪娜’種子發(fā)芽勢最高為 59.667%,其它苜蓿品種種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢分別在 50% 和 35% 以下。

圖1 NaCl脅迫下苜蓿種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢的變化Fig.1 Changes of germination rate and germination potential of the seeds of alfalfa varieties under NaCl stress注:不同小寫字母表示不同鹽濃度處理差異顯著(P< 0.05),下同Note:Different lowercase letters indicate a significant difference for each variety under the different salt concentrations treatments at the 0.05 level,the same as below

從種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率結(jié)果綜合分析,在200～250 mmol·L-1的NaCl濃度脅迫下,‘阿迪娜’‘WL319HQ’和‘WL343HQ’種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢相對較高,而‘龍牧801’‘龍牧806’‘龍牧807’‘龍牧808’‘中苜1號’‘WL525HQ’‘驚喜’種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢相對較低,其中‘龍牧807’和‘WL525HQ’在此鹽濃度脅迫下種子不能萌發(fā),說明高鹽脅迫下嚴重影響了苜蓿種子的萌發(fā)和發(fā)芽的整齊性,NaCl濃度高于 150 mmol·L-1脅迫組苜蓿種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢與CK比較差異均顯著(P<0.05)。依據(jù) 10 種苜蓿種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢的耐鹽系數(shù)變化分析,‘阿迪娜’‘WL319HQ’‘WL343HQ’和‘驚喜’苜蓿種子的耐鹽系數(shù)比較高,推測這 4種苜蓿的耐鹽能力比較強。

2.1.2種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù) 除‘龍牧806’種子的活力指數(shù)外,其它各苜蓿品種種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均隨鹽脅迫濃度的增加呈下降的變化趨勢(圖2A,2B)。在NaCl脅迫濃度為 150 mmol·L-1時,‘阿迪娜’種子的發(fā)芽指數(shù)最高可達98.908,而‘龍牧808’‘WL319HQ’和‘WL343HQ’種子的發(fā)芽指數(shù)為 50 以上,‘龍牧801’‘龍牧806’‘龍牧807’‘中苜1號’‘WL525HQ’種子的發(fā)芽指數(shù)均低于 30;‘阿迪娜’種子的活力指數(shù)最高可達 2416.590,而‘龍牧808’‘WL319HQ’‘WL343HQ’和‘驚喜’種子的活力指數(shù)可達 1000 以上,‘龍牧806’‘龍牧807’‘中苜1號’‘WL525HQ’種子的活力指數(shù)均低于500以下。

圖2 NaCl脅迫下苜蓿種子的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的變化Fig.2 Changes of germination index and vigor index of the seeds of alfalfa varieties under NaCl stress

種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)結(jié)果綜合分析表明,在 200～250 mmol·L-1鹽濃度脅迫下,嚴重影響了種子的活力,抑制苜蓿種子胚根生長或胚根發(fā)生,導(dǎo)致苜蓿種子活力指數(shù)極低或無法測定。NaCl濃度高于 100 mmol·L-1脅迫組苜蓿種子的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)與CK比較差異均顯著(P<0.05)。10種苜蓿種子的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的耐鹽系數(shù)變化分析表明,‘阿迪娜’‘WL319HQ’和‘WL343HQ’種子的耐鹽系數(shù)均比較高,推測這 3種苜蓿的耐鹽能力比較強。

2.2 鹽脅迫對苜蓿芽苗生長的影響

2.2.1芽苗的胚根和胚軸長度 隨著鹽脅迫濃度的增加,各苜蓿品種芽苗的胚根和胚軸長度變化趨勢不一,在脅迫濃度達到 250 mmol·L-1時,培養(yǎng) 7 d的苜蓿的芽苗大部分均死亡,導(dǎo)致無法測量其胚根和胚軸長度的變化(圖3A,3B)。在NaCl脅迫濃度為150 mmol·L-1時,10 種苜蓿芽苗胚根長為 13.833～34.050 mm,胚軸長為 8.367～16.833 mm,其中‘WL343HQ’芽苗的胚根和‘阿迪娜’芽苗的胚軸最長。NaCl濃度在 150 mmol·L-1以上時,‘龍牧801’‘龍牧806’‘龍牧807’‘中苜1號’和‘WL525HQ’苜蓿芽苗胚根和胚軸長與CK比較差異顯著(P<0.05)。10 種苜蓿芽苗的耐鹽系數(shù)變化分析表明,‘龍牧806’‘阿迪娜’‘WL319HQ’和‘WL343HQ’苜蓿芽苗的胚根長耐鹽系數(shù)均比較高,‘龍牧806’和‘龍牧808’苜蓿芽苗的胚軸長耐鹽系數(shù)均比較高,說明鹽脅迫對 10 種苜蓿芽苗的生長產(chǎn)生了不同的影響。

圖3 NaCl脅迫下苜蓿芽苗的胚根長和胚軸長的變化Fig.3 Changes of radicle length and hypocotyl length of the seedlings of alfalfa varieties under NaCl stress

2.2.2芽苗的鮮重和干重 隨著鹽脅迫濃度的增加,各苜蓿品種芽苗的鮮重和干重變化趨勢不一,而脅迫濃度達到250 mmol·L-1時,培養(yǎng)7 d的苜蓿芽苗均死亡,導(dǎo)致無法測量其鮮重和干重的變化(圖4A,4B)。在NaCl脅迫濃度為150 mmol·L-1時,10種苜蓿芽苗鮮重為93.733～237.200 mg,干重為14.033～19.100 mg,其中‘WL343HQ’芽苗的鮮重和‘驚喜’芽苗的干重最重。NaCl濃度在150 mmol·L-1以上時,‘龍牧807’‘WL319HQ’和‘WL343HQ’芽苗鮮重與CK比較差異顯著(P<0.05),‘龍牧807’‘WL319HQ’‘W L525HQ’‘WL343HQ’和‘龍牧807’芽苗干重與CK比較差異顯著(P<0.05)外,其它苜蓿芽苗的鮮重和干重與CK比較差異不顯著。從 10 種苜蓿芽苗的耐鹽系數(shù)變化分析,‘龍牧806’‘龍牧808’‘WL525HQ’苜蓿芽苗鮮重的耐鹽系數(shù)比較高,‘龍牧806’和‘阿迪娜’苜蓿胚苗干重的耐鹽系數(shù)比較高,說明鹽脅迫對 10 種苜蓿芽苗的生物量的積累產(chǎn)生了不同的影響。

圖4 NaCl脅迫下苜蓿芽苗的鮮重和干重的變化Fig.4 Changes of fresh and dry weight of the seedlings of alfalfa varieties under NaCl stress

2.3 苜蓿耐鹽系數(shù)的主成分和相關(guān)性分析

2.3.1主成分分析 為了篩選抗鹽性種子萌發(fā)性狀指標,對各個指標的耐鹽系數(shù)(表2)進行主成分分析,主成分分析的降維過程中,累計方差貢獻率大于 80% 的主成分具有一定代表性。表3結(jié)果表明,將 8個單項指標轉(zhuǎn)換獲得 2個主成分的累計貢獻率達 85.540%,第 1主成分的特征值最大,貢獻率達 60.039%,GR,GP,GI,VI和RL具有絕對值較大的特征向量(表4),均達到 0.190 以上,表明第 1主成分中這 5個指標占主要因子;第 2主成分的貢獻率達 25.502%,其中HL,FW和DW具有絕對值較大的特征向量,兩主成分比較第 1主成分的貢獻率最大,特征值總和達到 6.843,表明這 2個主成分已經(jīng)能代表所考察性狀的絕大部分信息。

表2 鹽脅迫下苜蓿種子萌發(fā)各指標耐鹽系數(shù)Table 2 Salt tolerance coefficients for germination indicators of the seeds of alfalfa varieties under salt stress

表3 各指標主成分分析的特征值和方差貢獻率Table 3 Characteristeristic value and variance contribution rate in principal component analysis

表4 各指標主成分分析矩陣和特征向量Table 4 The matrix and eigenvector of germination indicators in principal component analysis

2.3.2相關(guān)性分析 以10種紫花苜蓿品種的8項種子萌發(fā)性狀指標的耐鹽系數(shù)進行相關(guān)性分析,其結(jié)果見表5。GR與GP,GI,VI,RL,GP與GI,VI,RL與GI,VI均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系,相關(guān)系數(shù)均為0.800以上;GP與RL和GI與VI呈顯著正相關(guān)關(guān)系,相關(guān)系數(shù)分別為0.762和0.954;其他各指標間均有一定的正相關(guān)和負相關(guān)關(guān)系,但相關(guān)系數(shù)比較小。

表5 種子萌發(fā)指標的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis of seed germination indicators

2.4 隸屬函數(shù)值及耐鹽性綜合評價

鹽脅迫對種子萌發(fā)的發(fā)芽率等 8項形態(tài)指標影響不同,應(yīng)用單一指標不能準確反映NaCl脅迫對苜蓿種子萌發(fā)的脅迫作用。依據(jù)各指標耐鹽系數(shù)綜合評價D值的變化可知(表6),10 個苜蓿品種在NaCl脅迫下,綜合評價D值由大到小的排序為:‘阿迪娜’>‘WL343HQ’>‘WL319HQ’>‘龍牧806’>‘驚喜’>‘龍牧808’>‘龍牧801’>‘中苜1號’>‘WL525HQ’>‘龍牧807’。根據(jù)此結(jié)果將 10 種苜蓿品種分為 3個類群,分別為(1)強耐鹽品種(‘阿迪娜’‘WL343HQ’‘WL319HQ’);(2)中耐鹽品種(‘龍牧806’‘驚喜’‘龍牧808’‘龍牧801’‘中苜1號’);(3)弱耐鹽品種(‘WL525HQ’‘龍牧807’)。篩選的 10 種苜蓿品種中,國外的苜蓿品種相對于國內(nèi)的苜蓿品種抗NaCl能力更強些,其中‘阿迪娜’苜蓿的耐NaCl脅迫能力最強。

表6 NaCl脅迫各苜蓿品種各指標隸屬值、權(quán)重系數(shù)、綜合評價D值Table 6 Membership function value,weight coefficient,comprehensive evaluation D value of each alfalfa variety under NaCl stress

3 討論

3.1 氯化鈉脅迫對苜蓿種子萌發(fā)的影響

植物的整個生長發(fā)育過程受鹽漬土影響比較大,不同生育時期對鹽脅迫的敏感度不同,其中種子萌發(fā)期是對鹽脅迫最為敏感的階段,此階段受自身基因和外界環(huán)境因素的共同影響[12],可通過滲透脅迫和離子毒害等作用對植物種子萌發(fā)造成傷害,進而影響種子的萌發(fā)和芽苗生長潛勢[13-14]。

植物耐鹽能力決定了鹽環(huán)境下植物的生長狀況,鹽脅迫下植物種子的GR,GP,GI,VI等萌發(fā)性狀往往遭受不同程度的逆境危害。本試驗在種子萌發(fā)期從GR,GP,GI,VI 4個方面對苜蓿品種的耐鹽性進行比較研究,隨著鹽濃度增加種子萌發(fā)性狀的相關(guān)指標受到不同程度的抑制。NaCl濃度超過 150 mmol·L-1,影響苜蓿種子的活力,甚至導(dǎo)致部分苜蓿品種的種子無法萌發(fā)。這與劉劍光和汪霞等人研究中鹽脅迫會降低棉種子和多花黑麥草種子的活力、抑制其萌發(fā)觀點相一致[15-16]。而篩選出抗鹽性強的‘阿迪娜’‘WL319HQ’和‘WL343HQ’苜蓿品種,則在高鹽濃度下其種子仍有較高的萌發(fā)能力。

種子萌發(fā)后胚芽和胚根的生長是種子由萌發(fā)期向苗期過渡的重要階段,直接關(guān)系到幼苗后期的生長發(fā)育及其對環(huán)境的耐受性。本試驗從RL,HL,FW和DW變化分析發(fā)現(xiàn),中度鹽害對苜蓿芽苗生長指標的影響比較大,當NaCl濃度達到 150 mmol·L-1時,苜蓿芽苗生長緩慢;NaCl濃度達到 200 mmol·L-1及更高濃度,導(dǎo)致已萌發(fā)的芽苗腐爛,極大影響種子芽苗生長,這與王艷琳和趙輝等[17-18]研究結(jié)果相一致,而本試驗篩選得到抗鹽性強的‘阿迪娜’‘WL319HQ’和‘WL343HQ’苜蓿在高NaCl濃度脅迫下仍有較高的芽苗生長能力。

3.2 紫花苜蓿耐鹽性綜合評價

植物的耐鹽性為多基因控制的數(shù)量性狀,且不同植物和同種植物的不同基因型間耐鹽性存在較大差異,僅用一兩個指標進行評價往往無法全面反映一種植物的耐鹽性[19]。耐鹽系數(shù)顯示了對照和鹽處理品種在各項指標上的比較結(jié)果,它通常被用作評價作物耐鹽性的標準。本研究以GR,GP,GI,VI,RL,HL,FW和DW等 8個指標對供試苜蓿材料耐鹽性評價中,發(fā)現(xiàn)這些單一指標的耐鹽系數(shù)雖從不同角度反映了種質(zhì)材料耐鹽性的強弱,但它們對種質(zhì)材料耐鹽性的評價結(jié)果并不相一致,如‘阿迪娜’苜蓿,GP,GI,VI,的耐鹽系數(shù)最高,但GR,RL,HL,DW和FW指標的耐鹽系數(shù)并不是最高。單一種子萌發(fā)指標指標的耐鹽性評價結(jié)果與綜合評價D值的耐鹽性評價結(jié)果之間存在不同程度的差異,所以在苜蓿種質(zhì)資源的耐鹽性篩選中考慮多個指標的綜合評價是十分必要的[20-21]。這與前人提出的植物資源耐鹽性鑒定時,應(yīng)對多個指標進行綜合評價才能準確反映植物耐鹽性的觀點是一致的[22-23]。

通過對各苜蓿品種隸屬函數(shù)和D值綜合分析可知,GR,GP,GI,VI,RL,HL,FW和DW等指標較好地反映各苜蓿品種對NaCl的抗性。利用隸屬函數(shù)法,賦予 8個萌發(fā)指標以權(quán)重,通過矩陣運算和綜合排序可知,在鹽脅迫下‘阿迪娜’的綜合D值均為第一,‘龍牧807’的綜合D值最低,利用D值對苜蓿種質(zhì)資源的耐鹽性進行綜合評價,解決了植物耐鹽性評價方法中多個指標之間無法進行統(tǒng)一比較的問題。這與前人的發(fā)現(xiàn)類似[23-25],這種綜合評價體系的構(gòu)建會為耐鹽性優(yōu)質(zhì)牧草的選育提供一定依據(jù)。

4 結(jié)論

10種紫花苜蓿品種的種子在不同濃度(50,100,150,200,250 mmol·L-1)氯化鈉脅迫下,發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、胚根長、胚芽長、鮮重和干重等 8項指標均表現(xiàn)出不同的變化趨勢,利用隸屬函數(shù)法、權(quán)重系數(shù)和綜合評價D值分析,10 種苜蓿品種耐鹽性強弱差異比較大,其中‘阿迪娜’‘WL343HQ’‘WL319HQ’的耐鹽性最強,‘龍牧806’‘龍牧808’‘龍牧801’‘驚喜’‘中苜1號’為中等耐鹽品種,‘WL525HQ’‘龍牧807’的耐鹽性比較差。