杏鮑菇生物法絮凝斜生柵藻的工藝優(yōu)化和絮凝機(jī)制

摘要： 為更好地探索生物絮凝法采收微藻細(xì)胞的可行性，考察了杏鮑菇菌絲球絮凝斜生柵藻的效果，在單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了絮凝工藝，采用Zeta電位分析法、熒光分析和傅里葉紅外光譜分析法從靜電作用、胞外聚合物等角度探討了真菌生物絮凝微藻的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，最佳的工藝條件為：pH=3、絮凝溫度26 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min、藻液初始吸光度A0=0.6，此條件下絮凝率達(dá)到85.67%，且對(duì)絮凝效果的影響為藻液初始吸光度＞轉(zhuǎn)速=溫度＞時(shí)間。杏鮑菇菌絲球絮凝斜生柵藻以化學(xué)吸附為主，靜電作用、蛋白質(zhì)和腐殖酸等胞外聚合物、細(xì)胞表面官能團(tuán)均影響絮凝效果。本研究將為利用真菌綠色安全地絮凝微藻、提高微藻采收率提供重要參考。

關(guān)鍵詞： 斜生柵藻；杏鮑菇；生物絮凝；工藝優(yōu)化；絮凝機(jī)制

中圖分類號(hào)： Q81

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

微藻有很高的利用價(jià)值，可以用于養(yǎng)殖廢水的凈化處理、微藻營養(yǎng)保健品或者醫(yī)藥產(chǎn)品開發(fā)、生物柴油的煉制等^［1-2］，但其大規(guī)模應(yīng)用還是受到了限制，其中微藻采收成本高是重要限制因素之一^［3］。微藻采收方法主要包括：物理法，以離心和沉降為主；化學(xué)法，即在微藻培養(yǎng)液中加入氯化鐵、明礬等無機(jī)絮凝劑^［4］；絮凝法，包括采用殼聚糖等有機(jī)絮凝劑絮凝^［5］、電絮凝和磁絮凝及生物絮凝。物理和化學(xué)采收方法存在能源消耗大、采收效率低、引入外源化合物造成二次污染等缺點(diǎn)，而生物絮凝法主要利用真菌、細(xì)菌等分泌的胞外聚合物或表面電荷達(dá)到絮凝目的，具有能耗低、綠色環(huán)保且不引入化學(xué)物質(zhì)因而不影響后端微藻生物質(zhì)的應(yīng)用等優(yōu)勢，是當(dāng)前微藻絮凝采收的研究熱點(diǎn)。譬如，CHU等^［6］用米曲霉絮凝小球藻5 h內(nèi)達(dá)到了99.23%的絮凝率；BANSFIELD等^［7］研究靈芝、平菇對(duì)細(xì)小裸藻的絮凝情況，絮凝率為62%～75%。生物絮凝后形成的菌絲球體積較大，可通過簡單的過濾、沉降等方法分離，提高了采收效率。

斜生柵藻（Scendesmus obliquus）為綠藻門，綠球藻目，真集結(jié)亞目，柵藻科，柵藻屬，在廢水處理領(lǐng)域有很好的應(yīng)用^［8］。本研究以斜生柵藻為研究對(duì)象，經(jīng)過前期對(duì)5種食用菌的初步篩選，發(fā)現(xiàn)杏鮑菇（Pleurotus eryngii）菌絲球?qū)π鄙鷸旁逍跄Ч^好，因此，本研究利用杏鮑菇菌絲球絮凝采收斜生柵藻的工藝條件，并進(jìn)一步從細(xì)胞表面電荷特征、胞外聚合物分析等角度探討了杏鮑菇菌絲球絮凝斜生柵藻的機(jī)制，為采用生物法絮凝采收微藻的研究和工業(yè)應(yīng)用提供理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藻種與菌株

實(shí)驗(yàn)所用斜生柵藻（S. obliquus）購自上海光語生物科技有限公司；實(shí)驗(yàn)所用杏鮑菇（P. eryngii）由煙臺(tái)大學(xué)食用菌實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 斜生柵藻和杏鮑菇菌絲球的培養(yǎng)

將斜生柵藻接種至含有3 L滅菌的BG-11培養(yǎng)液的5 L錐形瓶中，通入空氣，在培養(yǎng)溫度為（25±1） ℃，光照強(qiáng)度為3000～4000 lux，光暗比為12∶12的條件下培養(yǎng)。

將杏鮑菇接種到含有200 mL已滅菌PDB的錐形瓶中，置于恒溫震蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件設(shè)置為25.0 ℃、140 r/min，培養(yǎng)7 d，收獲菌絲球。

1.3 斜生柵藻生物量和絮凝率的計(jì)算

斜生柵藻生物量測定采用分光光度法，通過測定斜生柵藻藻液在750 nm處的吸光度A來間接表示斜生柵藻生物量。

絮凝率R計(jì)算公式如下：

R=A0-AtA0 ×100%，

其中，A0為絮凝前斜生柵藻藻液的吸光度，At為絮凝后斜生柵藻藻液的吸光度。

1.4 絮凝工藝條件的優(yōu)化

1.4.1 絮凝條件的單因素優(yōu)化設(shè)計(jì)

將100 mL培養(yǎng)至穩(wěn)定期的斜生柵藻藻液放入錐形瓶中，加入5 g（濕重）杏鮑菇菌絲球，分別考察培養(yǎng)液初始pH、溫度、轉(zhuǎn)速和藻液初始吸光度A0四個(gè)因素對(duì)絮凝效果的影響，單因素水平見表1。

1.4.2 絮凝條件的正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以絮凝效率為觀察指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)因素水平表（表2），考察溫度、轉(zhuǎn)速和藻液初始吸光度A0和絮凝時(shí)間對(duì)絮凝效果的影響。

1.5 吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

將A0=0.6的100 mL斜生柵藻藻液置于300 mL錐形瓶中，藻液pH調(diào)為3左右，加入5 g（濕重）的杏鮑菇菌絲球，將錐形瓶置于26 ℃、180 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中，測定其在0、10、20、30、60、90、120、150、180、210、240、270、300、330 min處上清液的A0，用偽一階方程與偽二階方程對(duì)吸附過程進(jìn)行擬合，探究杏鮑菇菌絲球絮凝斜生柵藻的吸附特性。

偽一階動(dòng)力學(xué)方程為

ln（Qe-Qt）=lnQe-K1t/2.303，

偽二階動(dòng)力學(xué)方程為t/Qt=1/K2Q2e+t/Qe，

其中，Qt （ mg·g ^-1） 和 Qe （ mg·g ^-1）分別是時(shí)間 t 和平衡時(shí)菌絲球?qū)π鄙鷸旁宓奈搅? K1 （ min^-1）和 K2 （min ^-1） 分別是偽一階和偽二階速率常數(shù)。

1.6 表面電位的測定

采用Zeta電位儀，分別測定斜生柵藻、杏鮑菇菌絲球以及藻菌球的表面電位，探究絮凝前后藻菌體系表面電位的變化。將沖洗干凈的菌絲球勻漿得到勻漿液，將勻漿液和藻液的pH分別調(diào)至3、4、5、6、7、8、9、10、11，測定各pH下的表面電位。

1.7 胞外聚合物表面官能團(tuán)分析

采用熒光分光光度法測胞外聚合物，將斜生柵藻、杏鮑菇菌絲球、絮凝后上清液、藻菌球分別于60 ℃水浴鍋中加熱30 min，8000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min，獲取的上清液用0.22 μm的濾膜過濾，得到的溶液用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行測定。

采用傅里葉紅外光譜測定凍干樣品的表面官能團(tuán)，將斜生柵藻、杏鮑菇菌絲球和藻菌球沖洗干凈后凍干，用紅外光譜儀（島津84005）進(jìn)行測定。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析和LSD法檢驗(yàn)。當(dāng)Plt;0.05時(shí)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物絮凝工藝條件的優(yōu)化

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果 圖1顯示了初始pH、溫度、轉(zhuǎn)速、藻液初始吸光度A0對(duì)杏鮑菇菌絲球絮凝斜生柵藻效果的影響。由圖1（a）可見，pH對(duì)微藻絮凝效果有顯著影響，pH為3時(shí)，絮凝效果最好，5 h后絮凝率達(dá)到了73.45%，與其他實(shí)驗(yàn)組之間存在顯著性差異（Plt;0.05）；絮凝時(shí)溫度升高有利于絮凝，圖1（b）結(jié)果顯示，26 ℃時(shí)絮凝率最高為83.55%，顯著高于20 ℃、23 ℃實(shí)驗(yàn)組（Plt;0.05），但溫度進(jìn)一步升高，絮凝效果無顯著性差異；轉(zhuǎn)速提高有利于微藻絮凝，圖1（c）顯示180 r/min下微藻絮凝率最高，達(dá)到83.55%，顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組（Plt;0.05）；藻液初始吸光度A0越高，絮凝率越低，圖1（d）顯示藻液初始吸光度A0為0.6時(shí)，絮凝率最高80.99%。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表明，低pH、高的轉(zhuǎn)速和一定程度提高溫度有利于微藻絮凝，分析原因?yàn)椋涸礁叩霓D(zhuǎn)速，微藻與菌絲球的碰撞機(jī)會(huì)越多，因此絮凝率越高，這與CHEN的研究^［9］一致；pH降低，藻菌之間的靜電斥力越低、越有利于微藻絮凝^［2］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，pHgt;5的三個(gè)實(shí)驗(yàn)組絮凝率比pH=5的高，分析與CHU提出的較高的pH可以刺激真菌胞外聚合物的分泌有關(guān)^［6］，藻菌絮凝受到電荷中和、胞外代謝物等多種因素的影響；低溫下絮凝率低的原因分析與杏鮑菇菌絲球和斜生柵藻在低溫下代謝受到抑制而藻菌代謝產(chǎn)物在藻菌絮凝中起著重要的作用有關(guān)^［11-12］；A0=1.3組在2 h后絮凝率變低，發(fā)生了解析現(xiàn)象，所以固定菌絲球添加量不變的情況下，過高的藻液初始吸光度A0會(huì)使達(dá)到吸附飽和的藻菌球發(fā)生解析。

2.1.2 絮凝工藝正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及方差分析如表3和表4所示，根據(jù)各試驗(yàn)因子的平均數(shù)可以看出，最優(yōu)的絮凝條件為：溫度26 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min、A0=0.6，絮凝時(shí)間5 h，此條件下絮凝率為85.67%。根據(jù)差值R可以看出，各因素對(duì)絮凝率的影響從大到小為藻液初始吸光度A0＞轉(zhuǎn)速=溫度＞時(shí)間，且轉(zhuǎn)速及藻液初始吸光度A0對(duì)杏鮑菇菌絲球絮凝斜生柵藻的效果均存在顯著影響（P＜0.05）。

2.2 杏鮑菇菌絲球絮凝斜生柵藻的機(jī)制分析

2.2.1 絮凝吸附動(dòng)力學(xué)

杏鮑菇菌絲球絮凝斜生柵藻偽一階、偽二階動(dòng)力學(xué)擬合結(jié)果如圖2所示。圖中結(jié)果顯示偽一階動(dòng)力學(xué)和偽二階動(dòng)力學(xué)的R2值均大于0.9，且偽二階動(dòng)力學(xué)擬合方程的R2值（0.990）大于偽一階動(dòng)力學(xué)方程的R2值（0.924）。偽一階動(dòng)力學(xué)方程和偽二階動(dòng)力學(xué)描述的分別是物理吸附和化學(xué)吸附，說明杏鮑菇菌絲球?qū)π鄙鷸旁宓奈街饕揽炕瘜W(xué)吸附（共價(jià)鍵、離子鍵的作用），物理吸附（范德華力）次之。這與NIE等^［13］關(guān)于米曲霉絮凝銅綠微囊藻以化學(xué)吸附為主、物理吸附為輔的結(jié)果一致。

2.2.2 藻菌體系電位表征

圖3顯示了杏鮑菇菌絲球、斜生柵藻的Zeta電位隨pH的變化，結(jié)果表明，在pH=3時(shí)，斜生柵藻表面電位為負(fù)，杏鮑菇菌絲球表面電位為正，此時(shí)帶正電的杏鮑菇菌絲球與帶負(fù)電的斜生柵藻會(huì)發(fā)生電荷中和，促進(jìn)微藻絮凝。藻菌球在pH=3時(shí)的Zeta電位為-1.51 mV，帶負(fù)電且電位絕對(duì)值小于斜生柵藻，說明杏鮑菇菌絲球表面電荷被微藻飽和。此結(jié)果與“2.1.1 ”中pH=3為最優(yōu)條件的結(jié)果吻合。

隨著pH的增大，斜生柵藻和杏鮑菇菌絲球表面皆帶負(fù)電荷，導(dǎo)致兩者靜電斥力增大，絮凝率降低，所以理論上pH越高，絮凝率越低，但根據(jù)之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，斜生柵藻絮凝率并沒有隨著pH的升高而下降，反而pH為7、9、11時(shí)的絮凝率高于pH為5的絮凝率，這一現(xiàn)象說明在杏鮑菇菌絲球絮凝斜生柵藻的過程中，不只有靜電引力的作用，藻菌表面分泌的胞外聚合物可能也會(huì)促進(jìn)藻菌之間的絮凝，提高絮凝率。

2.2.3 藻菌體系胞外聚合物分析

對(duì)斜生柵藻、杏鮑菇菌絲球、絮凝后上清液、藻菌球的胞外聚合物進(jìn)行三維熒光光譜分析，結(jié)果如圖4所示，其中，Ⅰamp;Ⅱ區(qū)、Ⅲ區(qū)、Ⅳ區(qū)、Ⅴ區(qū)代表的物質(zhì)類型分別為熒光芳香類蛋白、類富里酸、溶解性微生物代謝產(chǎn)物（例如多糖、蛋白質(zhì)）、腐殖酸類。由圖4可見，微藻的熒光峰出現(xiàn)在Ⅰamp;Ⅱ區(qū)和Ⅳ區(qū)，代表的是芳香族氨基酸色氨酸和蛋白質(zhì)類可溶性代謝物類酪氨酸相關(guān)的物質(zhì)^［14］；杏鮑菇菌絲球、絮凝后上清液、藻菌球的熒光峰均出現(xiàn)在Ⅳ區(qū)和Ⅴ區(qū)，為蛋白質(zhì)峰和腐殖質(zhì)峰。結(jié)果表明，在絮凝中主要起作用的胞外聚合物為藻菌分泌的蛋白質(zhì)及腐殖酸類物質(zhì)。真菌胞外聚合物中含有的大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、多糖等，可以通過芳環(huán)之間的分子間力來吸附微藻，使微藻附著在菌絲球表面^［11］，腐殖質(zhì)含有多種氨基，羰基和苯酚羥基，可以決定有機(jī)聚合物的遷移和隨后的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的有機(jī)物可能有助于絮凝^［6，15］。另外，絲狀真菌可以表達(dá)富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)，具有疏水性、黏附性，能夠通過疏水相互作用使微藻附著在菌絲體中^［16］。

與絮凝前的微藻相比，絮凝后上清液的蛋白質(zhì)峰熒光強(qiáng)度稍有減弱，并多出腐殖質(zhì)峰，有研究表明真菌菌絲的胞外聚合物不僅能與微藻細(xì)胞相互作用，而且對(duì)微藻代謝產(chǎn)物的去除也有顯著影響^［13］，這可能是絮凝后上清液蛋白質(zhì)峰較弱的原因；絮凝后菌絲球的蛋白質(zhì)峰強(qiáng)度稍強(qiáng)，而腐殖質(zhì)峰較弱，說明微藻和真菌可以互相促進(jìn)代謝，驗(yàn)證藻菌間存在一定的協(xié)同作用。WANG等^［17］的研究也表明，真菌-微藻相互作用會(huì)使富含色氨酸的蛋白質(zhì)含量增加。

2.2.4 藻菌體系表面官能團(tuán)分析 由圖5斜生柵藻、杏鮑菇菌絲球、藻菌球的傅里葉變換紅外光譜圖可見，藻菌球和杏鮑菇菌絲球特征峰的位置幾乎一致，絮凝形成的藻菌球特征峰峰值強(qiáng)度均弱于菌絲球。有研究表明，絮凝后絮凝劑中的活性位點(diǎn)會(huì)被微藻占據(jù)，降低官能團(tuán)拉伸振動(dòng)的強(qiáng)度^［13］，所以菌絲球表面的官能團(tuán)與微藻結(jié)合導(dǎo)致微藻絮凝。藻菌球在3417 cm、1654 、1078 cm^-1處的特征峰比真菌弱很多，說明這三個(gè)特征峰對(duì)應(yīng)的N—H、C═O、P—O在杏鮑菇菌絲球絮凝斜生柵藻的過程中起了較為重要的作用。

表5顯示了斜生柵藻、杏鮑菇菌絲球、藻菌球傅里葉變換紅外光譜中與主要振動(dòng)相關(guān)的表面官能團(tuán)及其振動(dòng)形式。酰胺基團(tuán)與真菌細(xì)胞壁中的糖胺聚糖和蛋白質(zhì)有關(guān)^［18］，主要來源于N-乙酰葡糖胺和乙酰半乳糖胺半乳聚糖，酰胺帶正電，可以與帶負(fù)電的微藻結(jié)合，使微藻吸附在真菌上^［13］。苯環(huán)多存在于細(xì)胞分泌的腐殖質(zhì)和大多數(shù)蛋白質(zhì)中，屬于芳香環(huán)，有研究表明真菌-微藻芳香環(huán)的π-電子系統(tǒng)之間的相互作用（π-π*躍遷）參加了真菌對(duì)微藻的絮凝^［19］。

3 結(jié) 論

本研究利用杏鮑菇形成的菌絲球絮凝斜生柵藻，開發(fā)了一種綠色安全、能耗低的微藻絮凝方法，最佳絮凝條件為pH=3、絮凝溫度26 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min、藻液初始吸光度A0=0.6，此條件下經(jīng)過5 h絮凝率達(dá)到85.67%。對(duì)絮凝機(jī)制的研究表明，真菌絮凝微藻過程以化學(xué)吸附為主，靜電作用、胞外聚合物的蛋白質(zhì)代謝物和腐殖質(zhì)以及酰胺等表面官能團(tuán)在斜生柵藻的絮凝過程中起重要作用。本研究為開發(fā)經(jīng)濟(jì)高效、綠色安全的微藻采收方法提供參考，有利于促進(jìn)微藻生物質(zhì)的工業(yè)化應(yīng)用。

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Process Optimization and Flocculation Mechanism on Biological Flocculation of Scendesmus obliquus by Pleurotus eryngii

SUN Liqin， JI Songsong， WANG Xiangying， LI Yan

（School of Life Sciences， Yantai University， Yantai 264005， China）

Abstract：To better explore the biological flocculation effect on microalgae， the flocculation of P. eryngii mycelium pellets on S. obliquus cells is investigated. The flocculation process is optimized based on single-factor and orthogonal experimental designs， then Zeta potentiometry， fluorometric analysis and fourier infrared spectroscopy are selected to disclose the mechanisms of fungal bioflocculation on microalgae from the perspectives of electrostatic interaction， extracellular polymers. The experimental results show that the optimum flocculation process are： pH=3， flocculation temperature 26 ℃， rotational speed 180 r/min， and initial microalgae absorbance A0=0.6. The flocculation rate reaches 85.67% under the above conditions， and the impact sequence is initial microalgae absorbance gt; rotational speed=temperature gt; time. S. obliquus is flocculated by P. eryngii mycelium pellets mainly through chemisorption， and other factors including electrostatic interaction between the fungal and microalgal cells， extracellular polymers such as proteins and humic acids， functional groups of cell surface also perform important function. This study will provide important references for microalgae flocculation by fungi in a green safe way and improve the harvesting rate of microalgae.

Keywords："Scendesmus obliquus; Pleurotus eryngii; bioflocculation; process optimization; flocculation mechanism

（責(zé)任編輯 周雪瑩）