甘草內生菌對順鉑誘導HEK293細胞損傷的保護作用及機制研究

張 楠,張尚龍,連小龍,楊志軍,馬趣環,葉禮巧,鄧 毅,2*,楊秀娟,2*

1甘肅中醫藥大學;2甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室,蘭州 730000;3青海大學,青海 810000

順鉑(cisplatin,CP)作為臨床常用的抗腫瘤藥物,療效顯著但毒副作用較強。主要表現為腎毒性、肝毒性、耳毒性及心臟毒性等,且尤以腎損傷較為嚴重[1-4]。具有時間-劑量依賴性[5]。CP引起的腎毒性可能涉及多方面的致病機制,包括線粒體功能障礙、誘導細胞凋亡、氧化應激等[6]。因此如何能夠有效降低CP毒副作用成為擴大CP臨床用藥劑量的首要問題,尋找合適的治療方案或藥物協同CP減毒增效成為目前研究的主要方向。

近年來,隨著中醫藥的發展,通過聯合中藥實現增效減毒的方式成為一大研究熱點。甘草作為“解毒圣藥”,性味甘平,功能補脾益氣,調和諸藥[7,8],其活性成分可緩解中毒癥狀,降低死亡率,對藥物和毒物具有顯著的解毒作用[9-11]。內生菌屬于藥用微生物資源范疇[12],是指生活在健康植物組織和器官內部的真菌或細菌,與宿主在長期進化過程中,發生基因重組并獲得宿主植物的基因,產生與宿主相同或相似的藥用活性成分[13],Man等[14]研究發現,甘草內生菌株具有與宿主相同的生理作用,能夠代謝出與甘草相似的皂苷類、黃酮類活性成分,具有抑菌、抗氧化的藥理作用。Yang等[15]研究發現,甘草內生菌發酵液具有與宿主水煎液、總黃酮及總皂苷相似的止咳作用。本課題組前期實驗研究證實,甘草內生菌具有抑菌[16]、抗炎[17]、祛痰[18]、抗腫瘤[19]等多種藥理作用,可代謝出與宿主甘草相似的甘草酸銨、甘草苷及甘草素[20],因而甘草內生菌可能具有與甘草相似的解毒作用。前期減毒實驗證明,甘草能有效減輕CP引起的腎毒性。但甘草內生菌對CP所致的腎毒性并未見系統的機制研究。

因此,本文旨在通過體外實驗建立CP誘導HEK293細胞損傷模型,探討甘草內生菌對CP損傷HEK293細胞的保護作用及其機制。以期為甘草內生菌與CP聯合應用實現增效減毒提供依據,為甘草內生菌的解毒作用提供理論參考,進一步擴充甘草內生菌的藥理作用。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

甘草經甘肅中醫藥大學中藥鑒定教研室李碩副教授鑒定為GlycyrrhizauralensisFisch的根和根莖,甘草內生菌(JTZB055)為本課題組從同期甘草中分離純化所得,經16S rDNA測序結果鑒定顯示JTZB055屬于內生細菌芽孢桿菌屬;順鉑(北京索萊寶科技有限公司,批號:SC5170-20 mg)。

1.2 細胞株

人胚腎HEK293細胞購自于武漢普諾賽生命科技有限公司。用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM高糖完全培養基,于5%CO2,37 ℃ 培養箱中培養,待長至瓶底約85%時,用含EDTA 0.25%胰蛋白酶消化傳代培養,待用。

1.3 主要試劑

DMEM高糖培養基(Cytiva公司,批號:AH29027412);胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司,批號:21030707);噻唑藍(北京索萊寶科技有限公司,批號:917Q051);胰蛋白酶、青鏈霉素(武漢賽維爾生物科技有限公司,批號:GP2211017、GA22020011094);二甲基亞砜(DMSO,北京索萊寶科技有限公司,批號:1121E0331);β-actin(武漢Abbkine公司,批號:ATVMA0302);Bcl-2、Caspase-9、GRP78及CHOP抗體(北京博奧森公司,批號:bs-0032R、bs-0049R、bs-1219R、bs-20669R);Bax、Caspase-3、Caspase-8及山羊抗兔二抗(Abmart公司,批號:ab32503、ab32351、ab108333、abs20040ss);BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,批號:20211213)。

1.4 主要儀器

酶標儀(BioTek Instruments,Inc);倒置熒光顯微鏡成像(麥克奧迪實業集團有限公司);191L氣套式CO2培養箱(美國精騏有限公司);超凈工作臺(AIRTHCH公司);流式細胞儀(Beckman);微量分光光度計(賽默飛世爾科技(中國)有限公司);熒光定量PCR儀(加拿大楓嶺生物技術有限公司);化學發光成像系統(美國Azure Biosystems公司)。

1.5 方法

1.5.1 甘草內生菌代謝產物萃取粉末的制備

將甘草內生細菌JTZB055于營養瓊脂培養基上復蘇,挑取單個菌落,接種到普通營養肉湯培養液中,在37 ℃、220 r/min恒溫振蕩器中培養5 d,收集發酵液,抽濾,濾液水浴加熱蒸干成甘草內生細菌發酵液粉末,于4 ℃冰箱保存,備用。發酵液粉末用水溶解成水溶液后依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取,萃取3次,合并萃取液,以旋轉蒸發儀回收溶劑至50 mL后,水浴干燥成粉末,于4 ℃冰箱保存,備用[21]。

1.5.2 MTT法檢測CP對HEK293細胞存活率的影響

取對數生長期細胞,用0.25%胰酶消化后調整細胞密度為5×104個/mL,向96孔板中加入不同濃度的CP(1、2、4、8、16、32、64 μg/mL),每組設置5個復孔,同時設空白對照組,在37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下細胞培養箱中培養孵育24 h后,每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL,繼續培養4 h后吸棄孔內培養上清液,每孔再加入DMSO 150 μL,振蕩10 min,使結晶物充分溶解。酶標儀測量各組在570 nm處的吸光度(A),按以下公式計算細胞存活率[22]。

存活率=(加藥組A值-調零組A值)/

(對照組A值-調零組A值)×100%

1.5.3 MTT法檢測甘草內生菌對HEK293細胞存活率的影響

取對數生長期細胞,用0.25%胰酶消化后調整細胞密度為5×104個/mL,向96孔板中加入不同濃度的JTZB055(1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、320、640 μg/mL),每組設置5個復孔,同時設空白對照組,在37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下細胞培養箱中培養孵育24 h后,每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL,繼續培養4 h后吸棄孔內培養上清液,每孔再加入DMSO 150 μL,振蕩10 min,使結晶物充分溶解。酶標儀測量各組在570 nm處的吸光值,并按照“1.5.2”所述方法檢測細胞存活率。

1.5.4 MTT檢測甘草內生菌對CP所致HEK293細胞損傷模型的影響

取對數生長期細胞,用0.25%胰酶消化后調整細胞密度為5×104個/mL,以每孔100 μL接種于96孔板,進行分組:①對照組:DMEM培養基;②CP組:4 μg/mL CP;③CP+JTZB055組:加入2.5、5、10、20、40、80、160、320、640 μg/mL JTZB055,4 h后加入4 μg/mL CP。每組設置5個復孔,同時設空白調零孔(只含有DMEM培養基)。將96孔板繼續37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下細胞培養箱培養24 h,并按照“1.5.2”所述方法檢測細胞存活率。

1.5.5 細胞形態學觀察

取對數生長期細胞用0.25%胰酶消化,調整細胞密度為1×105個/mL,分組鋪在6孔板中,分為對照組(Con)、模型組(CP)、JTZB055組(JT)、CP+JTZB055高劑量組(CPJT-H)、CP+JTZB055中劑量組(CPJT-M)、CP+JTZB055低劑量組(CPJT-L)。倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態,對比各組細胞形態狀況差異。

1.5.6 流式細胞術檢測凋亡率

取對數生長期細胞HEK293細胞,用0.25%胰酶進行消化,收集細胞懸液,細胞計數儀計數,將細胞密度調整為1×105個/mL個細胞,按照“1.5.5”分組加入6孔板。加入預冷的PBS緩沖液清洗2遍,加入200 μL結合液重懸細胞,沉淀中加入5 μL PI和5 μL A-V染色液混勻, 4 ℃避光冰浴放置孵育10～15min。在流式細胞儀上進行檢測,激發波長為488nm和535nm。每個樣品檢測5×104個/mL個細胞,每組試驗重復3次。CellQuest 軟件分析細胞凋亡率,結果用平均凋亡率表示。

1.5.7 熒光定量PCR檢測mRNA水平

前期處理如“1.5.5”,根據總RNA提取試劑盒操作提取總RNA,微量分光光度計進行RNA濃度、純度檢測,根據反轉錄試劑盒反轉為cDNA,后運用擴增程序兩步法在PCR儀上進行擴增,引物序列見表1。由PCR分析儀采集的目的基因和內參基因的CT值,計算ΔCT=CT目的-CT內參,ΔΔCT=ΔCT實驗組-ΔCT對照組,最后使用2-ΔΔCT方法計算,得出基因相對表達量。

表1 引物設計序列及長度Table 1 Primer sequence and length

1.5.8 Western blot法檢測凋亡蛋白表達水平

前期處理如“1.5.5”,培養24 h后棄掉舊培養液,用預冷PBS清洗三次,1 500 r/min于4 °C低溫離心機離心15 min后,棄上清。每孔加入200 μL配置好的裂解液,冰上裂解30 min,刮下細胞轉移至新的預冷EP管中,放置冰上靜止30 min裂解,12 000 r/min于4 °C低溫離心機離心15 min后,保留上清液為蛋白樣本于新的預冷EP管中,棄去沉淀。BCA法測定蛋白濃度,SDS-PAGE膠電泳,每孔10 μg上樣,然后將蛋白轉至PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h;孵育一抗,4 ℃過夜,TBST清洗后室溫孵育二抗1 h;TBST清洗后ECL發光液成像,采用Image J 軟件對條帶進行灰度值分析,目的蛋白條帶光密度值與內參蛋白條帶光密度值的比值,即為目的蛋白的相對表達量。

1.5.9 統計學方法

2 結果

2.1 不同濃度的CP在24 h、48 h、72 h對HEK293的影響

如圖1所示,與Con組相比,隨著CP給藥濃度及給藥時間的增加,HEK293細胞的存活率逐漸降低(P<0.01),且CP誘導的HEK293細胞損傷呈時間-劑量依賴性。因此選用24 h作為CP給藥模型時間,通過SPSS軟件分析得出CP對HEK293細胞的IC50值為3.394 μg/mL,故后續實驗選用4 μg/mL作為HEK293損傷模型濃度。

圖1 不同濃度CP對HEK293細胞存活率的影響Fig.1 Effects of different concentrations of CP on survival rate of HEK293

2.2 不同濃度的甘草內生菌在24、48、72 h對HEK293細胞存活率的影響

如圖2所示,不同濃度的甘草內生菌處理HEK293細胞24、48、72 h后對細胞的存活率有不同的影響。隨著給藥時間的增加,甘草內生菌對HEK293細胞的增殖作用逐漸降低,且在72 h時對細胞具有抑制作用。因此選用24 h作為藥物作用時間,當甘草內生菌濃度在640 μg/mL時,對細胞具有殺傷作用,可能是高濃度的甘草內生菌對HEK293細胞具有一定細胞毒作用。當甘草內生菌濃度<320 μg/mL時,對細胞增殖具有一定的促進作用,且甘草內生菌濃度在10 μg/mL時,與Con組相比,HEK293細胞存活率最高(P<0.01)。

圖2 不同濃度甘草內生菌對HEK293細胞存活率的影響Fig.2 Effects of different concentrations of G.uralensis endophytes on the survival rate of HEK293 注:與Con組相比,*P <0.05,**P <0.01。Note:Compared with control,*P <0.05;**P <0.01.

2.3 不同濃度的甘草內生菌對HEK293損傷模型存活率的影響

如圖3所示,當甘草內生菌濃度高于320 μg/mL時,對CP所致的HEK293細胞損傷無明顯的保護作用,當甘草內生菌濃度在10～160 μg/mL范圍時,與CP組相比,HEK293細胞的存活率顯著升高(P<0.01)。實驗結果顯示當甘草內生菌濃度在10、5 、2.5 μg/mL時細胞損傷均明顯改善,且濃度為10 μg/mL時,顯著改善CP誘導的HEK293細胞損傷,差異具有統計學意義(P<0.01)。為了進一步篩選出最佳減毒濃度,實驗選用Con組、CP組(4 μg/mL)、JT組(10 μg/mL)、CPJT-H組(10 μg/mL)、CPJT-M組(10 μg/mL)、CPJT-L組(10 μg/mL)等六組進行進一步的驗證,探討甘草內生菌對CP誘導的HEK293細胞凋亡的保護作用機制。

圖3 不同濃度的甘草內生菌對HEK293損傷模型存活率的影響Fig.3 Effects of different concentrations of G.uralensis endophytes on the survival rate of HEK293 injury 注:與Con相比,*P <0.05,**P <0.01;與CP組相比,#P <0.05,##P <0.01,下同。Note:Compared with Con,*P <0.05;**P <0.01;Compared with CP,#P <0.05,##P <0.01,the same below.

2.4 倒置顯微鏡觀察細胞形態學變化

如圖4所示,顯微鏡結果發現Con組細胞均勻生長,細胞貼壁牢固呈梭形或多角形分布。與Con比較,JT組無明顯差別,細胞輪廓清晰,貼壁較穩均勻生長,且JT組細胞較空白組生長數量有所增加。CP組細胞形態改變多呈圓形生長,細胞多數呈漂浮狀態,貼壁性較差,與Con組相比數量明顯減少。與CP組相比,聯合高中低劑量組細胞皺縮形態明顯減輕,貼壁能力有所恢復,且CPJT-H組效果最好。提示一定濃度下甘草內生菌對HEK293細胞有一定的促進作用,且CPJT-H組可以一定程度緩解CP誘導的HEK293細胞的受損形態,改善細胞的生長狀況。

圖4 各組藥物作用下HEK293細胞形態(×100)Fig.4 Cell morphology of HEK293 under drug action in each group (×100)

2.5 流式細胞凋亡率檢測

流式細胞術檢測發現,與Con組相比,CP組凋亡率顯著上升,凋亡比例增加,差異具有統計學意義(P<0.01),提示CP誘導HEK293細胞凋亡。與CP組相比,CPJT-H、CPJT-M、CPJT-L藥物組干預治療CP組后,細胞凋亡率顯著降低(P<0.01),且CPJT-H組效果最為顯著,差異具有統計學意義(P<0.01)。結果表明(見圖5),JT組(10 μg/mL)可以促進HEK293細胞的增殖,有效改善CP誘導的HEK293細胞凋亡。

圖5 各藥物組作用24 h后HEK293細胞的凋亡率Fig.5 Apoptosis rate of HEK293 cells after 24 h of treatment in each drug group

2.6 熒光定量PCR檢測mRNA水平表達的影響

各組藥物作用24 h后,提取總RNA,逆轉錄后進行定量PCR擴增檢測目的基因,以β-actin基因為內參,在mRNA水平檢測各目的基因相對表達情況。實驗結果發現,各個溶解曲線未出現多峰現象,相應擴增曲線未發現有非特異性擴增及引物二聚體。與Con組相比,CP組顯著上調HEK293細胞中Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、GRP78及CHOP mRNA表達水平(P<0.05,P<0.01),下調Bcl-2 mRNA表達水平,差異具有統計學意義(P<0.01)。與CP組相比,CPJT-H組Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、GRP78及CHOP mRNA表達水平降低(P<0.05,P<0.01),Bcl-2 mRNA表達水平升高,差異具有統計學意義(P<0.01)(見圖6)。

圖6 不同藥物組作用HEK293細胞24 h mRNA表達水平Fig.6 The 24 h mRNA expression of HEK293 cells was affected by different drug

2.7 Western blot法檢測相關凋亡蛋白的影響

Western blot結果顯示(見圖7),與Con組相比,CP組中促凋亡蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、GRP78、CHOP的表達量顯著升高(P<0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2表達量下調(P<0.01)。甘草內生菌治療組干預模型組后,與CP組相比,促凋亡蛋白的表達量顯著降低(P<0.05,P<0.01),Bcl-2蛋白表達量上調(P<0.01),且CPJT-H組效果最為顯著(P<0.01)。提示甘草內生菌可能通過調節Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、GRP78、CHOP蛋白表達改善CP誘導的HEK293細胞損傷。

圖7 各組藥物作用HEK293細胞24 h后蛋白的相對表達水平Fig.7 The relative expression level of protein in HEK293 cells after 24 h of drug treatment in each

3 討論與結論

腎臟作為機體的主要排泄器官,CP主要通過腎臟排泄,在腎近端小管積聚,形成高濃度、長時間的蓄積狀態,促進ROS的生成并抑制其代謝酶降解,造成ROS在體內的大量蓄積,進而誘導細胞凋亡,造成腎臟損傷[23]。甘草具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、清除自由基的藥理作用,可減少ROS生成,改善細胞凋亡狀態[24,25]。甘草內生菌與甘草共生,屬于藥用微生物資源,具有與宿主甘草相似的藥理活性,能夠降低馬錢子引起的腎臟損傷,亦具有改善順鉑腎毒性的潛在活性[6]。本研究通過MTT法對不同藥物干預組進行吸光度測定,結果表明,CP誘導的HEK293細胞損傷具有時間劑量依賴性,與CP組比較,甘草內生菌治療組顯著改善細胞損傷,差異具有統計學意義(P<0.01)。倒置顯微鏡下觀察發現,聯合用藥組細胞皺縮形態明顯減輕,貼壁能力有所恢復,與文獻報道一致。流式細胞術檢測發現與Con組相比,CP組凋亡率顯著升高(P<0.01),與CP組相比,聯合治療組凋亡率降低,且CPJT-H組效果最為顯著(P<0.01)。與MTT實驗結果一致,進一步提示甘草內生菌對CP誘導的HEK293細胞損傷具有保護作用。

細胞凋亡過程非常復雜,可分為內源性途徑、外源性途徑及內質網應激途徑。Bcl-2家族在細胞凋亡中起關鍵作用,包括抗凋亡蛋白如Bcl-2和促凋亡蛋白如 Bax[26]。Bcl-2 在線粒體凋亡途徑中具有主要調控作用,可通過激活下游基因造成細胞凋亡[27]。Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9是Caspase家族中的主要成分,在細胞凋亡中常作為重要指標來檢測細胞凋亡的程度[28]。GRP78及CHOP則是內質網應激的標志蛋白,是內質網應激介導細胞凋亡的重要組成部分[29]。通過考察Bcl-2家族、Caspase家族以及內質網應激凋亡蛋白探討甘草內生菌對CP誘導HEK293細胞凋亡的保護作用機制,實驗結果顯示,與Con組相比,CP干預后使Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、GRP78、CHOP的mRNA及蛋白相對表達量上調(P<0.05,P<0.01),Bcl-2的mRNA及蛋白相對表達量降低(P<0.01)。與CP組相比,甘草內生菌各治療藥物組干預后,對CP誘導的HEK293細胞損傷均有一定程度的改善作用。其中CPJT-H組的Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、GRP78、CHOP的mRNA及蛋白相對表達量明顯降低(P<0.05,P<0.01),Bcl-2的mRNA及蛋白相對表達量升高(P<0.01)。

綜上,甘草內生菌能降低CP誘導的HEK293細胞的凋亡,并通過抑制促凋亡蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、GRP78、CHOP的表達并促進抗凋亡蛋白Bcl-2的表達,從而減輕CP誘導腎毒性作用,為甘草內生菌與CP聯用減毒提供依據,擴充甘草內生菌的藥理作用。