白首烏對干燥綜合征模型小鼠影響的實驗研究

張霞，雷紫琴，秦甜甜，祁琥，曾南

白首烏為蘿藦科(Asclepiadaceae)鵝絨藤屬(CynanchumLinn. )植物，是耳葉牛皮消(Cynanchum auriculatumRoyle ex Wight.)、隔山牛皮消(Cynanchumwilfordii Hemsl.)和戟葉牛皮消(Cynanchum bungeiDecne.)的塊根[1]。該藥材具有補肝腎、益精血、強筋骨、健脾消食、解毒療瘡功效[2]，用于肝腎陰虛所致頭昏眼花、腰膝酸軟、須白、體虛多夢、失眠健忘、皮膚瘙癢等多種疾病[3]?，F代研究發現白首烏化學成分豐富，其中最重要的有C21甾體苷類、多糖類、苯酮類等活性成分，與白首烏的多種藥理活性密切相關[4]。

干燥綜合征(Sj?gren’s syndrome, SS)是外分泌腺的一種慢性自身免疫性疾病，以唾液腺和淚腺的高度淋巴細胞浸潤為特征[5,6]。臨床常見眼睛干燥、口腔干燥，且常引起與外分泌腺相連的其他表皮干燥，嚴重時可引起臟器功能受損[7]。SS近年來發病率持續升高，因發病機制復雜，臨床治療多依賴于糖皮質激素、免疫抑制劑等全身免疫調節藥物治療，但治療療效只限定于活動期的系統受累的干燥綜合征患者，且用藥引起的副作用令人擔憂[8]。傳統中醫藥在緩解干燥綜合征患者口眼干燥及其他臨床癥狀時，與西藥治療相比，被發現其作用范圍較廣，且臨床與動物實驗研究表明中藥對SS患者口、眼干燥的臨床癥狀和SS小鼠的唾液分泌量、頜下腺損傷指數以及局部免疫炎癥微環境有明顯的改善作用，尤其是輕型干燥綜合征患者，可采用單純中藥治療[9,10]。本實驗基于前期研究基礎[11]，采用同種小鼠自身抗原誘導造模的方法建立SS小鼠模型，觀察白首烏對SS小鼠頜下腺功能障礙的影響及其影響CHRM3的作用機制，為白首烏用于SS的治療及今后的深入研究提供初步的藥理學依據。

1 材料和方法

1.1 實驗藥物

白首烏飲片（Cynanchum auriculatumRoyle ex Wight.，批號：20200715）由瀘州品創科技有限公司提供，并由成都中醫藥大學藥學院嚴鑄云教授鑒定。硫酸羥氯喹（批號：210360，上海上藥中西制藥有限公司）

1.2 實驗動物

雌性C57BL/6小鼠（6周齡，20±2 g）購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，許可證號SCXK（北京）2019-0010。動物在成都中醫藥大學藥學院動物觀察室飼養，許可證號SYXK（四川）2020-124。給藥前適應性喂養5天，恒溫25±1℃、相對濕度40%～60%、12 h光暗交替，自由進食、飲水。所有動物研究均按照成都中醫藥大學藥學院實驗動物護理和使用委員會的指南（編號20200320）進行。

1.3 實驗試劑

動物組織總RNA提取試劑盒（Cat: RE-03014成都福際生物技術有限公司），FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預混試劑（Cat: KR118-02，天根生化科技（北京）有限公司），SuperReal熒光定量預混試劑增強版（Cat: FP205-02，天根生化科技（北京）有限公司），RIPA裂解液（Cat: P00138，上海碧云天生物技術有限公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（Cat: P0012，上海碧云天生物技術有限公司），CHRM3（Cat: bs-1289R，北京博奧森生物技術有限公司），β-actin Rabbit mAb（Cat:AF7018，Affinity Antibody公司），HRP-羊抗兔IgG（Cat: BM3894，武漢博士德生物工程有限公司），UltraSignal 超敏ECL化學發光底物（Cat: 4AW011-100，北京四正柏生物科技有限公司），抗SSA抗體ELISA試劑盒(Cat: JM-12306M1, 江蘇晶美生物科技有限公司) ，抗SSB抗體ELISA試劑盒(Cat: JM-12312M1, 江蘇晶美生物科技有限公司)。

1.4 儀器與設備

Nanodrop 2000分光光度計（賽默飛世爾科技（中國）有限公司），3001型高級多功能酶標儀、ST16R 低溫高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司)，KZ-II 高效組織研磨儀（武漢賽維爾生物科技有限公司），Bio-Rad ChemiDoc XRS+化學發光成像系統（美國Bio-Rad公司）。

1.5 方法

1.5.1 白首烏醇提物的制備 白首烏飲片與75%乙醇以料液比1:10的比例采用加熱回流法回流提取2 h，減壓抽濾后殘渣用相同的方法再提取2次，合并3次提取液，真空濃縮，收集，冷凍干燥后備用。

1.5.2 小鼠干燥綜合征（SS）模型的建立 抗原制備：低溫條件下，無菌取出同種小鼠兩側頜下腺，剔除包膜、結締組織及淋巴結等附著物，剪碎，按20 mg腺體組織加入0.2 mL生理鹽水的比例制備頜下腺組織勻漿，4℃低溫離心機中以3000 r·min-1速度離心15 min，將上層脂質吸除，余下上清液作為抗原備用。BCA法測定蛋白含量，PBS緩沖液將上述制備抗原稀釋到蛋白濃度為5.0 mg·mL-1，加入同體積弗氏完全佐劑，調配成蛋白濃度為2.5 mg·mL-1的注射用抗原。

采用制備好的抗原隨機在小鼠背部多點注射，每只小鼠注射總量為0.1 mL，并在初次免疫后的第3、7天分別用相同劑量和濃度的免疫原足墊以及背部皮下多點注射以加強免疫；第14、21天，用不完全弗氏佐劑將頜下腺抗原調整蛋白濃度為2.5 mg·mL-1，以同樣方式注射小鼠。正常組小鼠背部隨機多點注射等體積生理鹽水。

1.5.3 分組及給藥 72只SPF級C57BL/6雌性小鼠按體重分層隨機分成6組，每組12只，即空白組，模型組，白首烏醇提物低、中、高劑量組（0.4、0.8、1.6 g·kg-1）[12]和羥氯喹組（0.03 g·kg-1）。首次免疫當天小鼠開始給藥，空白組和模型組給予等量生理鹽水。造模周期為60天。

1.5.4 唾液分泌量與飲水量測定 小鼠飼養過程中每隔3天稱量小鼠體重并按體重的變化重新計算灌胃劑量，每天定時稱重每籠小鼠剩余水量。并分別在第0天（造模前）、第30天、第60天測量各組小鼠唾液分泌量，檢測方法：將已稱量過初始重量的干棉球放入小鼠的頰部采集唾液，3分鐘后取出放置分析天平上稱重，即小鼠唾液分泌量(mg)=棉球濕重(mg)-棉球干重(mg)。

1.5.5 自身抗體測定 取各組小鼠血液樣品于室溫靜置2 h，以3500 rpm離心15 min，分離血清于一次性EP管中，置于-20℃冰箱中保存備用。ELISA法檢測血清中抗SSA和抗SSB抗體水平。

1.5.6 免疫組化、 Western Blot檢測頜下腺CHRM3的表達量 無菌條件下剖取頜下腺，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，連續切片；脫蠟，浸洗，抗原修復，內源性過氧化物酶阻斷，血清封閉；兔抗CHRM3按1:200稀釋，然后4℃孵育過夜；酶標二抗37℃孵育30 min；加DAB顯色液，復染細胞核，脫水，封片；顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

將各組小鼠頜下腺組織樣品切碎，用含1%蛋白酶抑制劑和1%磷酸酶抑制劑的裂解液勻漿，然后用BCA 蛋白定量試劑盒測定總蛋白質濃度。調節各樣本總蛋白至等濃度，經電泳、轉膜后，一抗（1:5000）孵育過夜，二抗（1:5000）中孵育反應1.5 h，β-actin作為內參。最后，使用ChemiDocTM成像系統顯影。

1.5.7 RT-PCR測定CHRM3 mRNA表達水平 根據說明書要求，收集小鼠頜下腺組織并使用動物總RNA分離試劑盒提取總RNA。然后，檢測總RNA濃度和純度，并使用FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預混試劑盒將其逆轉錄成cDNA，以β-actin為內參進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應，引物序列見表1，2-ΔΔCt法計算各基因的相對表達量。

表1 引物序列

1.5.8 統計分析 原始記錄由紙質書寫和計算機系統同時記錄。采用統計軟件SPSS 23.0進行實驗數據統計，以±s表示，計量數據符合正態性分布的采用單因素方差分析（one-way ANOVA）或t檢驗，不符合正態者則采用非參數檢驗法分析，各組所得數據均與模型組比較，P＜0.05為兩組之間存在統計學差異。

2 結果

2.1 白首烏醇提物對SS模型小鼠飲水量和唾液分泌量的影響

造模之后，小鼠的日均飲水量和唾液分泌量均發生明顯變化。如圖1所示，與模型組比較，白首烏醇提物各劑量組和羥氯喹組小鼠日均飲水量明顯降低。如圖2所示，分別在第0天（造模前）、第30天、第60天測量各組小鼠唾液分泌量，從的結果來看，各給藥組小鼠唾液分泌量在第30、60天均顯著高于模型組（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。

圖1 白首烏對SS模型小鼠日均飲水量的影響

圖2 白首烏對SS模型小鼠唾液分泌量的影響

2.2 白首烏醇提物對SS模型小鼠自身抗體水平的影響

結果表明，與空白組比較，模型組小鼠血清中抗SSA和抗SSB抗體水平均顯著升高（P＜0.001），提示造模成功。與模型組比較，白首烏醇提物各劑量組和羥氯喹組小鼠血清中抗SSA與抗SSB抗體水平均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），提示藥物對模型具有對抗作用。見表2、圖3。

圖3 白首烏對SS模型小鼠血清中抗SSA和抗SSB抗體水平的影響

表2 白首烏對SS模型小鼠血清中抗SSA和抗SSB抗體水平的影響(±s)

表2 白首烏對SS模型小鼠血清中抗SSA和抗SSB抗體水平的影響(±s)

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

抗SSB抗體（ng·mL-1）空白組——283.75±20.93*** 144.24±8.59***模型組——370.89±16.29193.14±19.41白首烏醇提物0.4339.83±9.92*163.43±6.86**白首烏醇提物0.8294.72±12.44*** 149.12±8.82***白首烏醇提物1.6270.47±3.50*** 143.72±7.89***羥氯喹組0.03277.87±25.76*** 154.72±11.96**組別劑量（g·kg-1）抗SSA抗體（ng·mL-1）

2.3 白首烏醇提物對SS模型小鼠頜下腺CHRM3表達的影響

I H C 結果顯示，模型組小鼠頜下腺組織中CHRM3陽性表達較空白組顯著減弱（P＜0.05），而白首烏醇提物各劑量組和羥氯喹組小鼠頜下腺組織中CHRM3陽性表達較模型組顯著增強（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），見圖4。

圖4 白首烏對SS模型小鼠頜下腺組織CHRM3陽性表達的影響（IHC法）

如圖5所示，模型組小鼠頜下腺組織中CHRM3蛋白表達量較空白組顯著降低（P＜0.001）；與模型組比較，白首烏醇提物高劑量組和羥氯喹組小鼠頜下腺組織中CHRM3蛋白表達量顯著升高（P＜0.001，P＜0.05）。

圖5 白首烏對SS模型小鼠頜下腺組織中CHRM3蛋白表達量的影響（WB法）

2.4 白首烏醇提物對SS模型小鼠頜下腺CHRM3 mRNA表達的影響

PCR實驗結果顯示，與空白組比較，模型組小鼠頜下腺組織中CHRM3 mRNA表達水平顯著降低（P＜0.001）；與模型組比較，白首烏醇提物高劑量組小鼠頜下腺組織中CHRM3 mRNA表達水平顯著上調（P＜0.001）。見表3、圖6。

表3 白首烏對SS模型小鼠頜下腺組織CHRM3 mRNA相對表達水平的影響(±s)

注：與模型組比較， ***P＜0.001

組別劑量（g·kg-1）△CT空白組——1.00±0.00***模型組——0.08±0.01白首烏醇提物1.61.20±0.25***羥氯喹組0.030.08±0.03

3 討論

典型的SS臨床表現是以外分泌腺淋巴細胞浸潤為特征的口干眼干，在疾病進展期間，患者可能出現其他一些臨床病變，如關節炎、疲勞、皮膚血管炎、肺間質疾病、周圍神經和中樞神經病變、腎衰竭、胃腸道疾病等[13]。研究認為，抗SSA和抗SSB抗體均是診斷該病的特異性抗體，SS患者體內抗SSA抗體、抗SSB抗體的陽性率更高[14,15]。本實驗研究觀察到SS模型小鼠血清中抗SSA抗體、抗SSB抗體水平，與空白組比較均顯著升高，提示模型的成功建立，而白首烏醇提物各劑量組和羥氯喹組小鼠血清中兩種抗體水平較模型組顯著降低，表明藥物能改善模型小鼠免疫功能的異常。此外，飲水量及唾液分泌量是反映唾液腺功能的客觀指標，實驗發現，造模前各組小鼠飲水量和唾液分泌量均無統計學差異，造模后可見模型組小鼠飲水量較空白組顯著增加，唾液分泌量則顯著減少，表明SS模型小鼠唾液腺分泌功能較正常小鼠明顯減弱，進一步提示模型的成功建立。亦可發現，隨著疾病的進展SS模型小鼠飲水量逐漸增多，唾液分泌量則逐漸下降，而白首烏醇提物同步給藥防治后能有效控制飲水量的增加，并增強唾液分泌能力，對唾液腺的功能有一定保護作用。

在基本明確了白首烏對SS模型小鼠的改善作用后，本實驗采用免疫組化、RT-PCR、Western Blot法觀察了白首烏醇提物對SS模型小鼠頜下腺組織毒蕈堿型乙酰膽堿受體M3（Muscarinic acetylcholine receptor M3，CHRM3）表達的影響，以期初步揭示其作用機制。毒蕈堿型乙酰膽堿受體M，是一種單鏈跨膜糖蛋白，在體內主要參與肌肉收縮調節、呼吸、運動、體溫調節、學習、記憶等重要生理功能[16]。CHRM3為該家族成員之一，主要分布在唾液腺和淚腺等外分泌腺，通過副交感神經調節影響外分泌腺體的分泌功能，即在腺體分泌中起關鍵作用[17]。研究證實，CHRM3參與SS的發病，抗CHRM3抗體的存在與SS患者分泌功能障礙具有直接關聯性[18]，SS患者自身產生抗CHRM3抗體，可能誘導CHRM3異位表達于導管，引起頜下腺受損血流反應和唾液輸出量減少[19]，阻斷乙酰膽堿對M3受體的激活，能干擾乙酰膽堿能神經信號的有效傳遞，損傷頜下腺、減少唾液分泌量；并可激活磷脂酶C信號傳導通路，增加腺體局部NO水平，破壞涎腺組織結構，導致唾液、淚液分泌減少，從而引起口干眼干等SS癥狀[20,21]。本實驗結果顯示，模型組小鼠頜下腺組織CHRM3 的mRNA、蛋白表達水平均顯著下調，提示SS小鼠頜下腺功能出現障礙，白首烏醇提物能上調CHRM3 mRNA和蛋白表達，表明白首烏能通過影響CHRM3的基因與蛋白表達，發揮對SS小鼠頜下腺功能改善的作用。

綜上，本研究結果表明白首烏醇提物對SS模型小鼠具有干預作用，下調特征性抗體水平，改善唾液腺分泌功能，有效緩解SS癥狀，作用機制與上調CHRM3功能有關。此外，白首烏作為一種提高機體免疫功能的藥材，而SS的發病機制與機體免疫功能紊亂有關，因此今后研究中可從影響免疫功能角度開展其干預SS的作用。