口服大黃酸超分子納米粒的制備與表征及其巨噬細胞靶向性能研究

聶文彪，林大勝,2，高飛

大黃酸（Rhein，RH），又稱大黃苷，是一種天然植物蒽醌，主要存在于蓼科植物中，為大黃、何首烏、蘆薈和番瀉葉等多種中藥的主要生物活性成分之一[1]。其化學結構含有羥基和羧基，極性較強，呈弱酸性，為咖啡色針狀結晶，升華后為黃色針狀結晶，幾乎不溶于水，微溶于乙醇、苯、氯仿、乙醚、石油醚，能溶于吡啶、碳酸氫鈉水溶液等堿溶液中。現代藥理學研究表明，RH藥理用途十分廣泛，具有抗炎，抗腫瘤，抗菌，降糖調脂，調節免疫和抗動脈硬化等作用，在臨床上用于淋病，炎癥性疾病和代謝性疾病的輔助治療，其可培植衍化多種藥物，是治療骨關節炎的良藥“雙醋瑞因”的主要原料，也是配制保健品的最佳原料，可起到降脂減肥、通便排毒、清潔內環境的效果[2-5]。由此可見，RH在醫藥領域和功能保健食品領域有著良好的發展前景。然而，RH溶解性差、生物利用度低，靶向性能差及大劑量服用具有肝毒性風險等缺陷，很大程度上限制了它的臨床用途。

近年來，超分子聚合物因其在生物技術、納米傳感、藥物傳遞和基因診斷和治療等領域的潛在應用而受到了廣泛的關注[6]。由聚合物自組裝形成的超分子納米通常具有規則的球形核殼結構。它們的疏水核可以與治療藥物在物理或化學上相互作用，從而可作為封裝疏水性藥物的納米級容器，而親水殼層可以與溶劑相互作用，提高納米粒子的穩定性。超分子聚合物通常是高度取向的，并通過非共價弱相互作用結合在一起，如氫鍵、主客體相互作用、π-π堆積、金屬配位鍵和靜電相互作用。其中，主客體相互作用具有選擇識別性，需要主體和客體分子之間大小和結構的互補[7,8]。目前，環糊精與金剛烷之間的主客體相互作用已得到廣泛認可，國內外學者以此為契機，開發出了多種智能口服納米遞藥系統[9-11]。基于以上背景，本研究以環糊精與金剛烷這對主客體分子為基礎，分別對二者加以修飾，通過主客體相互作用自組裝包載疏水性藥物RH，制備RH超分子納米粒子，并采用殼聚糖-果膠復合聚電解質（CP）對其進行包裹，以能夠實現安全穩定的口服遞送；最后，對制備出來的納米粒子進行理化性質表征，同時也對該納米粒子的巨噬細胞靶向性能進行了研究。

1 實驗儀器與材料

1.1 實驗儀器

Litesizer 500激光粒度分析儀，安東帕（上海）商貿有限公司；Agilent 1260型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；ESJ205-S電子分析天平，沈陽龍騰電子有限公司；HMS-901D6聯多點加熱磁力攪拌器，深圳市博大精科生物科技有限公司；JEM 2100F透射電子顯微鏡，日本電子株式會社；TSC SP8激光共聚焦顯微鏡，德國Leica公司；AVANCE NEO 700M核磁共振波譜儀，D8 X射線衍射儀，德國Bruker公司；IRTracer-100傅里葉變換紅外光譜儀, 島津企業管理（中國）有限公司。

1.2 實驗材料

單(6-氨基-6-去氧)-β-環糊精（C D，批號Z220820），山東濱州智源生物科技有限公司; 硫代羥基乙酸酐（TA，批號M220522），上海麥克林生化科技有限公司；維生素E聚乙二醇琥珀酸酯（TPGS，批號C220318），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；金剛烷胺（AD，批號R220416），上海羅恩科技發展有限公司；葉酸（FA，批號XC220312），深圳金富源生物科技有限公司；大黃酸（RH，批號wkq22052602，純度≥98%），四川維克奇生物科技有限公司；香豆素6（C6），上海譜振生物科技有限公司；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、4-二甲氨基吡啶（DMAP），西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；二甲基亞砜（DMSO），北京匯海科儀科技有限公司；甲醇，北京迪科馬科技有限公司。

2 方法與結果

2.1 主體聚合物CD-TA-TPGS的合成與分析

根據酰化反應的基本原理，采用TA作為酰化試劑合成主體聚合物CD-TA-TPGS[12]。具體如下：將CD、TA（按2：3的比例）和少許催化劑DMAP一起溶解在20 ml DMSO中，并向其中滴加少許三乙醇胺共同攪拌24 h；然后利用透析技術除去反應溶液中的DMSO和少許雜質，再通過真空冷凍干燥得到中間體CD-TA。之后，將得到的CD-TA粉末復溶于20 ml DMSO中，并向其中加入與CD等量的TPGS和少量催化劑EDC與DMAP，在溶解完全后在50 ℃下反應24小時，然后同樣經透析技術去除DMSO和雜質，再通過真空冷凍干燥最終獲得主體聚合物CD-TA-TPGS。通過核磁共振波譜儀和傅里葉變換紅外光譜儀驗證CD-TA-TPGS的成功合成，結果見圖1～2所示。圖1顯示了CD、CD-TA、TPGS和CDTA-TPGS四種物質的核磁共振氫譜圖。在CD-TA譜圖中，CD的質子峰幾乎全部被包括在內，并在8.61 ppm（a）處出現了一個新的質子峰，代表新生成的酰胺基團上氫的信號峰，表明CD和TA成功接枝在一起。此外，從CD-TA-TPGS譜圖中可以看出，0.83 ppm（c）是TPGS維生素E長鏈甲基端氫的信號峰；1.00～1.71 ppm為維生素E長鏈上不同環境亞甲基氫的信號峰; 2.52 ppm（d）是維生素E苯并二氫吡喃環4位亞甲基上氫的信號峰，2.66 ppm（e）和2.84 ppm（f）是TPGS琥珀酸鏈上兩個亞甲基上的氫信號。與CD-TA和TPGS譜圖相比，CD-TA-TPGS譜圖在5.54～5.78 ppm（b）處同樣出現了CD中的羥基質子峰，并且仲酰胺基團的氫信號峰(a)仍然存在，這些充分證實了TPGS接枝在CD-TA上，成功合成了主體CD-TA-TPGS 聚合物。傅里葉變換紅外光譜圖也進一步證實了我們的分析。如圖2所示，與CD光譜相比，CD-TA譜圖在1651 cm-1處出現新的峰（C=O），表明TA成功反應并接枝在CD上。在TPGS的譜圖中，1736 cm-1被強吸收，這是酯羰基的峰值（O-C=O），1115 cm-1是醚鍵（C-O-C）的拉伸振動。與CD-TA譜圖相比，CD-TA-TPGS 譜圖具有1737 cm-1酯羰基（O-C=O）峰和1112 cm-1醚鍵（C-O-C）峰，這也表明TPGS通過酯化反應成功與CD-TA接枝形成CD-TA-TPGS主體聚合物。

圖1 CD,CD-TA,TPGS和CD-TA-TPGS的核磁共振氫譜圖

圖2 CD，CD-TA，TPGS和CD-TA-TPGS的傅里葉紅外光譜圖

2.2 客體聚合物FA-AD的合成與分析

根據酰胺反應的基本原理，在EDC/NHS這對常用的氨基和羧基接枝催化試劑的加入下，合成了客體共聚物FA-AD[13]。簡言之，先將FA和EDC/NHS溶解在含有20 ml CDDMSO的帶塞錐形瓶中，并置于磁力攪拌器上攪拌1 h以活化羧基，然后再加入AD并在50 °C的溫度下共同攪拌24 h,之后將獲得的溶液倒入透析袋（Mr500 Da）中，并放置再去離子水中透析；最后，通過真空冷凍干燥獲得客體聚合物FA-AD。同樣采取核磁共振波譜儀和傅里葉變換紅外光譜驗證FA-AD的合成，結果見圖3～4。圖3所示，2.04（a）和1.57（b）處的特征質子峰分別歸因于AD單元的（-CH2）3CH和（-CH2）（-NH2）CCH2-。8.70（c）、4.54（d）、6.99（e）、6.70（f）、7.70（g）、8.19（h）、4.38（i）、1.94（j）、2.36（k）和11.51（m）ppm處的峰分別歸因于FA單元的-N=CH-、-CH2NH-、 -NHPh-、-Ph鄰位氫、-Ph間氫、-PhCONH-、-CONHCHCOOH-、-CH2CH2COOH、-CH2COOH和-COOH。比較FA、AD和FA-AD的核磁共振氫譜可以看出，FA-AD幾乎包含了FA和AD的所有特征峰。在FA-AD光譜中，屬于FA的羧基質子峰（11.51 ppm）的消失，并且在8.07 ppm代表的酰胺基質子峰低于FA中的原始酰胺質子峰（8.19 ppm），這可能與引入AD引發的屏蔽效應有關。以上這些證明了FA-AD聚合物的成功合成。傅里葉變換紅外光譜進一步證實了以上結論。如圖4所示，FA在3120 cm-1處屬于O-H的特征吸收峰未反映在FA-AD光譜中。此外，FA-AD光譜顯示1696 cm-1（C=O），1608 cm-1（N-H）和1183 cm-1（C-N），表明存在酰胺鍵。相較之在FA光譜中，這些峰略有變化，這可能是由FA和AD反應形成新的酰胺鍵引起的。此外，在FA-AD光譜中，AD在2904 cm-1、2848 cm-1和1337 cm-1處的峰值略微偏移至2912 cm-1、2851 cm-1和1305 cm-1，表明FA與AD之間存在相互作用。因此，這些結果進一步證實了FA-AD的成功合成。

圖3 AD，FA和FA-AD的核磁共振氫譜圖

圖4 AD，FA和FA-AD的傅里葉紅外光譜圖

2.3 CP-FA-RH NPs的制備

CP-FA-RH NPs的步驟主要分為以下三個步驟：第一步，稱取RH 1 mg，CD-TA-TPGS 10 mg,分別溶解于1 ml DMSO溶液中,超聲渦旋直至溶解，然后同時緩慢滴入裝有20 ml純水的燒杯中，反應1 h后，通過透析技術除去DMSO得到RH NPs溶液；第二步，稱取2 mg FA-AD，同樣溶于1 ml DMSO溶液中，超聲渦旋并用0.8 μm微孔濾膜過濾，以得到清晰明亮的FA-AD溶液，然后，在超聲處理條件下，將該溶液滴加到RH NPs溶液中，30 min后再將這溶液轉移到透析袋中以除去DMSO得到FA-RH NPs溶液；最后一步，將殼聚糖溶液與果膠溶液以2：1的比例攪拌均勻后，滴入上一步制備的溶液中，然后再放置于磁力攪拌器上，勻速攪拌1 h后得到最終的CP-FARH NPs溶液。制備出的CP-FA-RH NPs溶液呈現澄清黃色狀，無渾濁或沉淀析出，表明CP-FA-RH NPs溶液體系分布均一且穩定。對于每一步形成的NPs溶液，測定其平均粒徑、PDI和Zeta電位，結果如表1所示（n=3）。相較于RH NPs，FA-RH NPs的粒徑從110.93±2.39 nm增加到117.59±2.00 nm，Zeta電位從-11.2±0.3 mV降低到-13.1±0.3 mV，這些變化歸因于主客體聚合物相互結合成功；另外，最終CP-FARH NPs粒徑達到220.53±2.13 nm, Zeta電位逆轉為20.6±1.8 mV，表明聚電解質CP在靜電相互作用力下成功吸附在納米粒子表面，證實了CP-FA-RH NPs的成功制備。此外，值得一提的是，在整個制備過程中，PDI值都很小，表明了制備的CP-FA-RH NPs粒徑分布均一，穩定性好，從圖5 CP-FA-RH NPs的粒徑分布柱狀圖中也印證了這一點。

表1 每一步形成NPs的粒徑，PDI和Zeta電位

圖5 CP-FA-RH NPs的粒徑分布圖

2.4 大黃酸含量測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱為Comatex-C18柱(250 mm*4.6 mm, 5 μm)；檢測波長254 nm；流動相為甲醇-0.1%磷酸水(85:15)；體積流量為1.0 mL·min-1；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μl[14]。

2.4.2 對照品溶液的配制 精密稱取RH對照品2.08 mg，置于100 ml容量瓶中，加入適量甲醇超聲振蕩溶解，再稀釋定容至刻度線，配制成質量濃度為20.8 μg·mL-1的RH對照品溶液。分別精密吸取RH對照品溶液1 ml，750 μl，375 μl，250 μl，187.5 μl，125 μl，93.75 μl，62.5 μl置于10 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，超聲振蕩，經0.22 μm的微孔濾膜過濾后加入棕色樣品瓶中，按“2.4.1”項下色譜條件，進樣10 μl測定峰面積，以RH對照品質量濃度x為橫坐標，峰面積y為縱坐標繪制標準曲線（如圖6），得到線性回歸方程為y=27325x-821.14，R2=0.9995，表明大黃酸線性關系良好。

圖6 RH含量測定標準曲線

2.4.3 CP-FA-RH NPs樣品中大黃酸含量測定 精密量取1 ml CP-FA-RH NPs溶液置于25 mL容量瓶中，加入適量甲醇，超聲破乳5 min，冷卻至室溫后，用甲醇定容至刻度線，用0.22 μm的微孔濾膜過濾后得樣品溶液。按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定峰面積，通過線性回歸方程計算出該樣品中RH的質量濃度為1.21 μg·mL-1，并用以下公式計算出CP-FARH NPs樣品中大黃酸的包封率（EE%）和載藥量（LE%）[15]。

按以上公式計算出EE%為75.84%，LE%為5.06%，表明RH在CP-FA-RH NPs納米體系中裝載性能好，有效提高了RH的生物利用度，為該納米制劑開發口服治療疾病奠定了良好的基礎。

2.5 CP-FA-RH NPs的微觀形貌及X射線衍射圖譜

2.5.1 CP-FA-RH NPs的微觀形貌 量取1ml CP-FA-RH NPs溶液，用去離子水稀釋至適當濃度，緩慢滴在具有碳支持膜的銅網上，停留5 min左右，用濾紙吸去多余液體，然后再用2%的磷鎢酸溶液負染2 min，自然晾干后，在200 nm尺寸下用透射電子顯微鏡觀察CP-FA-RH NPs的微觀形貌。結果見圖7，CP-FA-RH NPs呈圓球形，大小均勻，粒子之間無粘連，成型性好。

圖7 CP-FA-RH NPs的微觀形貌圖

2.5.2 X射線衍射圖譜 按照CP-FA-RH NPs的制備流程，在不加RH的條件下，制備空白納米溶液（blank NPs），通過真空冷凍干燥獲取blank NPs粉末和CPFA-RH NPs粉末。利用X射線衍射儀在40 kV、40 mA條件下，用5°/min的速度從5°掃描到90°，對RH粉末、所有材料混合物粉末，blank NPs粉末和CP-FARH NPs粉末進行晶型分析。結果如圖8所示，RH圖譜在15°至90°的范圍內顯示出許多尖銳的峰，表明了RH典型的晶體特性。相比之下，這些尖銳的峰沒有出現在blank NPs和CP-FA-RH NPs中，這表明RH與所有載體基質之間沒有形成任何結晶配合物，并以無定形狀態成功包載在載體基質中。

圖8 X射線衍射圖譜

2.6 巨噬細胞靶向性能研究

2.6.1 巨噬細胞培養 小鼠單核巨噬細胞白血病細胞（Raw 264.7）購自上海蓋恩生物科技有限公司，在含有10%熱滅活胎牛血清和1%青霉素鏈霉素的DMEM培養基中培養，所有細胞均置于37 ℃，5%CO2的細胞培養箱中孵育。

2.6.2 靶向性能評估 為了探究FA功能化的CP-FARH NPs的靶向能力，采用激光共聚焦顯微鏡對巨噬細胞攝取進行可視化圖像分析。由于RH無熒光特性，因此利用疏水熒光探針香豆素6（C6）代替RH進行示蹤。此外，基于口服納米遞藥系統的構建，評估CP-FA-C6 NPs的靶向性能需要腸道菌群對CP層進行降解，然后再觀察巨噬細胞對FA-C6 NPs的攝取[16]。因此，在沒有腸道菌群相互作用的情況下，僅在FA-C6 NPs、C6 NPs和Free C6組進行靶向攝取分析，而在CP-FA-C6 NPs組中不進行分析。首先，將培養至對數生長期的Raw 264.7細胞接種于激光共聚焦小皿中，每皿接種約 1×105個細胞，然后放置于恒溫培養箱培養 12 h；待細胞貼壁后，棄掉原培養基，分別加入含FA-C6 NPs、C6 NPs和Free C6的新鮮培養基（以C6計，濃度為 100 ng·mL-1）并繼續放置于恒溫培養箱中孵育；4 h后，再次棄掉皿中培養基，用冷PBS清洗3次，然后加入4%多聚甲醛固定10 min，再用冷PBS清洗3次后，加入1 ml DAPI溶液,10 min后再次吸取冷PBS進行清洗；最后，加入抗熒光猝滅劑，將小皿放置于激光共聚焦顯微鏡下進行觀察。藍色熒光代表細胞核，綠色熒光代表C6標記的NPs。結果如圖9所示，在Free C6組中觀察到較差的綠色熒光，弱于C6 NPs組和FA-C6 NPs組；其中，FA-C6 NPs組觀察到的熒光最亮，表明FA功能化的NPs更容易被Raw 264.7細胞攝取。為了確認由巨噬細胞表面FA受體介導的FA功能化NPs的靶向攝取，采用游離FA溶液預處理細胞1h，然后再分別與C6 NPs和FA-C6 NPs一起孵育4 h。結果表明，與未使用游離FA溶液預處理的FA-C6 NPs組相比，游離FA溶液預處理后FA-C6 NPs組細胞的熒光強度顯著降低。然而，在C6 NPs組中沒有發現類似的變化，進一步闡明了FA-C6 NPs通過FA介導的內吞作用特異性被Raw 264.7細胞靶向攝取。結合以上結果，本文研究設計制備的CP-FA-RH NPs具備靶向巨噬細胞的能力，為以后開發或借鑒用于靶向治療提供了良好的基礎。

圖9 巨噬細胞對不同納米制劑靶向攝取圖

3 討論

早些年前，國內外學者就在超分子診療理念中指出了基于超分子聚合物構建納米遞藥系統的可行性和有效性[17]。超分子納米遞藥系統可以在水溶液和鹽溶液中保持完整的結構。在過去幾年的研究中，很多超分子納米載藥平臺在癌癥治療領域取得了突破性進展，其中一些已獲準用于臨床癌癥治療，如Doxil（聚乙二醇化脂質體阿霉素）、Onivyde（伊立替康脂質體）和Abraxane（白蛋白結合紫杉醇）等[18-20]。本研究開發合成聚合物CD-TA-TPGS，結合主客體相互作用力和靜電相互作用力，逐步將FA-AD和CP吸附在其表面，最終成功制備出了具備口服靶向巨噬細胞的大黃酸超分子納米粒CP-FA-RH NPs，它不僅有效解決了RH溶解度低，生物利用度差的問題，還有效實現了RH的靶向遞送，大大減少了其在疾病治療上對健康組織帶來的損傷，有望滿足日益增長的醫療需求。然而，盡管如此，在應對復雜的病理環境，超分子納米靶向遞藥系統的性能優化依然成為臨床治療發展的重中之重，對于載藥體系的生物穩定性、安全性、體內分布和代謝途徑等等的系統研究迫在眉睫，而考察和評價其在不同層面的作用和治療效果并逐步走向臨床也尚需時日。