南沙參總黃酮的提取工藝及抗氧化活性研究

楊麗華,劉子璇,徐香琴

(湖南科技學院 化學與生物工程學院,湖南 永州 425199)

南沙參又名沙參,具有養陰清肺、化痰、益氣等功效,主要用于肺熱燥咳、陰虛勞嗽、干咳痰黏、氣陰不足、煩熱口干等疾病的治療[1]。研究發現,南沙參化學成分復雜多樣,如多糖、酚酸、黃酮等[2-5]。但國內外以研究提取多糖類成分為主,對其黃酮類化合物的提取研究較少[6-8]。文獻調研發現,目前常用的黃酮類化合物的提取方法主要有超聲波輔助提取、微波提取、浸提法以及酶提法等[9-14],其中超聲波輔助提取具有提取溶劑量少、提取率高且產物不受高溫分解等優勢而被廣泛應用。此次研究以南沙參為原料,使用超聲波輔助方法提取南沙參總黃酮,考察料液比、超聲功率、乙醇濃度、超聲時間對總黃酮提取率的影響,并探索總黃酮提取液進行體外清除DPPH自由基和ABTS+自由基抗氧化活性研究,以期為南沙參的深度開發利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南沙參:采購于亳州市騰飛中藥材有限公司;蘆丁(GR):上海藍季生物有限公司;DPPH試劑:飛凈生物科技有限公司;L(+)-抗壞血酸:國藥集團化學試劑有限公司;ABTS+試劑:酷爾化學科技有限公司;亞硝酸鈉;天津市恒興化學試劑制造有限公司;氫氧化鈉:天津市福晨化學試劑廠;硝酸鋁:天津市科密歐化學試劑有限公司;無水乙醇:天津市致遠化學試劑有限公司;以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

SL-200型中藥萬能粉碎機:江陰市豐華藥化機械有限公司;SHB - 111 型循環水真空抽濾泵:予華儀器有限責任公司; TE1200型電子天平:上海一恒科學儀器有限公司;ZF-1 型紫外分光光度計:賽默飛世爾科技公司;KQ3200DE型數控超聲波清洗機:昆山市超聲儀器有限公司,101-2A型電熱鼓風干燥箱:天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蘆丁標準曲線的繪制及含量測定

南沙參總黃酮的含量測定采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法進行[15]。精密稱取經105 ℃干燥至恒重的蘆丁對照品26.3 mg(實含蘆丁 25 mg),置25 mL容量瓶中,加乙醇溶解并定容至刻度,搖勻,精密移取20 mL至100 mL容量瓶中,加蒸餾水至刻度,搖勻,即得質量濃度為0.2 mg/mL的蘆丁對照品溶液,分別量取上述對照品溶液1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0 mL,分別置25 mL容量瓶中,分別加6 mL去離子水,搖勻,加5%亞硝酸鈉溶液1 mL,混勻,靜置6 min,加10%硝酸鋁溶液1 mL,混勻,靜置6 min,加4%氫氧化鈉溶液10 mL,加去離子水至刻度,搖勻,靜置15 min,于510 nm處測定其吸光度值,以蒸餾水代替蘆丁溶液為空白對照。以蘆丁質量濃度X為橫坐標,吸光度值Y為縱坐標繪制標準曲線,得到線性回歸方程為:Y=11.879X+0.041 9,R2=0.999,得出蘆丁溶液質量濃度在0.005～0.05 mg/mL范圍內,線性關系良好。

南沙參總黃酮含量的測定:精密稱取樣品2 g,用70%乙醇20 mL超聲(功率90 W)提取20 min,過濾樣品,精密量取待測提取液2 mL至25 mL容量瓶中,按照對照品方法顯色后,于510 nm處測定吸光度值,根據標準曲線方程計算提取液中南沙參總黃酮生物質量濃度。按照下述公式計算總黃酮提取率:

式中:R為南沙參總黃酮提取率,%;C為提取液質量濃度,g/mL;V為提取體積,mL;m為樣品干質量,g。

1.3.2 體外抗氧化活性測定

參考孟晶晶等[16]的DPPH自由基清除率和ABTS+自由基清除率測定方法。

1.3.3 單因素實驗

分別考察提取時間(5,10,15,20 min),料液比(1∶5,1∶10,1∶15,1∶20)、乙醇濃度(30%,50%,70%,90%)、超聲功率(60,90,120,150 W)對南沙參總黃酮提取率的影響。

1.3.4 正交試驗設計

根據單因素的試驗結果,進行正交試驗的設計,對南沙參總黃酮的提取工藝進行優化。采用L9(34)正交表優化南沙參總黃酮提取工藝,其因素和水平如表1所示。

表1 正交試驗因素水平

1.3.5 數據分析

使用Excel 2010、spss21.0和Origin軟件進行相關實驗數據分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 提取時間對南沙參總黃酮提取率的影響

從圖1可以看出,提取時間在5～10 min,總黃酮提取率變化較少,10～15 min,南沙參總黃酮提取率隨著超聲時間的增加而增大可能是因為超聲時間較短時,南沙參總黃酮來不及完全溶出,從而導致提取率較低,當超聲時間超過15 min以后,可能是提取時間較長時,使得南沙參黃酮類物質會發生氧化而使得結構被破壞,從而使得南沙參總黃酮萼提取率下降。確定超聲時間15 min為最佳。

圖1 提取時間對南沙參總黃酮提取率的影響

2.1.2 料液比對南沙參總黃酮提取率的影響

由圖2可知,料液比1∶5(g∶mL)～1∶10(g∶mL)變化時,南沙參總黃酮提取率隨著料液比的增加而增大,可能是當料液比較小時,提取溶劑無法浸潤南沙參藥材,從而導致南沙參總黃酮的溶出受阻,當料液比超過1∶10(g∶mL)時,可能是溶劑過多,從而導致過濾等步驟中南沙參總黃酮的損失,從而導致南沙參總黃酮的提取率下降。確定料液比1∶10(g∶mL)為最佳。

圖2 不同料液比對南沙參總黃酮提取率的影響

2.1.3 乙醇濃度對南沙參總黃酮提取率的影響

由圖3可知,乙醇濃度在30%～70%時,南沙參總黃酮提取率隨著乙醇濃度的增加而呈現增大趨勢,可能是當乙醇濃度較小時,提取溶劑的極性比較大,導致南沙參總黃酮的溶出率較低。而當乙醇濃度超過70%時,乙醇的濃度較高時,大量脂溶性化學成分和醇溶性化學成分與南沙參總黃酮競相溶出,從而使得南沙參總黃酮的提取率下降,因此確定70%乙醇為最佳乙醇濃度。

圖3 不同乙醇濃度對黃酮提取率的影響

2.1.4 不同提取功率對南沙參總黃酮百分含量的影響

由圖4可知,當超聲功率由60～120 W變化時,南沙參總黃酮提取率隨著超聲功率的增加而增大,可能是超聲功率較低時,南沙參總黃酮類化學成分滲透、擴散和溶解能力較低,從而導致南沙參總黃酮的提取率較小。當超聲功率超過120 W時,超聲功率過大可能會使得南沙參總黃酮中的不穩定化學成分的結構發生改變,從而使得南沙參總黃酮的提取率下降。因此確定120 W為最佳功率。

圖4 不同提取功率對黃酮提取率的影響

2.2 正交法優化南沙參總黃酮提取工藝

表2為L9(34)正交實驗的結果。根據表1數據分析,從R值分析乙醇濃度(C)>料液比(B)>超聲功率(D)>超聲時間(A)。根據K值得出提取的最佳工藝是:A3B3C3D2。即提取時間為20 min,料液比為1∶15(g∶mL),乙醇濃度90%,提取功率為120 W,此時,南沙參總黃酮提取率量為0.46%,提取條件穩定性實驗表明RSD值為0.35%,說明此工藝穩定。

表2 正交試驗設計與結果

2.3 南沙參總黃酮抗氧化性活性試驗抗氧結果

2.3.1 南沙參總黃酮不同濃度對DPPH·自由基的清除能力

DPPH·自由基是一種較穩定的自由基,當加入樣品后,若含有抗氧化物質提供電子與DPPH·自由基配對使其顏色變淺,通過褪色程度就可以衡量清除活性的大小。由圖5可知,隨著南沙參總黃酮和維生素C濃度增加,DPPH自由基的清除率逐步增大,說明南沙參總黃酮和維生素C對DPPH自由基的清除能力呈現劑量依賴關系。當質量濃度達到0.009 5 mg/mL時,維生素C對照液對DPPH自由基的清除率高達97.4%,南沙參總黃酮對DPPH自由基清除能力為38%,說明其對DPPH自由基的清除能力較差。

圖5 不同濃度南沙參總黃酮對DPPH自由基的清除能力

2.3.2 南沙參總黃酮不同濃度對ABTS+自由基的清除能力

不同濃度南沙參總黃酮對ABTS+自由基的清除能力見圖6。

圖6 不同濃度南沙參總黃酮對ABTS+自由基的清除能力

由圖6可知,隨著南沙參總黃酮和維生素C濃度的增加,對ABTS+自由基的清除率逐漸增大,說明南沙參總黃酮和維生素C的濃度與ABTS+自由基清除率之間呈現劑量依賴關系,且同一濃度下南沙參總黃酮對ABTS自由基的清除能力強于維生素C對照液。當南沙參總黃酮濃度和維生素C質量濃度達到0.007 9 mg/mL時,其清除率高達96.74%,說明南沙參總黃酮具有非常強的清除ABTS+自由基的能力。

3 結論

本研究以南沙參總黃酮的提取率為考察目標,在單因素實驗考察基礎上,采用正交設計,獲得最佳提取工藝:即以90%的乙醇溶液作為提取溶劑,提取時間為20 min,料液比為1∶15(g∶mL),提取功率為120 W,此時總黃酮提取率為0.46%。采用最優工藝對南沙參總黃酮進行提取,并測定南沙參總黃酮對DPPH自由基和ABTS+自由基的清除率分別可達38%,96.74%,說明南沙參總黃酮對DPPH自由基的清除率弱,對ABTS自由基的清除率非常強,說明南沙參具有良好的抗氧化活性,是一種潛在的天然抗氧化劑,值得深入研究。