花色苷-硫酸軟骨素共色物復(fù)合普魯蘭多糖穩(wěn)態(tài)體系構(gòu)建與評(píng)價(jià)

鮑義文，任廣宇，李佳欣，田金龍，楊曙方，楊一鋆，司 旭,，李 斌,

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866；2.浙江藍(lán)美技術(shù)股份有限公司，浙江 諸暨 311800）

花色苷是一種廣泛分布于植物中的水溶性天然功能色素，屬黃酮多酚類(lèi)化合物，是漿果中重要的活性成分，具有抗氧化、緩解視力疲勞、延緩衰老、調(diào)節(jié)糖脂代謝、防御神經(jīng)退行性疾病等多種生理功能，廣泛應(yīng)用于飲料、藥品、化妝品和營(yíng)養(yǎng)藥品的制造中[1-2]。隨著藍(lán)莓等漿果產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，特色漿果制品市場(chǎng)迎來(lái)熱潮，藍(lán)莓花色苷（blueberry anthocyanins，BA）作為重要功能色素，在加工中可以賦予制品色澤、提供營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。然而，由于花色苷穩(wěn)定性差，易受環(huán)境脅迫（pH值、光、熱等）發(fā)生降解，導(dǎo)致其在加工過(guò)程中損失嚴(yán)重，體內(nèi)吸收利用率低，限制了藍(lán)莓深加工制品的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用[3-4]。因此，尋求提高藍(lán)莓制品中花色苷穩(wěn)定性技術(shù)，構(gòu)建花色苷穩(wěn)態(tài)體系研究尤為重要。

共色技術(shù)和包封技術(shù)是提高花色苷穩(wěn)定性的重要手段。共色是指花色苷與生物聚合物、酚酸類(lèi)物質(zhì)和金屬離子等共色物自締合或形成復(fù)合物的現(xiàn)象[5-6]。這一作用機(jī)制可以增強(qiáng)花色苷的色澤強(qiáng)度，保護(hù)有色的黃烊陽(yáng)離子免受水分子的親核攻擊，穩(wěn)定花色苷結(jié)構(gòu)[7-9]。硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）是一種獨(dú)特的帶負(fù)電荷的酸性黏多糖，廣泛分布在動(dòng)物組織的細(xì)胞外基質(zhì)中，其分子鏈由β-1,4連接的葡萄糖醛酸以及β-1,3-N-乙酰乙?；?D-氨基葡萄糖交替單元組成[10-11]。與低分子質(zhì)量酚酸輔色花色苷相比，CS分子質(zhì)量較大、具有較高的電荷密度可以保持與花色苷的π-π堆積構(gòu)型，起到更加穩(wěn)定的作用[12]。包封技術(shù)可以穩(wěn)定共色物結(jié)構(gòu)，最大限度地保留花色苷含量，以阻止其受環(huán)境脅迫帶來(lái)的負(fù)面效應(yīng)。普魯蘭多糖（pullulan，PU）是一種天然的水溶性微生物細(xì)胞外多糖，由α-1,4和α-1,6糖苷鍵連接的麥芽三糖單元組成，具有良好的生物相容性、可食用性和優(yōu)異的成膜性能，有利于形成穩(wěn)定的凝膠體系，此外由于PU作為非離子多糖不會(huì)對(duì)BA-CS共色物之間的電荷相互作用產(chǎn)生干擾，因此其可作為天然生物大分子包埋活性成分的理想材料[13-15]。共色與包封技術(shù)的聯(lián)合使用可以最大限度增強(qiáng)花色苷色澤并提高其穩(wěn)定性，在食品工業(yè)中具有廣闊應(yīng)用前景。

本研究基于共色與包封結(jié)合技術(shù)，采用CS離子絡(luò)合BA形成共色復(fù)合物，利用PU包封共色物，構(gòu)建負(fù)載BA的穩(wěn)態(tài)體系（BA-CS-PU）。利用紫外-可見(jiàn)光譜和色度參數(shù)評(píng)價(jià)共色物增色效果，通過(guò)傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）及熱重分析（thermogravimetric analysis，TGA）等對(duì)穩(wěn)態(tài)體系進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，解析其共色包埋機(jī)制，探究加工條件及體外模擬消化對(duì)穩(wěn)態(tài)體系中BA的穩(wěn)定性影響，從而評(píng)價(jià)BA-CS-PU體系在藍(lán)莓深加工制品中的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)美I號(hào)BA（純度40%）浙江藍(lán)美技術(shù)股份有限公司；CS（純度90%）鑫瑞生物科技有限公司；PU（純度99%）北京索萊寶科技有限公司；胰酶、胃蛋白酶、α-淀粉酶 上海瑞恩生物科技有限公司；膽汁提取物 北京奧博生物科技有限公司；VC、鹽酸、氫氧化鈉（均為分析純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Evolution 201紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、FTIR光譜儀 賽默飛世爾科技公司；pH計(jì)、TGA儀 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；NS 800分光測(cè)色儀 深圳市三恩時(shí)科技有限公司；DK-S26水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；磁力恒溫?cái)嚢杵?鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；SCIENTZ-10N冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；Centrifuge 5804R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 BA-CS共色物的制備

取適量CS將其溶解于超純水中制備成質(zhì)量濃度分別為1.5、2.0、2.5 mg/mL的CS溶液，用1 mol/L的鹽酸溶液將pH值調(diào)節(jié)至3.0。將一定量的BA溶于pH 3.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液，將BA溶液加入制備好的CS溶液中，使BA終質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，磁力攪拌30 min，得到CS質(zhì)量濃度分別為1.5、2.0、2.5 mg/mL的BA-CS共色物溶液。

1.3.2 色度測(cè)定

通過(guò)分光測(cè)色儀測(cè)定溶液的色澤參數(shù)（L、a、b），并根據(jù)式（1）計(jì)算ΔE值：

式中：L為色澤的明亮度；a為色澤的紅綠度；b為色澤的黃藍(lán)度。L0、a0、b0為對(duì)照樣品的色度值。

1.3.3 紫外-可見(jiàn)光譜測(cè)定

測(cè)量BA溶液、CS溶液及BA-CS共色物溶液在pH 3條件下的紫外-可見(jiàn)光譜，掃描波長(zhǎng)為380～780 nm。同時(shí)，用相機(jī)記錄BA溶液和BA-CS共色物溶液的色澤變化。

1.3.4 BA-CS-PU穩(wěn)態(tài)體系構(gòu)建

將PU溶解于pH 3.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中，磁力攪拌制備得到質(zhì)量濃度為2.0、3.0、4.0 mg/mL的PU溶液。將制備的BA-CS共色物溶液與PU溶液等體積混合，在磁力攪拌器的作用下室溫?cái)嚢?0 min得到BA-CSPU穩(wěn)態(tài)體系，根據(jù)PU的添加質(zhì)量濃度將其命名為BACS-PU2、BA-CS-PU3和BA-CS-PU4。以單獨(dú)BA溶液作為實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組。

1.3.5 FTIR

采用FTIR光譜儀測(cè)定BA、CS、PU、BA-CS、BA-PU和BA-CS-PU的吸收光譜，分析基質(zhì)組分之間的相互作用。光譜的掃描范圍為400～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.3.6 TGA

將冷凍干燥的BA、CS、PU、BA-CS、BA-PU和BA-CS-PU粉碎，然后使用TGA儀進(jìn)行檢測(cè)。分析范圍為25～600 ℃，加熱速率為10 ℃/min，氮?dú)饬魉贋?00 mL/min。記錄TGA和微商熱重（derivative thermogravimetrc，DTG）曲線。

1.3.7 BA保留率測(cè)定

采用pH示差法測(cè)定BA的含量。將樣品用pH 1.0和pH 4.5檸檬酸緩沖溶液稀釋一定倍數(shù)，使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量BA的吸光度，使得BA吸光度在0.2～0.8之間。避光顯色1 h后，分別于520 nm和700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定BA溶液的吸光度，每個(gè)樣品做3 次平行實(shí)驗(yàn)。樣品中BA質(zhì)量濃度（C）及保留率分別按式（2）、（3）計(jì)算：

式中：A＝（A520nm-A700nm）pH1.0-（A520nm-A700nm）pH4.5；DF為稀釋因子；M為矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷（C3G）的相對(duì)分子質(zhì)量（449.2）；ε為C3G的摩爾消光系數(shù)（26 900 L/（mol·cm））；L為光程長(zhǎng)（1 cm）。

式中：Ct為BA在t時(shí)刻的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；C0為BA的初始質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.8 體外模擬消化

參考Guo Ruixue等[16]的體外模擬方法并稍作修改。用6 mol/L的HCl溶液和0.9 mol/L的NaHCO3溶液對(duì)消化過(guò)程pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)。消化過(guò)程使用恒溫水浴搖床于37 ℃、120 r/min振蕩進(jìn)行?？谇幌簩悠费b入錐形瓶并加入1 mL唾液模擬液（32.5 mgα-淀粉酶和2.775 mg CaCl2溶于25 mL超純水中）消化10 min，取樣。胃消化：唾液消化結(jié)束后，pH值調(diào)至3并加入1 mL胃液模擬液（1 g胃蛋白酶溶于25 mL超純水中）于樣品中，消化2 h，每隔1 h取樣1 次。小腸消化：胃消化結(jié)束后，pH值調(diào)至7.5，并加入10 mL腸液模擬液（0.5 g胰酶、3.125 g胰蛋白酶、3 g膽汁鹽、0.21 g NaHCO3溶于25 mL超純水中）消化2 h，每隔1 h取樣一次。以單獨(dú)BA樣品作為空白對(duì)照。樣品中BA質(zhì)量濃度及保留率分別通過(guò)公式（2）和（3）計(jì)算得到。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 CS輔色BA效果評(píng)價(jià)

2.1.1 CS質(zhì)量濃度對(duì)BA的色澤影響

CS與BA以不同比例復(fù)合的色澤參數(shù)、色差值及表觀色澤如表1所示。結(jié)果表明，隨著CS的加入溶液的L值和b值降低，說(shuō)明其溶液亮度變暗，黃色色度降低。值得注意的是，CS的加入使得溶液的a值顯著增加（P＜0.05），說(shuō)明溶液的紅色色度顯著增強(qiáng)，證明了CS與BA復(fù)合后共色物的形成增強(qiáng)了BA溶液原本的紅度。從表1可以清晰看到，色澤增強(qiáng)現(xiàn)象，由鮮紅轉(zhuǎn)變?yōu)樯罴t色，表明CS已與BA復(fù)合形成共色物。其中，CS質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)，復(fù)合溶液的a值（5.77±0.04）最大，此時(shí)與單獨(dú)BA溶液相比ΔE值（3.97±0.80）顯著增加。因此，CS質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)與BA復(fù)合表現(xiàn)出了最佳共色效果，后續(xù)選定此質(zhì)量濃度進(jìn)行共色物評(píng)價(jià)及穩(wěn)態(tài)體系構(gòu)建。

表1 BA及不同質(zhì)量濃度CS輔色BA的色度參數(shù)及色澤變化Table 1 Color parameters and color changes of BA and BA complexes with different concentrations of CS

2.1.2 BA-CS共色溶液的色澤及紫外-可見(jiàn)光譜分析

BA及BA-CS共色物溶液在pH 3的條件下色澤變化及紫外-可見(jiàn)光譜如圖1所示，對(duì)比單獨(dú)的BA溶液，BA-CS共色物溶液產(chǎn)生的離子絡(luò)合現(xiàn)象使色澤強(qiáng)度顯著增加。單獨(dú)BA溶液的最大吸收波長(zhǎng)在520 nm左右，加入CS之后形成的共色復(fù)合物最大吸收峰移動(dòng)到540 nm附近，與單獨(dú)BA溶液相比，波長(zhǎng)向長(zhǎng)波長(zhǎng)方向發(fā)生移動(dòng)，產(chǎn)生紅移現(xiàn)象。然而單獨(dú)的CS溶液在此波長(zhǎng)范圍內(nèi)沒(méi)有吸收峰的產(chǎn)生，說(shuō)明是二者共色物的產(chǎn)生使波長(zhǎng)發(fā)生移動(dòng)。此外BA-CS共色物在最大吸收峰位置的吸光度顯著增加（0.99→1.67），進(jìn)一步證明了共色現(xiàn)象的發(fā)生，這與Xie Chenjing等[17]的研究結(jié)果一致，表明CS的加入與BA產(chǎn)生離子絡(luò)合物發(fā)生共色作用從而增強(qiáng)了BA溶液的色澤，使得最大吸收峰發(fā)生紅移[17-18]。

圖1 BA、CS及BA-CS共色物紫外-可見(jiàn)光譜圖Fig.1 UV-vis spectra of BA,CS and BA-CS co-pigmentation complex

2.1.3 BA-CS共色物色度及色澤穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

BA溶液及BA-CS共色物溶液在pH 2～8條件下的色澤變化參數(shù)及圖像對(duì)比如表2所示，隨著pH值增加，BA溶液色澤發(fā)生變化，是由于花色苷的結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致的（黃烊陽(yáng)離子→查耳酮、甲醇甲堿→醌式堿）[19-20]。隨著CS的加入，在pH 2～3時(shí)，L、a值無(wú)顯著差異，b值降低。從結(jié)果看出，BA溶液在較穩(wěn)定的pH值范圍內(nèi)（pH 2～3），CS的加入對(duì)BA的紅值無(wú)顯著影響，但從圖像色澤可以看出CS與BA發(fā)生絡(luò)合使共色物色度增強(qiáng)。然而，在pH 4～6的條件下，CS的加入使溶液的L、a、b值均發(fā)生顯著變化。值得注意的是，相同pH值條件BA-CS復(fù)合溶液的a值顯著高于BA溶液，結(jié)果表明CS對(duì)花色苷的紅色起到顯著保護(hù)作用，并增強(qiáng)了溶液的色澤。當(dāng)pH值在中性及堿性條件下時(shí)，BA溶液的L值較酸性條件有所降低，表明溶液色澤整體偏暗。同時(shí)a值及b值呈現(xiàn)小于0的趨勢(shì)，表明溶液紅色、黃色逐漸消失并分別向綠色及藍(lán)色域轉(zhuǎn)移。綜上，CS的加入與BA產(chǎn)生共色作用，使得BA在較不穩(wěn)定的酸性條件下（pH 4～6）紅值顯著增強(qiáng)，同時(shí)在廣泛pH值范圍內(nèi)（pH 2～8）均顯著增強(qiáng)了溶液色澤，證明了共色物的形成。

表2 BA及BA-CS在pH 2.0～8.0下的色澤參數(shù)及圖像Table 2 Color parameters and visual color of BA and BA-CS at pH 2.0–8.0

將BA溶液（圖2A）及BA-CS共色物溶液（圖2B）在室溫下存放14 d評(píng)價(jià)天然色素及添加生物聚合物后的色澤穩(wěn)定性。每2 d測(cè)定一次色澤參數(shù)（L、a、b）并以第1天色澤參數(shù)為對(duì)照計(jì)算?E。BA和BA-CS溶液在pH 2～3時(shí)顯色最穩(wěn)定，在貯藏14 d內(nèi)具有最低的色差值，且整體趨于穩(wěn)定狀態(tài)，說(shuō)明在此pH值范圍內(nèi)花色苷的色澤最穩(wěn)定。當(dāng)溶液pH值在4～9時(shí)，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，色差值增加，色澤穩(wěn)定性減弱，貯藏超過(guò)10 d后色差值趨于穩(wěn)定。相比于單獨(dú)的BA溶液，CS的加入降低了溶液的色差值，提高了天然花色苷的色澤穩(wěn)定性。

圖2 BA溶液（A）和BA-CS溶液（B）在pH 2～8條件下的?E變化Fig.2 ?E values of BA solution (A) and BA-CS solution (B) at pH 2–8

2.2 BA-CS-PU穩(wěn)態(tài)體系結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 FTIR分析

為確認(rèn)復(fù)合體系的形成，分析BA、CS和PU三者之間存在的相互作用，通過(guò)FTIR對(duì)各組分進(jìn)行表征，結(jié)果如圖3A所示。FTIR光譜在3 431（BA）、3 445（CS）、3 411（PU）、3 434（BA-CS）、3 422 cm-1（BA-PU）及3 423 cm-1（BA-CS-PU）處的譜帶是由于—OH的存在。在BA的光譜中，1 638 cm-1和1 413 cm-1處的特征峰歸因于苯并吡喃芳香環(huán)的振動(dòng)（C—C環(huán)伸展），是黃酮衍生物的象征[21]。CS光譜的特征峰出現(xiàn)在1 632、1 341 cm-1和1 226 cm-1處，分別為酰胺I帶、O—H變角度振動(dòng)和S＝O伸展[22]。PU光譜在1 153、1 021 cm-1處的特征峰分別歸因于PU的α-1,4糖苷鍵和C—O的拉伸振動(dòng)，在851 cm-1處觀察到的峰值是PU的α-吡喃葡萄糖單元[23-24]。

圖3 BA-CS-PU穩(wěn)態(tài)體系的表征Fig.3 Characterization of BA-CS-PU

在BA-CS共色物光譜中，CS在S＝O處的1 226 cm-1特征峰移動(dòng)到1 235 cm-1處，BA的特征峰被掩蔽。因此，結(jié)合Xie Chenjing等[17]的結(jié)果，合理推測(cè)CS和BA的結(jié)合方式為BA的活性酚羥基和CS的自由羧基之間發(fā)生氫鍵結(jié)合，共色作用是由CS和BA之間通過(guò)硫酸基團(tuán)和BA黃烊陽(yáng)離子形成離子絡(luò)合產(chǎn)生[17,25]。在BA-CS-PU復(fù)合物體系中，—OH位置特征峰與單獨(dú)物質(zhì)相比均發(fā)生偏移，推測(cè)各組分之間存在氫鍵相互作用。此外各組分的特征峰出現(xiàn)移動(dòng)，峰強(qiáng)發(fā)生變化，說(shuō)明各物質(zhì)之間發(fā)生結(jié)合，BA被嵌入到復(fù)合物中，成功構(gòu)建負(fù)載BA的穩(wěn)態(tài)體系。

2.2.2 TGA結(jié)果

通過(guò)TGA方法評(píng)價(jià)BA-CS-PU體系的熱穩(wěn)定性，TGA（圖3B）和DTG（圖3C）曲線反映出BA-CS-PU的熱降解過(guò)程主要有3 個(gè)階段。第1階段發(fā)生在25～100 ℃范圍內(nèi)，質(zhì)量損失約10%，質(zhì)量變化為每分鐘下降1.0 mg，這可能是由于復(fù)合體系中表面附著的BA降解造成。第2階段發(fā)生在160～220 ℃，熱質(zhì)量損失約9%，質(zhì)量變化為每分鐘下降2.0 mg，這可能是由于BA-CS-PU體系中自由水的蒸發(fā)和解吸作用，與包封材料固有的親水性有關(guān)[17,26]。第3階段發(fā)生在220～265 ℃，由于多糖結(jié)構(gòu)的分解，質(zhì)量損失率約為17%，質(zhì)量變化為每分鐘下降1.6 mg，此時(shí)體系中BA大部分被降解和釋放[27]。此外，從DTG圖可以看出，BA、BA-CS、BA-PU及BA-CS-PU的吸熱峰溫度分別為218.4、194.2、297.5 ℃及262.5 ℃。因此，從熱質(zhì)量損失率及吸熱峰溫度變化綜合考慮，BACS-PU體系具有更好的耐熱性。由于CS中的硫酸鹽基團(tuán)與BA黃烊陽(yáng)離子相互作用（圖3A），增強(qiáng)了膠體的表面穩(wěn)定性，從而在BA-CS共色物上產(chǎn)生了大量的親水表面[12]。為了增強(qiáng)穩(wěn)態(tài)體系對(duì)BA的保護(hù)作用，使用PU包裹BA-CS共色物，形成類(lèi)似凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，將共色物嵌入其中，通過(guò)共色與包封技術(shù)的結(jié)合更大程度保護(hù)BA的穩(wěn)定性，結(jié)合FTIR分析其作用機(jī)理示意圖如圖3D所示。

2.3 BA-CS-PU穩(wěn)態(tài)體系的加工穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

2.3.1 熱加工

BA很容易受到溫度的影響，導(dǎo)致其降解。因此研究大分子穩(wěn)態(tài)體系對(duì)BA的保護(hù)作用具有重要意義。BA溶液和BA-CS-PU體系在不同溫度處理?xiàng)l件下的保留率及a值分析如圖4所示。在食品常用加工溫度范圍內(nèi)，隨著熱處理溫度的升高，BA保留率降低，90 ℃處理后BA保留率最低（66.24%）。這可能是因?yàn)樵跓峒庸み^(guò)程中BA受熱發(fā)生水解反應(yīng)，糖苷鍵斷裂，破壞了BA的結(jié)構(gòu)。值得注意的是，在各個(gè)溫度處理?xiàng)l件下，BA-CS-PU復(fù)合體系中的BA保留率均顯著高于游離BA組。其中，在70、80 ℃和90 ℃處理組中，3 mg/mL的PU形成的BA-CS-PU3組對(duì)BA的保護(hù)作用最明顯，保留率比對(duì)照組分別提高了7.68%、4.97%和7.17%（圖4A）。穩(wěn)態(tài)體系中BA熱穩(wěn)定性提高可能與BA與壁材之間的非共價(jià)鍵相互作用有關(guān)，除吸收較高能量外，BA均不容易被破壞[28]。

圖4 不同溫度處理時(shí)BA-CS-PU體系對(duì)BA保留率（A）和a值（B）的影響Fig.4 Effect of BA-CS-PU system on BA retention rate (A) and a value (B) at different temperatures

BA溶液的紅色域強(qiáng)度是評(píng)價(jià)其感官色澤的重要指標(biāo)。由于花色苷自然狀態(tài)下色澤為紅色域，因此通過(guò)a值的大小可以評(píng)價(jià)BA溶液紅色的強(qiáng)弱，以證明復(fù)合體系對(duì)BA色澤的保護(hù)作用。從a值結(jié)果看出，不同溫度處理組單獨(dú)的BA溶液具有最低的a值，而B(niǎo)A-CS-PU復(fù)合體系的a值顯著高于對(duì)照組，其中以3 mg/mL的PU形成的BA-CS-PU3組對(duì)BA的色澤保護(hù)作用最明顯（圖4B）。綜上分析，PU質(zhì)量濃度在3 mg/mL時(shí)，形成的復(fù)合體系可能最佳。

2.3.2 酸堿強(qiáng)度

食品加工過(guò)程不同體系中往往伴隨著pH值的變化，然而B(niǎo)A受pH值影響顯著，因此模擬加工的廣泛pH值范圍內(nèi)BA的保留率情況具有重要意義。熱處理30 min后，避光貯藏24 h，BA保留率如圖5A所示。在pH 2～4范圍內(nèi)BA的保留效果較佳，在此pH值范圍內(nèi)，BA以黃烊陽(yáng)離子形式存在，具有穩(wěn)定的母核結(jié)構(gòu)，此范圍內(nèi)不易受外界環(huán)境脅迫導(dǎo)致失穩(wěn)。其中pH 3時(shí)BA的保留率最高。在pH 5～6時(shí)，BA保留率顯著降低，此范圍內(nèi)BA由黃烊陽(yáng)離子結(jié)構(gòu)逐漸轉(zhuǎn)化為甲醇甲堿或查耳酮形式，導(dǎo)致其母核結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易受親水核攻擊，BA保留率降低。值得注意的是，在廣泛pH值條件下BA-CS-PU體系的處理后BA的保留率均比對(duì)照組顯著提高（P＜0.05）。因此，加工過(guò)程為最大限度保留BA含量，在加工體系中盡量選擇pH 3體系。值得注意的是，在弱酸環(huán)境下BA-CS-PU體系可以顯著提高BA的保留率，以3 mg/mL PU形成的BA-CS-PU3體系對(duì)BA的保留率最為顯著。

圖5 不同pH值處理時(shí)BA-CS-PU體系對(duì)BA保留率（A）和a值（B）的影響Fig.5 Effect of BA-CS-PU system on BA retention rate (A) and a value (B) at different pH levels

BA的pH值變化與其形成的色澤顯著相關(guān)，BA溶液在pH 2～4時(shí)呈現(xiàn)紅色，此時(shí)BA主要以黃烊陽(yáng)離子形式存在；pH 5～6時(shí)，BA逐漸轉(zhuǎn)化為接近無(wú)色的甲醇甲堿或查耳酮形式；pH 7～10時(shí)，BA轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的醌式堿形式；在pH 11～12時(shí)，BA降解產(chǎn)生酚酸類(lèi)物質(zhì)使溶液呈現(xiàn)出黃褐色[19]。如圖5B所示，BA在pH 3時(shí)a值最大，隨著pH值升高a值降低，說(shuō)明BA的紅色度逐漸下降。然而，與對(duì)照組相比BA-CS-PU體系顯著提高了BA的a值，保護(hù)了其有色結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。因此BA-CS-PU所形成的穩(wěn)態(tài)體系在保護(hù)BA的色澤，提升相關(guān)加工食品的色澤穩(wěn)定性中具有重要價(jià)值。

2.3.3 VC共存

然而，因其本身表現(xiàn)的強(qiáng)還原性，對(duì)BA的穩(wěn)定性具有破壞作用。Chung等[29]發(fā)現(xiàn)VC會(huì)加速BA的降解。在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)VC處理?xiàng)l件下游離BA及BA-CS-PU體系中BA的保留率如圖6A所示。隨著VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，BA保留率呈下降趨勢(shì)，這可能是由于VC在有氧條件下氧化生成了H2O2或BA與VC之間發(fā)生了縮合反應(yīng)，從而降低BA的穩(wěn)定性[30]。值得注意的是，與對(duì)照組相比，任意VC含量下BA-CS-PU體系中BA的保留率顯著增加（P＜0.05）。其中，以3 mg/mL PU形成的BA-CS-PU3體系對(duì)BA的保留率最為顯著。結(jié)果表明，VC共存條件下，BA-CS-PU體系可以有效保護(hù)BA的穩(wěn)定性。

圖6 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)VC處理時(shí)BA-CS-PU體系對(duì)BA保留率（A）和a值（B）的影響Fig.6 Effect of BA-CS-PU system on BA retention rate (A) and a value (B)in the presence of different concentrations of VC

如圖6B所示，在VC共存條件下，隨著其含量增加，BA的a值逐漸減小，說(shuō)明其溶液紅色逐漸淡化。與單獨(dú)BA相比，BA-CS-PU體系在0.05%～0.5% VC條件下，a值均顯著增加（P＜0.05），說(shuō)明體系中共色物的存在結(jié)合PU的包封效果可以顯著提高BA溶液色澤穩(wěn)定性，在富含VC與BA的液態(tài)飲品中，BA-CS-PU體系可以最大程度保護(hù)BA的色澤，提升食品的感官品質(zhì)。

2.4 BA-CS-PU穩(wěn)態(tài)體系的消化穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

在模擬加工穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，綜合比較發(fā)現(xiàn)BA-CSPU3體系對(duì)BA具有最優(yōu)的保護(hù)效果。因此進(jìn)一步利用體外模擬消化實(shí)驗(yàn)，探究BA-CS-PU3穩(wěn)態(tài)體系對(duì)BA的保護(hù)作用效果。樣品在模擬口腔、胃1 h、胃2 h、腸1 h和腸2 h條件下BA的殘留率情況如圖7所示，BA對(duì)照組經(jīng)過(guò)唾液、胃、小腸后保留率逐漸降低，唾液、胃1 h、胃2 h、腸1 h及腸2 h消化后的保留率分別為96.47%、92.71%、91.87%、22.41%和15.12%，而對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組BA-CS-PU3體系，在消化過(guò)程中的保留率分別為98.81%、96.78%、95.94%、31.02%和23.75%?？梢钥闯鯞A在唾液中降解不明顯，這是由于在唾液階段停留的時(shí)間較短。BA經(jīng)過(guò)胃消化后降解仍不明顯，這是由于胃環(huán)境pH值較低，此時(shí)BA以其穩(wěn)定的黃烊陽(yáng)離子結(jié)構(gòu)存在。然而消化至小腸時(shí)，BA的損失嚴(yán)重，這是由于BA在小腸時(shí)處于極不穩(wěn)定的堿性條件，其結(jié)構(gòu)由有色的黃烊陽(yáng)離子轉(zhuǎn)化為無(wú)色的查耳酮或甲醇甲堿形式，破壞了BA的穩(wěn)定性[31]。值得注意的是，在小腸消化1 h和2 h后，實(shí)驗(yàn)組BA-CS-PU3體系中BA的保留率較對(duì)照分別提高了8.61%和8.63%，進(jìn)一步證明BA-CS-PU穩(wěn)態(tài)體系對(duì)BA的正向保護(hù)作用。

圖7 BA和BA-CS-PU復(fù)合物體外模擬消化后的殘留率變化Fig.7 Changes in retention rates of BA and BA-CS-PU complex during simulated digestion in vitro

3 結(jié)論

BA易受環(huán)境脅迫影響色澤穩(wěn)定性，限制其在食品加工中的應(yīng)用。本研究通過(guò)共色技術(shù)與物理包埋相結(jié)合，以CS與BA離子絡(luò)合形成共色物再與PU復(fù)合制備了負(fù)載BA的BA-CS-PU穩(wěn)態(tài)體系。紫外-可見(jiàn)光譜及色度結(jié)果表明了BA-CS共色物的形成。FTIR和TGA結(jié)果表明各組分之間存在氫鍵相互作用，共色作用發(fā)生在CS的硫酸基團(tuán)和BA黃烊陽(yáng)離子之間的離子絡(luò)合。BA-CS-PU顯著提高了BA的熱加工、酸堿強(qiáng)度、VC共存條件下的保留率和色澤穩(wěn)定性，同時(shí)提高了胃腸消化穩(wěn)定性。綜上，基于共色與物理包埋技術(shù)結(jié)合所制備的BA-CS-PU穩(wěn)態(tài)體系在富含花色苷的食品中具有廣闊應(yīng)用前景。