熱殺菌期間胰蛋白酶改性對蛋清液耐熱性和結構特性的影響

祁騰達，馬艷秋，遲玉杰,，遲 媛

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農業大學工程學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

除水分外，蛋清液主要是由蛋白質、少量脂質、維生素及礦物質等組成的膠狀物質[1]，因其豐富的營養價值和優良的功能特性而廣泛應用于焙烤食品[2]。為了確保微生物安全性，一般使用的巴氏殺菌條件為55～57 ℃加熱3～4 min[3]，但是蛋清液易受到高溫的影響而變性聚集[4]。因此，改善蛋清液的耐熱性是擴大其在食品行業中應用的關鍵。為研究一種高耐熱性蛋清液，將其應用于在實際生產中，本研究通過胰蛋白酶改性的手段提升蛋清的耐熱性，并研究耐熱性與結構特性之間的關系。

胰蛋白酶是由胰腺分泌的消化酶之一，通常是從牛、豬、羊的胰臟中提取純化獲得的結晶，然后再制成凍干制劑[5]。胰蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶家族，主要作用是在小腸內將蛋白質和多肽分解為大小不等的肽段，對蛋白質的水解起著重要作用[6]。蛋白酶改性是利用蛋白酶在溫和條件下水解蛋白質，改變蛋白質結構，從而使蛋白質獲得更好的熱穩定性和功能性。遲玉杰等[7]利用中性蛋白酶水解蛋清粉，發現可以提高蛋清的起泡性和泡沫穩定性。劉劍秋等[8]通過使用復合風味蛋白酶水解濃度3%的全蛋液，可使其熱凝固溫度提高至75 ℃。涂勇剛等[9]對木瓜蛋白酶改善蛋清蛋白的起泡性工藝進行優化，起泡性提高140%。Tian Shuangqi等[10]利用木瓜蛋白酶水解小麥胚芽白蛋白，可有效改善起泡性。

近年來，利用酶改性液態蛋的功能性質研究有很多，但對于熱殺菌期間胰蛋白酶改性對蛋清液耐熱性和結構特性影響的分析相對較少。因此本研究采用胰蛋白酶對蛋清液進行酶改性，通過濁度和上清液蛋白含量兩個指標衡量蛋清液的耐熱性，探究在不同熱殺菌溫度（56、62、68 ℃和72 ℃，3 min）條件下，酶改性對蛋清液耐熱性和結構性質的影響，旨在為酶改性技術在蛋清液中的高效應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞蛋 哈爾濱香坊區好又多超市。

胰蛋白酶（酶活力8.9×104U/g）上海源葉生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilinonaphthalene-1-sulfonic acid，ANS）美國Sigma公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HH-4數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；JJ-1精密增力電動攪拌機 上海浦東物理化學儀器廠；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；F-7100熒光分光光度計、SU801場發射掃描電子顯微鏡 日本日立公司；Nicolet is50傅里葉變換紅外光譜儀、HAAKE MARS60旋轉流變儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；SYNC激光粒度儀 美國麥奇克有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

取新鮮雞蛋，洗凈干燥后打蛋分離蛋清，用紗布過濾得到新鮮蛋清液，勻速攪拌15 min。添加胰蛋白酶，酶改性條件：酶添加量0.15%、水解時間60 min、反應溫度42 ℃。以酶改性（25 ℃）和未改性（25 ℃）蛋清液為對照，蛋清液常用的巴氏殺菌條件為56 ℃加熱3 min，因此本實驗選用不同的熱殺菌溫度（56、62、68、72 ℃）加熱蛋清液3 min，其中一部分樣品經凍干后用于后續研究。

1.3.2 濁度的測定

參照杜清普等[11]的方法并稍作修改。將制備好的蛋清液樣品用去離子水稀釋20 倍，采用紫外-可見分光光度計測定溶液在540 nm波長處的吸光度，以此表示蛋清液樣品的濁度。

1.3.3 上清液蛋白含量的測定

參照何大博等[12]的方法。將制備好的蛋清液樣品，8 000 r/min離心30 min，離心后取上清液。使用BCA法總蛋白定量測定試劑盒測定上清液蛋白含量。將56.3 g/L的BCA蛋白質標準品用去離子水稀釋至不同質量濃度梯度（1、0.1、0.2、0.4、0.5 mg/mL），使用酶標儀在562 nm波長處測定吸光度，以蛋白含量為橫坐標，吸光度為縱坐標制作標準曲線。比照標準曲線計算蛋清液樣品的上清液蛋白含量。

1.3.4 表觀黏度的測定

參照Liu Xin等[13]方法并略有修改。測試前樣品在25 ℃放置1 h。樣品置于流變儀感應板上，使用C60平板進行測定，設定剪切速率范圍為0.01～100 s-1，板間距為1 000 nm。以剪切速率為橫坐標，表觀黏度為縱坐標，繪制剪切速率與表觀黏度的關系圖。運用Ostwald-de Waele冪次定律模型對關系圖進行回歸擬合，公式如下：

式中：λ為剪切速率/s-1；η為表觀黏度；K為黏稠系數；n為流體指數。

1.3.5 粒徑分布的測定

參照馬艷秋等[14]的方法并稍作修改，制備蛋白質量濃度為1～2 mg/mL的蛋清液樣品，使用激光粒度儀測定蛋清液樣品的粒徑分布，測定溫度25 ℃，參數設置：分散劑為水，分散劑折射率為1.33。以粒徑為橫坐標，體積分數為縱坐標繪制粒徑分布圖。

1.3.6 表面疏水性的測定

參照Li Xin等[15]的方法略有修改。預制蛋白質量濃度為1 mg/mL的蛋清液樣品，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L，pH 7.0）將蛋清液稀釋為5 個質量濃度梯度（蛋白質質量濃度0.1～0.5 mg/mL）。然后將20 μL ANS（8 mol/L）與4 mL樣品溶液混合，并在黑暗中放置15 min。使用熒光分光光度計測定熒光強度，激發波長390 nm；發射波長470 nm；狹縫寬度5 nm。曲線的斜率為測定蛋清液樣品的表面疏水性。

1.3.7 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

參照Huang Qun等[16]的方法并稍加修改。用PBS（0.01 mol/L，pH 7.0）稀釋蛋清液蛋白質量濃度為1 mg/mL。采用質量分數5%濃縮膠、質量分數12%分離膠進行SDS-PAGE，在80 V電壓下持續30 min后，調整電壓至120 V，染料距底部膠1 cm時停止電泳。凝膠用固定液固定30 min、染色液染色30 min、脫色液脫色過夜至條帶清晰后，使用凝膠成像儀對凝膠照相。

1.3.8 掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察

參照Li Peishan等[17]的方法并稍加修改。取少許凍干的蛋清樣品固定在導電膠上，噴金處理200 s。將放大倍數至500 倍，觀察不同蛋清的表觀形貌，并且拍攝照片記錄所觀察到的特征。

1.3.9 傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）分析

參照Han Ke等[18]的方法并稍加修改。將凍干蛋清樣品分別與干燥的KBr研磨混合后壓片，使用FTIR進行測定，掃描范圍為4 000～500 cm-1。使用OMNIC軟件對基線進行校正并分析蛋清液樣品蛋白二級結構的相對含量。

1.4 統計分析

2 結果與分析

2.1 熱殺菌期間酶改性對蛋清液濁度的影響

濁度能夠反映出蛋清液中的粒子大小和數量，可以描述蛋白質的聚集程度，從側面說明蛋清液耐熱性的變化情況[19]。熱殺菌溫度對酶改性和未改性蛋清液濁度的影響如圖1所示。在同一殺菌溫度下，酶改性蛋清液的濁度顯著低于未改性蛋清液（P＜0.05）。隨著熱殺菌溫度的升高，改性前后蛋清液的濁度都逐漸升高。結果表明，經酶改性后的蛋清液可以有效抑制蛋清蛋白質的熱聚集。可能是由于酶改性蛋清液的蛋白質水解為小分子蛋白，粒子變小導致濁度有所下降[20]，之后熱殺菌溫度升高，小分子蛋白重新聚合，導致濁度逐漸上升，這與暢鵬等[21]研究結果一致。

圖1 熱殺菌期間酶改性對蛋清液濁度的影響Fig.1 Effect of enzymatic modification on the turbidity of liquid egg white during heat sterilization

2.2 熱殺菌期間酶改性蛋清上清液蛋白含量的變化

如圖2所示，與25 ℃未改性蛋清液相比，經酶改性蛋清液的上清液中蛋白含量越多，表明酶改性對蛋清液中蛋白熱聚集的抑制效果越好，說明蛋白酶改性處理可以改善蛋清液的耐熱性[22]?？傮w上看，隨著熱殺菌溫度的升高，上清液蛋白含量呈下降趨勢。25 ℃酶改性蛋清液與未改性蛋清液的上清液蛋白含量無顯著差異（P＞0.05）。在同一熱殺菌溫度下，酶改性蛋清液的上清液蛋白含量顯著高于未改性（P＜0.05）。主要原因可能是加熱引起蛋白通過疏水相互作用聚集，導致上清液蛋白含量降低。而酶改性使蛋清蛋白水解為小分子，導致蛋清液里存在的上清液蛋白含量增多，帶電氨基酸暴露出來，增強了蛋白間的靜電斥力[23]，從而抑制了蛋白的熱聚集，改善了蛋清液的耐熱性。

圖2 熱殺菌期間酶改性蛋清上清液蛋白含量的變化Fig.2 Changes in protein content of enzyme-modified egg white supernatants during heat sterilization

2.3 熱殺菌期間酶改性對蛋清液表觀黏度的影響

在不同熱殺菌溫度下，通過測定酶改性對蛋清液體系的靜態流變學性質，得到黏度的變化。采用Ostwaldde Waele冪次定律模型進行擬合，判斷熱殺菌期間經過酶改性后體系的流體特性是否發生變化。

如圖3所示，表觀黏度隨著剪切速率的增加而降低，呈現剪切稀化的現象，說明酶改性和未改性的蛋清液均為非牛頓流體[24]。隨著熱殺菌溫度的升高，蛋清液的黏度呈現逐漸升高的趨勢。在同一熱殺菌溫度下，酶改性蛋清液的黏度均顯著低于未改性蛋清液（P＜0.05）。蛋清液的黏度增加可能是由于熱殺菌溫度的升高，蛋白質分子發生交聯，分子間的相互作用力增強。酶改性使得蛋清液結構間的相互作用力和共價交聯減少而降低黏度[25]。Li Xin等[26]研究發現，隨著熱殺菌溫度的升高，蛋白質擴展，然后通過疏水相互作用和二硫鍵重新聚集形成聚合體，具有更高的表觀黏度。

圖3 熱殺菌期間酶改性對蛋清液表觀黏度的影響Fig.3 Effect of enzymatic modification on the apparent viscosity of liquid egg white during heat sterilization

由表1可知，R2＞0.98，表示圖3能較好地反映表觀黏度和剪切應力的變化關系。對圖3中的曲線進行擬合Ostwald-de Waele冪次定律模型分析，其中K值越大表示蛋清液η越大[27]。從表1可以看出，酶改性蛋清液黏度降低，隨著熱殺菌溫度的升高，蛋清液黏度呈逐漸上升趨勢，K值增大。由于酶水解蛋清蛋白使蛋清液的體系分散，降低蛋白質分子間的凝集，熱殺菌溫度升高，其K值越大，說明蛋白分子交聯，重新聚合成較大的不溶性集合體。n變化不規律，這可能是由于蛋清液中包含多種蛋白質，其蛋白質在不同熱殺菌溫度下變化有所不同，對n的變化產生影響。

表1 不同熱殺菌溫度的蛋清液表觀黏度擬合參數Table 1 Fitting parameters of apparent viscosity of liquid egg white at sterilization temperatures

2.4 熱殺菌期間蛋白酶改性對蛋清液粒徑分布的影響

如圖4所示，不同熱處理下未改性和酶改性蛋清液的粒徑分布呈現出明顯差異。隨著熱殺菌溫度不斷升高，蛋清液的粒徑鋒正向移動，平均粒徑逐漸增大。酶改性蛋清液的粒徑分布更加接近正態分布，表現出單一的鋒。根據Wang Baoli等[28]的研究發現，樣品較小的粒徑可以降低顆粒在熱應力下的聚集程度，從而提高蛋清蛋白顆粒的熱穩定性。相比之下，未改性蛋清液的粒徑分布更加分散，呈現雙峰，且大粒徑顆粒所占比例更大。而隨著熱殺菌溫度的升高，粒徑大小逐漸增大，這可能是因為加熱導致蛋白質的熱聚集，所以粒徑有所增加[29]。

圖4 不同熱殺菌溫度下蛋清液的粒徑分布Fig.4 Particle size distribution of egg white liquid under different heat sterilization temperatures

2.5 熱殺菌期間酶改性對蛋清液表面疏水性的影響

如圖5所示，蛋清液的表面疏水性隨著溫度的升高，呈現先升高后降低的趨勢，當蛋白質內部的疏水基團暴露時，蛋清液的疏水性提高。在同一熱殺菌溫度條件下，酶改性蛋清液的表面疏水性顯著高于未改性蛋清液（P＜0.05）。在25 ℃時，酶改性蛋清液的表面疏水性顯著高于未改性蛋清液（P＜0.05），原因可能是酶改性促進了蛋白質的色氨酸殘基、酪氨酸殘基等疏水性基團的暴露，提高其表面疏水性。從蛋清液粒徑分布可以看出酶改性改變蛋白質分子的聚集和分散，影響疏水基團的暴露情況，從而改變蛋清液的疏水性。與未改性蛋清液相比，酶改性使蛋清液蛋白的表面疏水性顯著降低（P＜0.05）。熱殺菌溫度達到68 ℃時，未改性蛋清液和酶改性蛋清液的表面疏水性均達到最大值，分別為600.68±6.22和809.90±4.01。根據王晨等[30]研究，蛋白酶酶解處理可能會使蛋清蛋白內部的疏水基團暴露，從而導致蛋白表面疏水性的增加。而過高的熱殺菌溫度使蛋白分子重新聚合，疏水基團被掩埋，表面疏水性降低[31]。

圖5 熱殺菌期間酶改性對蛋清液表面疏水性的影響Fig.5 Effect of enzymatic modification on the surface hydrophobicity of liquid egg white during heat sterilization

2.6 SDS-PAGE分析

蛋清蛋白主要成分為卵黏蛋白（28 kDa）、卵清蛋白（45 kDa）、卵轉鐵蛋白（78 kDa）和溶菌酶（14.3 kDa）[32]。以未改性25 ℃（泳道6）為對照，結果如圖6所示，未改性蛋清液的條帶顏色因為熱殺菌溫度升高而變化最大，酶改性蛋清液的蛋白大部分為小分子蛋白，酶改性72 ℃的蛋清液（泳道5）在卵黏蛋白處的條帶變深，而未改性62 ℃的蛋清液（泳道8）在卵轉鐵蛋白和卵清蛋白處的條帶變深，開始出現蛋白聚集物，且隨著熱殺菌溫度的升高，蛋白聚集物越多。這說明酶改性使蛋清中高分子質量的蛋白水解，且熱殺菌處理后，酶改性蛋清液的高分子質量條帶顏色依然較淺，說明熱處理酶改性蛋清液形成的大分子顆粒較少，抑制了蛋清液蛋白的熱聚集，從而改善了蛋清液的耐熱性。更小的粒徑大小與分布很好地佐證了這一結果。當泳道顏色變淺時，表明蛋白質聚集體已被β-巰基乙醇和SDS分解，酶改性促進了疏水相互作用和巰基二硫鍵交換的反應，從而增強了疏水相互作用并斷裂二硫鍵。當蛋清蛋白質被蛋白酶水解后，蛋白質中的自由氨基和巰基減少，與考馬斯亮藍發生顯色反應的基團減少，從而使條帶變淺或不顯色。

圖6 不同熱殺菌溫度下酶改性與未改性蛋清液SDS-PAGE圖像Fig.6 SDS-PAGE images of enzyme-modified and unmodified liquid egg white at different sterilization temperatures

2.7 熱殺菌期間酶改性對蛋清結構的影響

如圖7所示，未改性25 ℃的蛋清樣品顆粒尺寸較大，這些顆粒之間有些黏連在一起，導致總體呈現不規則且不均勻的分布。隨著熱殺菌溫度的升高，未改性蛋清蛋白顆粒數量明顯減少，且分布更加松散。酶改性25 ℃的蛋清樣品微觀顆粒的表面孔洞和縫隙增多，經過熱殺菌處理后，顆粒表面出現黏連，其顆粒數量減少。與未改性蛋清樣品的SEM圖像進行對比，在同一熱殺菌溫度下，酶改性蛋清蛋白的顆粒數量多于未改性蛋清蛋白。

SEM圖像表明酶改性處理可以改善蛋清蛋白的熱聚集，酶改性后蛋清粉的顆粒結構被破壞并分裂成大量碎片，產生不規則的孔狀結構，出現一定程度的片狀凸起，顆粒大小也變得更小。由于熱殺菌處理使蛋清蛋白發生熱聚集，經過離心后凍干的不同蛋清樣品SEM圖像也不同，其結果與上述蛋清上清液蛋白含量的結果一致。酶改性處理可使結構緊密的蛋白質分子展開，并暴露活性殘基，經過熱殺菌處理仍保留較多的蛋清蛋白，表明酶改性處理改善了蛋清的耐熱性。

2.8 FTIR分析

2.8.1 圖譜分析

紅外光譜學可以通過多肽鏈的主干吸收紅外輻射，從而激發其組成酰胺鍵的振動模式[33]。其中，酰胺I帶是在1 700～1 600 cm-1范圍內出現的振動帶[34]，它的振動主要是由羰基（C＝O）雙鍵導致，是分析蛋白質二級結構的重要帶位。如圖8所示，處理前后的蛋清液蛋白紅外圖譜并無明顯變化，但在酰胺I帶處，未改性蛋清組中峰值由1 652.63 cm-1處偏移到1 622.37 cm-1處，酶改性蛋清組的峰值位于1 657.41 cm-1處，酶改性使得蛋白質的酰胺I帶向高波數偏移，熱殺菌處理使蛋白質的酰胺I帶向低波數偏移，偏移到1 636.85 cm-1處。通過氫鍵的斷裂，可以提高化學鍵的力常數，從而吸收頻率移向高波數方向。因此，蛋白酶改性處理可能會導致蛋白質分子結構展開，并改變官能團。

圖8 熱殺菌期間酶改性對蛋清蛋白紅外光譜的影響Fig.8 Effect of enzymatic modification on the infrared spectrum of egg white proteins during heat sterilization

2.8.2 酰胺I帶的反卷積和曲線擬合

為進一步了解酶改性對蛋清蛋白質的影響，對不同處理的蛋清蛋白的二級結構進行測定。結果表明，蛋白質改性后，C＝O數量以及C＝O和N—H之間的氫鍵都發生了變化。

蛋清蛋白質二級結構含量變化情況如表2 所示，蛋清蛋白二級結構組成為α-螺旋35.74%、β-折疊28.45%、β-轉角25.71%、無規卷曲10.10%。這與康鵬等[35]的研究結果基本一致。熱處理使未改性和酶改性蛋清液中蛋白質二級結構發生變化。未改性蛋清蛋白二級結構中β-折疊、β-轉角結構的相對含量變化不規律，無規卷曲結構的相對含量隨溫度的升高不斷增大，在72 ℃時無規卷曲結構相對含量達到13.28%，而α-螺旋相對含量先增大后減小，超過68 ℃后α-螺旋相對含量顯著升高（P＜0.05）。酶改性后蛋清液α-螺旋和β-折疊結構在68 ℃條件下相對含量分別為最高和最低，使得蛋白同時具有穩定性和靈活性，在此時酶改性蛋清液α-螺旋結構相對含量顯著高于未改性蛋清液（P＜0.05），無規卷曲結構相對含量明顯低于未改性蛋清液，且酶改性后蛋清液二級結構相對含量的變化幅度明顯小于未改性蛋清液，這說明酶改性改變了蛋清液蛋白質內的氫鍵，適當熱處理對蛋白質的有序性有促進作用。

表2 熱殺菌期間酶改性對蛋清蛋白質二級結構相對含量的影響Table 2 Effect of enzymatic modification on the relative contents of secondary structures of egg white protein during heat sterilization%

3 結論

本研究通過胰蛋白酶對蛋清液進行改性，探究熱殺菌期間胰蛋白酶對蛋清液耐熱性和結構特性的影響。結果顯示，蛋白酶改性處理使蛋清液濁度顯著降低（P＜0.05），與未改性蛋清液相比，改性后的上清液蛋白含量無顯著差異（P＞0.05）。在熱殺菌過程中，酶改性蛋清液濁度顯著低于未改性蛋清液，其上清液蛋白含量顯著高于未改性蛋清液（P＜0.05），證明蛋白酶改性是一種改善蛋清液耐熱性的有效方法。通過分析表觀黏度、表面疏水性發現，酶改性蛋清液在熱殺菌過程中蛋白質表觀黏度逐漸升高，表面疏水性呈現先上升后下降的趨勢。在同一熱殺菌溫度下，酶改性蛋清液的表觀黏度顯著低于未改性蛋清液，表面疏水性顯著高于未改性蛋清液（P＜0.05）。FTIR結果顯示，酶改性處理可以使蛋白酰胺I帶向高波數偏移，蛋白質二級結構的結果顯示熱殺菌溫度低于68 ℃時，酶改性蛋清液蛋白質的α-螺旋相對含量顯著高于未改性蛋清液，無規卷曲結構相對含量顯著低于未改性蛋清液（P＜0.05）。酶改性蛋清液的粒徑分布趨于正態分布，在同一熱殺菌溫度下，其粒徑顯著小于未改性蛋清液（P＜0.05）。SDS-PAGE結果表明蛋白酶改性能抑制蛋白熱聚集。酶改性25 ℃的蛋清液顆粒的表面孔洞和縫隙增多，經過熱殺菌處理后，其顆粒數量減少。在同一熱殺菌溫度下，酶改性蛋清蛋白的顆粒數量多于未改性蛋清蛋白。因此，在熱殺菌過程中，胰蛋白酶對蛋清液有積極作用，可有效改善蛋清蛋白的熱聚集，提高蛋清液的耐熱性，對擴大其銷售半徑有重要意義。