光甘草定/羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的釋放特性、黏液滲透性及細(xì)胞攝取

李德鋒，樊金玲，姚培培，任國艷，杜 琳，張曉宇

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023）

光甘草定（glabridin，GLD）是光果甘草特有的異黃烷類化合物，具有多種生物活性，如抗炎、抗氧化、抗腫瘤、降血糖、神經(jīng)保護(hù)等[1-5]。但是，GLD的生物利用度很低[6-7]，無法在體內(nèi)充分發(fā)揮其功能，從而很大程度上制約了GLD的應(yīng)用。

溶解度低是GLD 生物利用度低的一個主要原因。小腸上皮細(xì)胞主要以被動擴(kuò)散的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)方式攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)GLD[7]，而被動擴(kuò)散是由小腸上皮細(xì)胞腸腔內(nèi)消化液中高藥物濃度驅(qū)動。GLD的水溶性極低（在25 ℃水中溶解度約7 μg/mL[8]），造成口服利用時在腸腔中的濃度很小，嚴(yán)重影響它的小腸吸收率。透過腸上皮細(xì)胞的滲透性差是影響GLD 生物利用度的另一重要原因。Ito等[6]報道了10 μmol/LGLD 透過Caco-2 細(xì)胞單層模的Papp僅為（1.70±0.16）×10-5cm/s，為低滲透性分子。此外，人體腸道上皮表面存在著由水和黏蛋白為主要成分的黏液層，是影響很多營養(yǎng)成分或藥物吸收的重要物理屏障[9]。迄今為止，尚缺少有關(guān)GLD對黏液層的滲透性研究。

環(huán)糊精（cyclodextrin，CD）具有外親水、內(nèi)疏水的獨(dú)特籠狀結(jié)構(gòu)，能夠通過靜電相互作用、氫鍵和范德華力等非共價力與多種化合物相互作用，尤其是疏水性化合物，疏水性化合物被包合在CD的空腔中，形成主-客體包合物，從而使難溶性化合物的溶解度得到提高[6,10-12]。研究表明：某些黃酮的CD包合物可促進(jìn)黃酮化合物的口服吸收，提高其生物利用度[11]，可能途徑及機(jī)制有：1）改善難溶性黃酮化合物的溶出動力學(xué)，提高其瞬時飽和溶解度[10]；2）增強(qiáng)親脂性黃酮化合物透過黏液層的能力，提高腸壁藥物濃度[12]；3）增加黃酮化合物的細(xì)胞膜滲透性等[13]。

本團(tuán)隊的前期研究表明：多種CD 對GLD 均有很好的包合作用[14]。本實(shí)驗選用羥丙基-β-環(huán)糊精（hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HP-β-CD）包合GLD，采用冷凍干燥法制備了GLD/HP-β-CD包合物，旨在提高GLD在水中的溶解度；通過掃描電鏡（scanning electron microscopy，SEM）、差示掃描量熱法（differential scanning calorimetry，DSC）、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）法和分子對接技術(shù)分別對包合物的表面狀態(tài)、GLD的存在形式、GLD與HP-β-CD的相互作用及空間構(gòu)象進(jìn)行了分析；采用體外實(shí)驗研究GLD被包合前后在胃、腸液中的溶出和釋放特性，利用Transwell小室法研究了包合前后GLD在黏液層中的滲透性；采用Caco-2細(xì)胞研究了包合對小腸攝取GLD的影響。研究探討載體HP-β-CD對GLD吸收的影響及可能機(jī)制，以期為進(jìn)一步推動GLD在功能食品、膳食補(bǔ)充劑等領(lǐng)域中的應(yīng)用提供實(shí)驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

GLD 洛陽藍(lán)斯利科技有限公司；0.45 μm濾膜日本Millipore公司；HP-β-CD（6位羥基取代，取代度為5.8～7.5）湖北恒碩化工有限公司；MTT上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、石油醚、氯化鈉、乙腈、鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、冰醋酸、二甲基亞砜、吐溫-80 天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；溴化鉀 上海網(wǎng)化化工科技有限公司；Transwell-24孔板 美國康寧有限公司；鋁坩堝 上海菁儀化工材料有限公司；再生纖維素透析袋（800～1 000 Da）上海吉至生化科技有限公司；黏液素II 上海臻科生物科技有限公司；BCA蛋白質(zhì)試劑盒 上海鈺博生物科技有限公司；MEM培養(yǎng)基、雙抗 美國Hyclone公司；胎牛血清 美國Gibco公司；胰酶（含酚紅）德國Merck公司；Caco-2細(xì)胞 美國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 儀器與設(shè)備

L5S紫外分光光度計 浙江恒岳儀器有限公司；TENSPOR27 FTIR光譜儀 德國Bruker公司；SCIENTZ-10N冷凍干燥機(jī) 西安蔚然電子科技有限公司；DSC1型DSC儀上海胥元機(jī)械有限公司；EClassical 3100高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀蘇州格雷弗工業(yè)裝備有限公司；SEM 北京鉑瑞達(dá)科技有限公司；DF-101S水浴加熱磁力攪拌器 濟(jì)南歐萊博生物科技有限公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器杭州微米派科技有限公司；SW-CJ-2FD雙人單面超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；CQT-191IR恒溫培養(yǎng)箱 上海金畔生物科技有限公司；RS-232C酶標(biāo)儀美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 GLD/HP-β-CD包合物的制備

按物質(zhì)的量比1∶1分別稱取適量的GLD和HP-β-CD，然后用乙醇將其配成質(zhì)量濃度為30 mg/mL的GLD溶液；用去離子水將其配成濃度為0.04 mol/L的HP-β-CD溶液。將兩種溶液混合，并在25 ℃、200 r/min條件下持續(xù)振蕩24 h。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（45 ℃）中除去所得溶液中所含有的乙醇，之后在-20 ℃的環(huán)境中預(yù)凍12 h。最后在冷凍干燥機(jī)中凍干，將凍干后的樣品過80 目篩，即得到所需包合物。

1.3.2 GLD/HP-β-CD包合物的飽和溶解度、包合率和載藥率的測定

1.3.2.1 飽和溶解度

在室溫條件下（25 ℃）借助超聲，使GLD/HP-β-CD包合物在1 mL水中溶解至平衡狀態(tài)。溶液過0.45 μm濾膜后，其濾液用80%乙醇溶液進(jìn)行稀釋。在281 nm波長處測定吸光度，并根據(jù)得到的吸光度計算溶液中GLD的含量，即為飽和溶解度。

1.3.2.2 包合率和載藥率

參照文獻(xiàn)[15-17]。分別稱取兩份質(zhì)量均為10 mg的GLD/HP-β-CD包合物。其中一份先用1 mL去離子水溶解，加入9 mL乙腈，將其在25 ℃條件下，經(jīng)超聲處理20 min。5 000 r/min離心5 min后，將上清液收集到新離心管中，用乙腈稀釋10 倍。在281 nm波長處測定其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出溶液中GLD的質(zhì)量，即為包合物樣品中GLD的總質(zhì)量。另一份包合物用石油醚（400 μL）溶解，離心后棄掉上清液（除去未被包合的GLD）；重復(fù)操作兩次；在通風(fēng)櫥中，使樣品中的石油醚揮發(fā)；按上述包合物樣品中GLD總質(zhì)量的測定步驟對此樣品中的GLD質(zhì)量進(jìn)行測定，即被包合的GLD質(zhì)量。按照下式計算包合率和載藥率：

1.3.3 GLD/HP-β-CD固體包合物的結(jié)構(gòu)表征

1.3.3.1 SEM

將GLD、HP-β-CD、GLD與HP-β-CD的物理混合物（以物質(zhì)的量比1∶1均勻混合）及GLD/HP-β-CD包合物用導(dǎo)電的雙面膠固定在樣品臺上，并噴鍍鉑金，在3 kW條件下觀察各樣品的表面形態(tài)。

1.3.3.2 DSC分析

分別稱取5 mg的GLD、HP-β-CD、GLD與HP-β-CD的物理混合物（以物質(zhì)的量比1∶1均勻混合）及GLD/HPβ-CD包合物進(jìn)行DSC的測定。其氮?dú)饬髁繛?0 mL/min，溫度掃描的范圍設(shè)定在25～300 ℃，升溫速率設(shè)為10 ℃/min，并以空盤作空白對比，記錄每個樣品的DSC曲線。

1.3.3.3 FTIR光譜法

將適量的GLD、HP-β-CD、GLD與HP-β-CD的物理混合物（以物質(zhì)的量比1∶1均勻混合）及GLD/HP-β-CD包合物分別與溴化鉀粉末以質(zhì)量比1∶100均勻混合，然后在研缽中充分研磨，壓片制得樣品薄片。利用FTIR檢測樣品時，背景單通道掃描的樣品是純溴化鉀粉末。掃描范圍設(shè)定為400～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描32 次。

1.3.3.4 分子對接

β-CD模型文件在劍橋晶體數(shù)據(jù)庫（https://ccdc.cam.ac.uk/）中下載，其編號為1107194，去H2O后，利用Gauss View軟件將7 個葡萄糖單元中的6 位羥基氫用羥丙基進(jìn)行替換，取代度為7；再通過Gaussian 09軟件中半經(jīng)驗算法的PM6基組，對幾何構(gòu)型進(jìn)行優(yōu)化，得到HP-β-CD模型；GLD 3D模型文件在PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載，其CID編號為124052，利用Gaussian 09軟件中的DFT方法（B3LYP/6-31G）對3D模型進(jìn)行優(yōu)化，再通過Open Babel GUI軟件將優(yōu)化后的文件格式轉(zhuǎn)化為pdb格式。

采用Auto Dock Tools 4.2軟件對受體（HP-β-CD）與配體（GLD）分別處理，添加原子電荷和H原子，并在GLD分子內(nèi)設(shè)置可旋轉(zhuǎn)單鍵數(shù)量及根原子，處理好的受體和配體保存為pdbqt文件格式。對接方法采用半柔性對接。分子對接時，以對接盒子的中心點(diǎn)為受體幾何中心，并且盒子的尺寸設(shè)置為60 ?×60 ?×60 ?。搜索參數(shù)選用拉馬克遺傳基因算法、算法對接輪數(shù)設(shè)為100、能量評估的最大數(shù)目設(shè)為250 000，其他參數(shù)取默認(rèn)值。

1.3.4 GLD/HP-β-CD包合物在胃腸液中的溶出

β-CD在胃及小腸部分不被人體消化酶作用[18]。按照Maltais等[19]的方法配制不含消化酶的模擬胃、腸液。用100 mL去離子水將準(zhǔn)確稱取的NaCl（2.0 g）溶解在燒杯中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1.2，即為模擬胃液。用250 mL去離子水將準(zhǔn)確稱取的KH2PO4（6.8 g）也溶解在燒杯中，用0.2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.9，即為模擬腸液。量取出900 mL胃液或腸液，將其放置于1 000 mL燒杯內(nèi)，作為溶出介質(zhì)。在水浴加熱方式的磁力攪拌器中進(jìn)行攪拌，其水溫保持（37±0.5）℃，攪拌的轉(zhuǎn)速保持50 r/min。稱取一定量的GLD、GLD與HP-β-CD的物理混合物及GLD/HP-β-CD樣品（GLD含量為100 mg），分別加入燒杯中，并立即開始計時；分別在2、4、6、8、10、15、20、30、45、60 min時吸取1 mL溶出液，同時添加等量新鮮的溶出介質(zhì)。取出的樣液過0.45 μm的微孔濾膜后，取0.5 mL的濾液，并向其中加入4.5 mL乙腈，充分混勻后，在5 000 r/min離心5 min，取上清液，在281 nm波長處測定吸光度，按下式計算溶出率：

式中：A為某一時間點(diǎn)每1 mL 樣液中溶出的GLD質(zhì)量/μg；B為之前所有時間點(diǎn)取出的1 mL液體中GLD質(zhì)量/μg。

1.3.5 GLD/HP-β-CD包合物在胃腸液中的釋放

1.3.5.1 透析袋預(yù)處理

將透析袋（800～1 000 Da）剪成8～10 cm小段，去離子水清洗后方可使用。

1.3.5.2 釋放介質(zhì)的配制

按照1.3.4節(jié)所述配制模擬胃、腸液。在模擬胃、腸液中分別加入一定量吐溫-80（體積分?jǐn)?shù)2%）作為胃、腸液釋放介質(zhì)，其中吐溫-80用于促進(jìn)GLD在介質(zhì)中溶解。

1.3.5.3 HPLC法測定GLD含量

采用EClassical 3100 HPLC系統(tǒng)測定GLD的含量；色譜條件：色譜柱ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 nm，1.7 μm）；流動相：A為水（含1%冰醋酸），B為乙腈，采用A∶B=40∶60進(jìn)行等度洗脫；柱溫30 ℃；流速1 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；檢測波長281 nm。GLD 質(zhì)量濃度0～100 ng/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.164 92x＋0.117 58。

1.3.5.4 釋放實(shí)驗

燒杯中加300 mL胃液釋放介質(zhì)（含2%吐溫-80的模擬胃液）；精確稱取一定量GLD/HP-β-CD樣品，將其溶于去離子水中，使GLD質(zhì)量濃度均為2 mg/mL。分別取3 mL樣品液放入預(yù)處理過的透析袋中，用夾子夾緊兩端，放入燒杯中，保證透析袋完全浸沒在釋放介質(zhì)中。將燒杯放入37 ℃水浴鍋中，每間隔一段時間（0.5、1、2 h）從燒杯中取出1 mL袋外溶液，同時補(bǔ)充1 mL新鮮的胃液釋放介質(zhì)。2 h后，將燒杯中的釋放介質(zhì)更換為腸液釋放介質(zhì)，同樣每間隔一段時間（4、7、16、20、24 h），從燒杯中取出1 mL袋外溶液，同時補(bǔ)充1 mL新鮮的腸液釋放介質(zhì)。

將上述不同時間段取出的1 mL釋放介質(zhì)于冷凍干燥機(jī)中凍干。加入0.2 mL乙腈進(jìn)行復(fù)溶，0.45 μm濾膜過濾，采用HPLC測定GLD的濃度（色譜條件見1.3.5.3節(jié)）。計算1 mL釋放介質(zhì)中GLD的質(zhì)量，并按下式計算累積釋放率：

式中：A為某一時間點(diǎn)每1 mL樣液中釋放的GLD質(zhì)量/μg；B為之前所有時間點(diǎn)取出的1 mL液體中釋放出的GLD質(zhì)量/μg。

1.3.6 GLD/HP-β-CD包合物在黏液層的滲透性

1.3.6.1 黏液的配制

配制pH 7.4的緩沖溶液，然后稱取一定量的黏蛋白，將其溶接在pH 7.4的緩沖溶液中，配成一定濃度的黏蛋白溶液。

1.3.6.2 黏液滲透實(shí)驗（Transwell小室擴(kuò)散法）

利用24 孔Transwell小室研究不同GLD-樣品在黏液層中的擴(kuò)散行為，該裝置包含一個供體室和受體室，同時中間有個聚碳酸酯半透膜，它能允許粒子穿過但黏液不能滲透通過。Transwell小室在使用前，供體室和受體室中均加入pH 7.4的磷酸緩沖液，平衡30 min。將40 μL的黏蛋白溶液加入到供體室的半透膜上，受體室加入1 000 μL的磷酸緩沖液，上室分別加入200 μL相同質(zhì)量濃度的1 mg/mL的GLD/DMSO或者GLD/HP-β-CD溶液，將裝置至于37 ℃轉(zhuǎn)速為100 r/min的搖床上培養(yǎng)6 h，于1、2、3、4、5、6 h時，從受體室取出0.15 mL，并向室中加入等量的預(yù)熱緩沖液。

1.3.6.3 GLD含量測定

GLD/DMSO組的樣品取出后于冷凍干燥機(jī)中凍干，后加入200 μL乙腈復(fù)溶，0.45 μm濾膜過濾，采用HPLC法檢測其中GLD的含量，HPLC法的條件見1.3.5.3節(jié)；GLD/HP-β-CD組的樣品取出后可直接用紫外分光光度計檢測其吸光度并計算其中GLD的含量。

1.3.6.4 表觀滲透系數(shù)

黏液滲透結(jié)果用表觀滲透系數(shù)（Papp）表示，計算公式如下：

式中：dQ/dt為受體室在單位時間獲得的藥物量/（μg/（mL·s））；A為Transwell的膜表面積/cm2；C0為藥物的初始質(zhì)量濃度/（μg/mL）。

1.3.6.5 GLD與黏蛋白的分子對接

應(yīng)用AutoDock Tools 4.2軟件將黏蛋白（MUC2）與GLD進(jìn)行分子對接。GLD分子模型的建立參照1.3.3.4節(jié)；從PDB數(shù)據(jù)庫中得到了單體MUC2（MUC2-1）（PDB ID：6TM6）和四聚體MUC2（MUC2-4）（PDB ID：6RBF），采用Auto Dock Tools 4.2工具對上述蛋白受體和配體進(jìn)行常規(guī)處理，再用其Autogrid模塊得到對接活性位點(diǎn)，然后開始進(jìn)行分子對接，得到結(jié)合能，探討GLD與兩種MUC2之間的親和力。并利用PyMOL和Discovery Studio 4.5軟件對分子對接進(jìn)行可視化分析。

1.3.7 Caco-2細(xì)胞對GLD的攝取

1.3.7.1 樣品準(zhǔn)備

用DMSO溶解GLD，并將其配制成32.44 mg/mL的母液，然后用MEM培養(yǎng)基稀釋為不同濃度的樣品（DMSO體積分?jǐn)?shù)0.1%），其濃度分別為10、30、50、70、90、100 μmol/L，記為GLD/DMSO組；用MEM培養(yǎng)基溶解GLD，并配制成濃度梯度同GLD/DMSO組的溶液，記為GLD/H2O組。用MEM培養(yǎng)基復(fù)溶GLD/HP-β-CD包合物，并配制成濃度梯度也同GLD/DMSO組的溶液，記為GLD/HP-β-CD組。

1.3.7.2 樣品對Caco-2細(xì)胞的細(xì)胞毒作用

采用MTT法測定不同濃度樣品對Caco-2細(xì)胞增殖的抑制作用，用于確定Caco-2細(xì)胞攝取實(shí)驗中GLD的安全使用濃度。在37 ℃、5% CO2氣體的恒溫培養(yǎng)箱中，將Caco-2細(xì)胞在含20%胎牛血清、100 U/mL雙抗的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至80%（鋪滿瓶底）。用胰酶消化8 min后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個/mL，將其接種在96 孔板中，每孔200 μL，培養(yǎng)24 h。棄去舊培養(yǎng)基，加入200 μL新鮮培養(yǎng)基或樣品液，作用4 h。結(jié)束后，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗2 次，每孔加入200 μL的新鮮培養(yǎng)基和10 μL的MTT，繼續(xù)作用4 h。棄去培養(yǎng)基，添加150 μL DMSO溶液，10 min后，用酶標(biāo)儀于波長550 nm處測定各孔吸光度。未添加MTT的孔記為A0，添加等體積培養(yǎng)基的孔記為A1，添加MTT的樣品孔記為A2，每個樣品6 個平行孔，根據(jù)下式計算細(xì)胞存活率：

1.3.7.3 細(xì)胞攝取實(shí)驗

取對數(shù)生長期的Caco-2細(xì)胞進(jìn)行消化，計數(shù)后以2.5×105個/mL接種在6 孔板內(nèi)，每孔加入2 mL細(xì)胞懸液，在37 ℃、5% CO2氣體的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細(xì)胞融合至80%～90%后（鋪滿瓶底），去除舊培養(yǎng)基，分別加入50 μmol/L的樣品液，每孔2 mL。培養(yǎng)4 h后吸出培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗滌2 次（以下步驟均在4 ℃條件下進(jìn)行），加入0.5 mL胰酶消化8 min，加1 mL MEM培養(yǎng)基中止消化；收集細(xì)胞至2 mL的離心管內(nèi)，1 500 r/min離心3 min，去除上清液；加入1 mL預(yù)冷的去離子水重懸細(xì)胞，超聲粉碎（功率350 W，工作3 s，停10 s，工作30 次，超聲儀提前用冰塊降溫至4 ℃）；隨后高速冷凍離心機(jī)離心（10 000 r/min，10 min，4 ℃），吸取上清液0.9 mL用于后續(xù)實(shí)驗。

其中，先取上述0.9 mL上清液中的0.8 mL放離心管中于冷凍干燥機(jī)中凍干。凍干后，GLD/H2O、GLD/DMSO組樣品加入0.2 mL乙腈進(jìn)行復(fù)溶；GLD/HP-β-CD組樣品先加入20 μL去離子水，后加入0.18 mL乙腈進(jìn)行復(fù)溶；復(fù)溶后樣品用0.45 μm濾膜過濾，采用HPLC法測定上清液中的GLD濃度（色譜條件見1.3.5.3節(jié)）。

同時，再取上述0.9 mL上清液中的20 μL，采用4,4′-二羧基-2,2-聯(lián)喹啉法（bicinchoninic acid，BCA法）進(jìn)行細(xì)胞蛋白含量的測定。

1.3.7.4 BCA法測定細(xì)胞蛋白含量

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品（1 mg/mL）按0、20、40、60、80、120、160、200 μL的梯度分別加入到1.5 mL離心管中，添加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，使最終每管體積為200 μL，且標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度依次為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL。將上述標(biāo)準(zhǔn)品按其質(zhì)量濃度梯度依次加入96 孔板中，每孔20 μL，且每孔3 個平行，再向各孔中加入200 μL的BCA溶液，在37 ℃烘箱中反應(yīng)30 min，最后在酶標(biāo)儀562 nm測定每孔的吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)為吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.614 7x＋0.013 3。

細(xì)胞蛋白含量的測定：在96 孔板中加入樣品，每孔20 μL，每個樣品3 個平行孔，每孔再加入200 μL的BCA溶液，在37 ℃烘箱中反應(yīng)30 min，在562 nm波長處測定各孔的吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可得細(xì)胞中蛋白質(zhì)的含量。

1.3.7.5 細(xì)胞攝取量計算

根據(jù)下式計算細(xì)胞的攝取量：

式中：CGLD為細(xì)胞內(nèi)GLD的質(zhì)量濃度/（μg/mL）；Cprotein為細(xì)胞懸液中蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖像處理

2 結(jié)果與分析

2.1 GLD/HP-β-CD的制備及結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 GLD/HP-β-CD的制備

經(jīng)冷凍干燥法制備的GLD/HP-β-CD包合物如圖1所示，GLD/HP-β-CD的包合率、載藥率和飽和溶解度見表1，其包合率和載藥率分別為90.03%、14.51%，載體HP-β-CD能使GLD在水中的飽和溶解度顯著提高至109.36 mg/mL。Wei Yongqin等[8]研究表明GLD在25 ℃水中溶解度約7 μg/mL。與此相比，GLD經(jīng)HP-β-CD包合后其在水中的溶解度提高了15 622 倍。已有研究表明，通過將β-乳球蛋白[20]、卵清蛋白[21]分別與GLD形成復(fù)合物后，可以使GLD在水中的溶解度分別提高至0.231 mg/mL和0.032 mg/mL。而采用HP-β-CD包合GLD，使其在水中的溶解度遠(yuǎn)高于上述研究中的方式。

表1 GLD/HP-β-CD的包合率、載藥率和飽和溶解度Table 1 Encapsulation efficiency,drug loading and saturation solubility of GLD/HP-β-CD

圖1 GLD/HP-β-CD固體包合物Fig.1 Visual appearance of GLD/HP-β-CD solid inclusion complexes

2.1.2 GLD/HP-β-CD的結(jié)構(gòu)表征

2.1.2.1 SEM

利用SEM觀察到GLD、HP-β-CD、GLD與HP-β-CD的物理混合物及GLD/HP-β-CD包合物的外部形貌如圖2所示，GLD呈柱狀晶體結(jié)構(gòu)，輪廓清晰；HP-β-CD呈表面多孔的球形結(jié)構(gòu)[22]；物理混合物中同時觀察到柱狀的GLD和球狀HP-β-CD；GLD/HP-β-CD固體包合物呈邊緣鋒利、形狀不規(guī)則的片狀結(jié)構(gòu)。

圖2 GLD/HP-β-CD的SEM圖像Fig.2 SEM image of GLD/HP-β-CD

2.1.2.2 DSC

如圖3所示，在233 ℃處，發(fā)現(xiàn)到GLD有尖銳的熔融峰，此溫度是該晶體的熔點(diǎn)[23]。在94.08 ℃處，顯示出HP-β-CD具有較寬的吸熱熔融峰，這與HP-β-CD水分損失有關(guān)[24]。在物理混合物的DSC曲線中發(fā)現(xiàn)，其曲線圖是GLD與HP-β-CD吸熱峰的簡單疊加，表明這兩種物質(zhì)僅是簡單的物理混合而彼此之間未發(fā)生相互作用，在物理混合物中GLD仍表現(xiàn)出晶體特征。在GLD/HP-β-CD包合物的DSC曲線中，HP-β-CD在94.08 ℃處的峰偏移至77.62 ℃，并且強(qiáng)度降低，GLD特征吸熱峰則完全消失，這可能是由于藥物分子取代了HP-β-CD空腔內(nèi)的水分子造成[25]。以上結(jié)果表明，在GLD/HP-β-CD包合物中，GLD是以無定形非晶體的形式存在，GLD已被HP-β-CD包合在空腔內(nèi)形成了包合物。

圖3 GLD/HP-β-CD的DSC分析Fig.3 DSC analysis of GLD/HP-β-CD

2.1.2.3 FTIR光譜

如圖4所示，在GLD的光譜中，峰位3 346 cm-1出現(xiàn)一強(qiáng)而寬的峰，為O—H的伸縮振動，1 518、1 464 cm-1為芳香環(huán)C＝C的伸縮振動，2 964、2 920 cm-1為—CH3的吸收峰[20]。HP-β-CD紅外光譜圖，在波數(shù)為3 401 cm-1處有一個由O—H 官能團(tuán)的振動而產(chǎn)生的寬峰，在2 930 cm-1處有一個峰，由O—CH3官能團(tuán)的振動產(chǎn)生；1 156、1 083、1 032 cm-1處各有一個峰，是C—O的振動吸收峰[26]。在物理混合物的光譜中，GLD和HP-β-CD的特征吸收峰依然存在，表明物理混合物只是主客體分子的簡單疊加，GLD和HP-β-CD之間沒有相互作用或僅有微弱的相互作用。GLD/HP-β-CD包合物在波數(shù)為3 385 cm-1處有一個寬峰，該峰應(yīng)由HP-β-CD的3 401 cm-1偏移所至，這可能是由GLD與HP-β-CD分子間氫鍵的相互作用造成[27]；與物理混合物光譜相比，GLD/HP-β-CD包合物在波數(shù)1 518 cm-1和1 464 cm-1處的吸收峰明顯減弱，這可能是由于GLD進(jìn)入到HP-β-CD分子的空腔中從而使其芳香環(huán)C＝C的伸縮振動減弱。

圖4 GLD/HP-β-CD的FTIR分析Fig.4 FTIR analysis of GLD/HP-β-CD

2.1.2.4 分子對接

如圖5所示，GLD分子能夠完整地進(jìn)入到HP-β-CD的空腔內(nèi)，以A環(huán)指向CDs的小口端為最佳構(gòu)象；B環(huán)上C2位的OH氫與HP-β-CD某2 個葡萄糖單元中間的氧之間形成一個氫鍵（鍵長為2.0 ?），氫鍵的形成有助于包合物的穩(wěn)定。GLD與HP-β-CD之間的最佳結(jié)合能為-7.37 kcal/mol，分子間的范德華力為-8.12 kcal/mol，表明GLD與HP-β-CD分子間相互作用的主要作用力是范德華力。

圖5 GLD與HP-β-CD對接的最佳能量構(gòu)象及相互作用圖Fig.5 Optimal energy conformation and interaction of GLD with HP-β-CD investigated by molecular docking

2.2 GLD/HP-β-CD提高GLD的小腸吸收

2.2.1 GLD/HP-β-CD在模擬胃、腸液的溶出特性

難溶性的藥物或生物活性成分的累積溶出率較低，是導(dǎo)致其在體內(nèi)吸收率低、生物利用度差的重要原因之一[28]。因此，可以通過累積溶出率在一定程度預(yù)測難溶性化合物在體內(nèi)的吸收速率和利用程度[29]。本實(shí)驗采用體外模擬實(shí)驗，以模擬胃、腸液為溶出介質(zhì)，將透過0.45 μm微孔濾膜的樣品計為溶出樣品，通過定時取樣測定溶出樣品中的GLD含量，計算累積溶出率、繪制溶出曲線，研究HP-β-CD包合對GLD溶出特性的影響，結(jié)果如圖6所示。在模擬胃液和腸液中，GLD在1 h的累積溶出率分別為4%和5%；物理混合物的溶出率略有提高，1 h時溶出率分別約為9%和8%；GLD/HP-β-CD包合物的溶出率均極顯著提高，1 h時溶出率分別為63%和62%，是未被HP-β-CD包合GLD累積溶出率的15.75、12.4 倍。表明GLD經(jīng)HP-β-CD包合后不僅水溶性顯著提高，在胃、腸液中的溶出速率和累積溶出率也極顯著改善，這是由于GLD與CD上的氫鍵相互作用以及GLD在包合物中的結(jié)晶度減少引起。

圖6 GLD/HP-β-CD在模擬胃液（a）、腸液（b）中的溶出曲線Fig.6 Dissolution curves of GLD/HP-β-CD in simulated gastric (a) and intestinal fluid (b)

2.2.2 GLD/HP-β-CD在模擬胃、腸液的釋放特性

藥物或活性分子從CD載體中游離出來的釋放過程與CD載體藥物的溶解過程同時進(jìn)行。CD與藥物的結(jié)合力很大程度上決定了釋放量，也由此影響了藥物吸收：二者結(jié)合越強(qiáng)，藥物或活性分子越難從載體中釋放，吸收就越少。因此，CD包合通常情況下總能增加藥物的溶解度、改善溶出性質(zhì)，但吸收增加不是必然結(jié)果。因此，越來越多致力于提高藥物吸收的研究更加關(guān)注藥物的釋放過程。

GLD具有溶解度低、腸道滲透性差的特點(diǎn)。根據(jù)BCS分類，為BCS IV類藥物。提高GLD的水溶性、改善其滲透性，是提高其在體內(nèi)吸收利用的關(guān)鍵。本部分采用截留分子質(zhì)量為800～1 000 Da的透析袋體外實(shí)驗方法研究GLD和GLD/HP-β-CD包合物中的GLD在胃液2 h、腸液22 h連續(xù)條件下的釋放過程（由于實(shí)驗初期GLD的釋放量較小，本部分采用HPLC法檢測透過液中的GLD含量），結(jié)果如圖7所示。GLD在20 h時開始檢測到GLD，24 h的累積釋放率為0.32%；GLD與HP-β-CD物理混合物在第16小時開始檢測到GLD，第24小時的累積釋放率為1.33%；GLD/HP-β-CD從1 h開始檢測到GLD，在此后的24 h內(nèi)累積釋放率呈現(xiàn)線性增長趨勢，第24小時達(dá)16.98%，相對未被包合GLD累積釋放率提高約53 倍。這一結(jié)果表明：HP-β-CD包合不僅顯著提高了的GLD溶解度、改善了溶出性質(zhì)，同時包合物中的GLD在腸液中能較好地釋放，預(yù)示著GLD/HP-β-CD可有效提高腸腔中游離GLD分子的濃度。

圖7 GLD/HP-β-CD在胃腸液連續(xù)條件下的釋放曲線Fig.7 Continuous release curve of GLD/HP-β-CD in simulated gastrointestinal fluid

2.2.3 GLD/HP-β-CD在黏液層的滲透性

人體腸道上皮表面存在著一層由水和黏蛋白為主要成分的黏液；黏液不斷地從黏膜表面分泌和脫落，形成一種立體網(wǎng)格狀、且動態(tài)變化的物理屏障，具有清除有害物質(zhì)的作用，但同時也限制了藥物的吸收[9]。本實(shí)驗利用Transwell小室法研究了HP-β-CD包合前后GLD透過黏液層的能力。為考察在溶解狀態(tài)下游離的GLD分子滲透通過黏液層的能力，本實(shí)驗將GLD充分溶解于DMSO后再進(jìn)行Transwell小室的透過實(shí)驗，以排除GLD不溶于水時聚集成大顆粒對實(shí)驗結(jié)果的干擾。結(jié)果表明：采用HPLC法，第4小時接受室開始檢測到GLD，對應(yīng)的累積滲透率僅為0.02%、滲透系數(shù)僅為9.24×10-9cm/s，說明游離的GLD分子幾乎無法滲透黏液層；GLD/HPβ-CD在黏液層中4 h的累積滲透率為32%，滲透系數(shù)為1.43×10-5cm/s，是GLD的1 600 倍（表2）。實(shí)驗進(jìn)一步選用不同質(zhì)量濃度黏蛋白進(jìn)行GLD/HP-β-CD的滲透實(shí)驗，結(jié)果顯示：黏蛋白質(zhì)量濃度越大，GLD/HP-β-CD累積滲透率越小（圖8）。上述研究表明：黏蛋白構(gòu)成的黏液層是GLD到達(dá)腸上皮細(xì)胞的主要屏障，而GLD/HP-β-CD則顯著提高了GLD透過黏液層的能力。

表2 不同樣品在20 mg/mL黏液層中Papp值Table 2 Papp values of GLD/HP-β-CD in 20 mg/mL mucous layer 10-5 cm/s

圖8 黏蛋白質(zhì)量濃度對GLD/HP-β-CD累積滲透率的影響Fig.8 Effects of different concentrations of mucin on the cumulative permeability of GLD/HP-β-CD

為進(jìn)一步探討GLD透過黏液層能力差的原因，采用分子對接技術(shù)研究GLD與腸道黏液層的主要成分MUC2的單體（MUC2-1）和四聚體（MUC2-4）的相互作用，結(jié)果圖9所示。GLD與MUC2-1的結(jié)合位點(diǎn)位于MUC2-1的表面凹陷中，與MUC2-4的結(jié)合位點(diǎn)位于4 個MUC2-1相互接合區(qū)域的凹槽中；與MUC2-1和MUC2-4的結(jié)合能分別為-6.95 kcal/mol和-5.85 kcal/mol，均小于-5.0 kcal/mol，表明GLD與MUC2單體和四聚體均具有較好的親和力[30]。氫鍵、范德華力、π-烷基（疏水作用的一種）是兩分子間的主要作用力。例如：GLD與MUC2-1的CYS-1338等3 個氨基酸殘基形成氫鍵，與ASP-1358等5 個氨酸酸殘基通過范德華力產(chǎn)生相互作用。上述結(jié)果表明：GLD與MUC2分子間存在較強(qiáng)的相互作用，這可能是造成GLD即使溶解在DMSO中，滲透性仍很差的一個重要原因。在GLD/HP-β-CD包合物中，GLD整個分子處于HP-β-CD的疏水空腔中，無法與MUC2產(chǎn)生相互作用；另一方面，由于HP-β-CD表面親水，推測其不能與MUC2發(fā)生較強(qiáng)的相互作用，因此，GLD/HPβ-CD包合物可以順利透過腸黏液層。

圖9 GLD與MUC2分子對接圖Fig.9 Molecular docking diagram of GLD and MUC2

2.2.4 Caco-2細(xì)胞對GLD的攝取

藥物或活性分子被小腸細(xì)胞攝取是其吸收過程的又一重要環(huán)節(jié)；高攝取量通常是高吸收率、高生物利用度的前提和保障。載體可能因改變細(xì)胞膜滲透性而影響藥物的細(xì)胞攝取，進(jìn)而影響吸收。Caco-2細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和生化特性上都與小腸上皮細(xì)胞相似，因此被國內(nèi)外廣泛地用于研究藥物的小腸攝取和吸收[31]。本實(shí)驗采用Caco-2細(xì)胞模擬小腸上皮細(xì)胞，研究了GLD/HP-β-CD包合物對GLD細(xì)胞攝取的影響。

2.2.4.1 細(xì)胞毒性

不同濃度GLD樣品處理Caco-2細(xì)胞4 h，細(xì)胞存活率如圖10所示。在10～50 μmol/L范圍內(nèi)，GLD/H2O、GLD/DMSO及GLD/HP-β-CD處理的細(xì)胞存活率均在85%以上，基本對細(xì)胞無毒副作用[32]。因此，選擇濃度50 μmol/L做3 個樣品后續(xù)的攝取實(shí)驗。

圖10 不同濃度GLD樣品處理的Caco-2細(xì)胞毒性Fig.10 Cytotoxicity of different concentrations of free and encapsulated GLD to Caco-2 cells

2.2.4.2 Caco-2細(xì)胞對GLD的攝取量

50 μmol/L的GLD/H2O、GLD/DMSO及GLD/HP-β-CD孵育Caco-2細(xì)胞4 h后，Caco-2細(xì)胞對樣品中GLD的攝取量如圖11所示。Caco-2細(xì)胞對GLD/H2O組的攝取量最小，為0.039 mg/g；對GLD/DMSO樣品的攝取量顯著高于GLD/H2O組，約為0.113 mg/g，是GLD/H2O組的2.9 倍。GLD/HP-β-CD的細(xì)胞攝取率達(dá)0.349 mg/g，比GLD/H2O組提高了795%，比GLD/DMSO組提高了209%。

圖11 GLD-樣品在4 h對Caco-2細(xì)胞的攝取量Fig.11 Uptake of free and encapsulated GLD by Caco-2 cells at 4 h

對于GLD/H2O和GLD/DMSO樣品，GLD主要以被動擴(kuò)散的方式通過細(xì)胞膜從而被Caco-2細(xì)胞攝取。被動擴(kuò)散方式下，GLD在細(xì)胞膜兩側(cè)的濃度差是推動其進(jìn)入細(xì)胞的主要動力。DMSO提高了GLD的水溶性，因此Caco-2細(xì)胞對GLD/DMSO樣品的攝取量遠(yuǎn)高于GLD/H2O樣品。與GLD/H2O相比，GLD/HP-β-CD可以顯著提高GLD在細(xì)胞培養(yǎng)基中的濃度，因此也可顯著提高被動運(yùn)輸方式下小腸上皮細(xì)胞對GLD的攝取量。而Caco-2細(xì)胞對GLD/HP-β-CD中GLD的攝取量甚至顯著高于GLD/DMSO樣品，表明除被動運(yùn)輸外，還存在其他的攝取方式，如通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞從而提高細(xì)胞的攝取量。

3 結(jié)論

制備GLD/HP-β-CD固體包合物，GLD/HP-β-CD中GLD的包合率和載藥率分別為90.03%、14.51%，載體HP-β-CD能使GLD在水中的飽和溶解度顯著提高至109.36 mg/mL。SEM結(jié)果顯示GLD/HP-β-CD固體包合物呈形狀不規(guī)則的片狀。DSC結(jié)果顯示GLD/HP-β-CD包合物中GLD以無定形非晶體結(jié)構(gòu)存在；FTIR及DSC充分證明了HP-β-CD已將GLD包合在空腔內(nèi)形成了包合物。分子對接顯示GLD與HP-β-CD之間的最佳結(jié)合能為-7.37 kcal/mol，GLD分子能夠完整地進(jìn)入到HP-β-CD的空腔內(nèi)，GLD與HP-β-CD分子間形成1 個氫鍵，GLD與HP-β-CD分子間的相互作用主要靠范德華力維持。GLD/HP-β-CD顯著改善了GLD在模擬胃、腸液的溶出速率和累積溶出率，顯著提高了在模擬胃、腸液中游離的GLD濃度，極大程度地提高了GLD透過腸上皮表面黏液層的能力，并顯著提高小腸上皮細(xì)胞對GLD的攝取量。以上研究結(jié)果表明：GLD/HP-β-CD具有提高GLD吸收、改善GLD生物利用度的潛力。