超聲輔助酶法提取咖啡果皮白藜蘆醇工藝優(yōu)化及其體外抗氧化活性

李學玲，龍婷，楊莉，樊竹青，陳云蘭，郭永斌

（1.普洱學院 茶葉咖啡學院，云南 普洱 665000；2.云南師范大學 化學化工學院，云南 昆明 650500；3.普洱學院 生物與化學學院，云南 普洱 665000；4.云南農(nóng)業(yè)大學 熱帶作物學院，云南 普洱 665000；5.云南三正技術檢測有限公司，云南 昆明 650106）

咖啡是茜草科常綠灌木或小喬木植物，其產(chǎn)量、銷售量、消費量均居世界三大飲料植物之首[1]，具有提神醒腦、預防糖尿病、肝硬化與肝癌等作用[2]。咖啡鮮果分咖啡豆和咖啡果皮兩部分，其中咖啡果皮含有原花青素和花青素等，具有抗氧化、抗癌、清除自由基等生理活性[3]。云南的保山、普洱、瀾滄和德宏的咖啡產(chǎn)量占全國咖啡產(chǎn)量的99%[4]，咖啡果皮占成熟鮮果的43%～50%[5]，隨著咖啡飲品越來越受歡迎，普洱咖啡產(chǎn)量越來越多，咖啡果皮量隨之增加。但目前大部分咖啡果皮均被廢棄未能合理開發(fā)利用，出現(xiàn)了資源浪費和環(huán)境污染等問題，且目前關于咖啡果皮的研究應用較少。沈曉靜等[6]研究了不同海拔高度云南小粒咖啡生豆的抗氧化，發(fā)現(xiàn)不同海拔高度下云南小粒咖啡均具一定的抗氧化活性。劉亞玲等[7]分析了咖啡豆中咖啡類黑精的化學組成，表明咖啡豆的蛋白質(zhì)和粗脂肪含量隨烘焙程度加深而增加，總氨基酸含量則降低。王彥兵等[8]采用超聲波輔助法結合響應面優(yōu)化了咖啡果皮總黃酮的最佳提取條件和體外抗氧化活性，研究表明咖啡果皮可作為一種天然抗氧化劑來源。

白藜蘆醇主要存在于虎杖[9]、葡萄[10-11]和花生[12-13]等植物中，具有顯著的抗氧化性和抑菌性，有抗衰老、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗細菌和真菌感染等作用[14-15]。Holme等[16]研究結果證實白藜蘆醇能夠抑制腫瘤細胞生長；姜寧等[17]通過建立小鼠模型，得出白藜蘆醇能夠改善哮喘小鼠的肺功能；盧晨欣等[18]研究得出白藜蘆醇與紫杉醇聯(lián)合用藥能夠更好地抑制人喉癌Hep-2細胞的增殖，具有良好的抗癌活性；Wu等[19]研究得出白藜蘆醇能夠改善金黃色葡萄球菌細胞因子水平；孫慧等[20]研究得出花生殼中白藜蘆醇含量較高，具有較好的抗氧化活性；王彥平等[21]研究赤霞珠釀酒葡萄皮渣白藜蘆醇最佳提取條件及抗氧化性，研究表明白藜蘆醇對DPPH·和·OH 具有較好的清除效果。研究表明，白藜蘆醇在葡萄皮渣、花生莖、虎杖中的含量分別為0.014%、0.083%、0.328%[22-24]，含量較低。前期研究發(fā)現(xiàn)咖啡果皮中含有一定量的白藜蘆醇，且關于咖啡果皮中白藜蘆醇的研究鮮見報道。

因此，本試驗以咖啡主要產(chǎn)區(qū)普洱本地豐富的咖啡果皮為原料，采用超聲輔助酶法探究咖啡果皮中白藜蘆醇提取的最佳工藝條件，并通過研究白藜蘆醇乙醇提取液對DPPH·、·OH 的清除作用和總還原能力，評價其體外抗氧化活性，旨在高效率提取咖啡果皮中的白藜蘆醇，為咖啡果皮的產(chǎn)品研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑

新鮮云南小粒種咖啡：采自普洱市思茅區(qū)木乃河咖啡園，咖啡鮮果果皮與種子分離后自然曬干，粉碎，過60 目篩，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

乙酸、乙醇、抗壞血酸、雙氧水、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵（均為分析純）：天津市大茂化學試劑廠；水楊酸、乙酸鈉、硫酸亞鐵（均為分析純）：天津市風船化學試劑有限公司；纖維素酶（10 萬U/g）、果膠酶（10 萬U/g）、半纖維素酶（10 萬U/g）、木聚糖酶（10 萬U/g）（均為食品級）：山東隆科特酶制劑有限公司；白藜蘆醇、1，1-二苯基-2-三硝 基 苯 肼 [1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH]（標準品）：成都植標化純生物技術有限公司。

1.1.2 主要設備

電子天平（PR224ZH/E）：奧豪斯儀器（常州）有限公司；紫外-可見分光光度計（UV-2600）：島津國際貿(mào)易有限公司；恒溫水浴鍋（HH-S28s）：常州市金壇大地自動化儀器廠；多功能粉碎機（BJ-800A）：浙江杭州拜杰科技有限公司；超聲波清洗機（YM-100S）：深圳市方奧微電子有限公司；低速離心機（SC-3616）：安徽中科中住科學儀器有限公司。

1.2 咖啡果皮白藜蘆醇的提取工藝研究

1.2.1 標準曲線的繪制

準確配制質(zhì)量濃度為0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 μg/mL 白藜蘆醇標準溶液，306 nm 處測吸光度，以白藜蘆醇濃度（x）為橫坐標，吸光度（y）為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程。

1.2.2 咖啡果皮白藜蘆醇供試液的制備與含量測定

準確稱取咖啡果皮樣品0.1 g，按咖啡果皮∶酶質(zhì)量比500∶1 添加酶，pH5，50 ℃酶解90 min，加乙醇超聲提取一定時間，3 500 r/min 離心5 min，取上清液，得一定量白藜蘆醇提取液。取提取液1.00 mL，乙醇稀釋至20 mL，306 nm 處測吸光度[25]，計算白藜蘆醇提取率（B，%），平行測定3 次，取平均值。

式中：C 為咖啡果皮提取液白藜蘆醇濃度，μg/mL；F 為咖啡果皮提取液稀釋倍數(shù)；V 為咖啡果皮提取液體積，mL；m 為咖啡果皮質(zhì)量，μg。

1.2.3 單因素試驗設計

以白藜蘆醇提取率為評價指標，設計單因素試驗。

1）固定乙醇體積分數(shù)70%、料液比1∶50（g/mL）、超聲時間30 min、超聲溫度30 ℃、酶添加量0.20%，考察不同酶（纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶、木聚糖酶）對白藜蘆醇提取率的影響。

2）固定料液比1∶50（g/mL）、超聲時間30 min、超聲溫度30 ℃、酶添加量0.20%，考察乙醇體積分數(shù)（30%、40%、50%、60%、70%、80%） 對白藜蘆醇提取率的影響。

3）固定乙醇體積分數(shù)70%、超聲時間30 min、超聲溫度30 ℃、酶添加量0.20%，考察料液比[1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80（g/mL）]對白藜蘆醇提取率的影響。

4）固定乙醇體積分數(shù)70%、料液比1∶60（g/mL）、超聲溫度30 ℃、酶添加量0.20%，考察超聲時間（10、20、30、40、50、60 min）對白藜蘆醇提取率的影響。

5）固定乙醇體積分數(shù)70%、料液比1∶60（g/mL）、超聲時間30 min、酶添加量0.20%，考察超聲溫度（35、40、45、50、55、60 ℃）對白藜蘆醇提取率的影響。

6）固定乙醇體積分數(shù)70%、料液比1∶60（g/mL）、超聲時間30 min、超聲溫度50 ℃，考察酶添加量（0、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%） 對白藜蘆醇提取率的影響。

1.2.4 正交試驗優(yōu)化與驗證

結合單因素試驗結果，設計L9（34）正交試驗優(yōu)化咖啡果皮白藜蘆醇提取工藝，正交試驗因素水平設計見表1。

表1 正交試驗因素水平設計Table 1 Factors and levels of orthogonal design

1.3 咖啡果皮白藜蘆醇體外抗氧化活性研究

1.3.1 DPPH·清除率的測定

參照李中堯等[26]的測定方法，稍作改動。準確配制20.00、40.00、60.00、80.00、100.00 μg/mL 和120.00 μg/mL白藜蘆醇樣品提取液。分別移取樣品提取液1.00 mL，加0.20 mmol/L DPPH 溶液3.00 mL，混勻，靜置30 min，517 nm 處測吸光度。以抗壞血酸（VC）為陽性對照，計算DPPH·清除率（D，%）。

式中：Ax為樣品溶液與DPPH 的吸光度；Ax0為無水乙醇代替DPPH 的吸光度；A0為無水乙醇代替樣品溶液的吸光度。

1.3.2 ·OH 清除率的測定

參照李燕等[27]的方法，稍作改動。分別移取20.00、40.00、60.00、80.00、100.00 μg/mL 和120.00 μg/mL 白藜蘆醇樣品提取液1.00 mL，加1.00 mL 6 mmol/L FeSO4溶液和1.00 mL 6 mmol/L 水楊酸溶液，搖勻，加1.00 mL 6 mmol/L H2O2溶液，35 ℃反應30 min，510 nm 處測吸光度。以VC為陽性對照，計算不同濃度·OH 清除率（O，%）。

式中：Ax為樣品混合液的吸光度；Ax0為蒸餾水代替H2O2溶液的吸光度；A0為蒸餾水代替樣品混合液的吸光度。

1.3.3 總還原能力的測定

參照王晗等[28]的方法。分別移取20.00、40.00、60.00、80.00、100.00 μg/mL 和120.00 μg/mL 白藜蘆醇樣品提取液1.00 mL，加2.50 mL pH6.6 磷酸鹽緩沖液、2.50 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混勻，50 ℃反應30 min，流水冷卻，依次加2.50 mL 10%三氯乙酸、2.50 mL 蒸餾水、0.50 mL 0.1% FeCl3溶液，混勻，反應10 min。以蒸餾水為參比，VC為陽性對照，700 nm 處測吸光度，總還原能力與吸光度大小成正比。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)結果處理采用Origin 9.0 軟件統(tǒng)計計算并作圖，工藝優(yōu)化采用L9（34）正交優(yōu)化分析方法。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

白藜蘆醇標準曲線見圖1。

圖1 白藜蘆醇標準曲線Fig.1 Standard curve for determination of resveratrol concentration

由圖1 可知，回歸方程為y=0.132 43x-0.038 81，R2=0.997 99，表明在分析濃度范圍內(nèi)白藜蘆醇質(zhì)量濃度與吸光度呈正相關，線性關系良好。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 酶種類對白藜蘆醇提取率的影響

酶種類對咖啡果皮白藜蘆醇提取率的影響結果見圖2。

圖2 酶種類對白藜蘆醇提取率的影響Fig.2 Effect of enzyme on the extraction rate of resveratrol

由圖2 可知，不同酶對咖啡果皮白藜蘆醇提取率的影響由大到小依次為果膠酶＞半纖維素酶＞木聚糖酶＞纖維素酶，咖啡果皮含有大量果膠，果膠酶會破壞細胞壁的網(wǎng)狀結構去除果膠，促使白藜蘆醇的溶出。故確定最佳酶種類為果膠酶。

2.2.2 酶添加量對白藜蘆醇提取率的影響

酶添加量對咖啡果皮白藜蘆醇提取率的影響結果見圖3。

圖3 果膠酶添加量對白藜蘆醇提取率的影響Fig.3 Effect of pectase addition on the extraction rate of resveratrol

由圖3 可知，0%～0.20%果膠酶添加范圍內(nèi)，白藜蘆醇以白藜蘆醇苷的結構存在于植物中，添加外酶可使白藜蘆醇苷分解為白藜蘆醇，酶添加量越大白藜蘆醇提取率越大，果膠酶添加量為0.20%時，提取率達0.854%。當果膠酶添加量大于0.20%時，咖啡果皮中的白藜蘆醇提取量基本已達到最大極限，提取率趨于平緩，故確定最佳酶添加量為0.20%，后續(xù)不對該條件進行優(yōu)化。

2.2.3 乙醇體積分數(shù)對白藜蘆醇提取率的影響

乙醇體積分數(shù)對咖啡果皮白藜蘆醇提取率的影響結果見圖4。

圖4 乙醇體積分數(shù)對白藜蘆醇提取率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of resveratrol

由圖4 可知，白藜蘆醇提取率呈先升后降趨勢，乙醇體積分數(shù)為70%時，提取率最大，達0.718%。分析原因可能是隨著乙醇體積分數(shù)的增加，白藜蘆醇親和力增強，同時一些與白藜蘆醇競爭乙醇-水分子的親脂性成分也會隨之增加[29]，從而導致白藜蘆醇溶出度降低，提取率下降。因此選取乙醇體積分數(shù)60%、70%、80%進行正交優(yōu)化。

2.2.4 料液比對白藜蘆醇提取率的影響

料液比對咖啡果皮白藜蘆醇提取率的影響結果見圖5。

由圖5 可知，隨著提取溶劑的增加，咖啡果皮白藜蘆醇提取率不斷增大，料液比為1∶60（g/mL）時提取率最大，之后提取率趨于平緩。因此選取料液比1∶50、1∶60、1∶70（g/mL）進行正交優(yōu)化。

2.2.5 超聲時間對白藜蘆醇提取率的影響

超聲時間對咖啡果皮白藜蘆醇提取率的影響結果見圖6。

由圖6 可知，白藜蘆醇提取率呈先升后降趨勢，當超聲時間為30 min 時，提取率最大，達0.934%。超聲時間為10～30 min 時，由于超聲波轉化為熱能，物料內(nèi)部溫度升高，使得白藜蘆醇加速溶解；其次在溶液中超聲波傳播時會發(fā)生空化效應[30]使細胞壁迅速破裂，白藜蘆醇不斷從咖啡果皮中被釋放出來。隨著超聲時間的延長，大部分白藜蘆醇已被提取出來，超聲時間過長會破壞白藜蘆醇分子結構，導致白藜蘆醇提取率下降。因此選取超聲時間20、30、40 min 進行正交優(yōu)化。

2.2.6 超聲溫度對白藜蘆醇提取率的影響

超聲溫度對咖啡果皮白藜蘆醇提取率的影響結果見圖7。

圖7 超聲溫度對白藜蘆醇提取率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic temperature on the extraction rate of resveratrol

由圖7 可知，白藜蘆醇提取率呈先升后降趨勢，50 ℃時提取率最大，達0.754%。這是因為50 ℃是果膠酶的最適溫度，繼續(xù)增加溫度則酶活性減弱，導致白藜蘆醇難溶出，提取率下降。因此選取超聲溫度45、50、55 ℃進行正交優(yōu)化。

2.3 正交試驗優(yōu)化結果

設計以乙醇體積分數(shù)（A）、料液比（B）、超聲時間（C）和超聲溫度（D）單因素為基礎的L9（34）正交試驗，結果見表2。

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal test

由表2 可知，各因素對咖啡果皮白藜蘆醇提取率的影響程度為C＞D＞B＞A，即超聲時間是影響咖啡果皮白藜蘆醇提取率的主要因素，其次是超聲溫度、料液比和乙醇體積分數(shù)。最佳提取工藝條件為A2B2C1D1，即乙醇體積分數(shù)70%、料液比1∶60（g/mL）、超聲時間20 min，超聲溫度45 ℃。在此最佳工藝條件下重復試驗3 次測得咖啡果皮白藜蘆醇提取率為0.856%，大于正交試驗中最高提取率，說明正交試驗設計合理，確定A2B2C1D1為咖啡果皮白藜蘆醇的最佳提取工藝條件組合。

2.4 咖啡果皮白藜蘆醇體外抗氧化活性研究

2.4.1 對DPPH·的清除作用

咖啡果皮白藜蘆醇對DPPH·的清除效果見圖8。

圖8 咖啡果皮白藜蘆醇提取液對DPPH·的清除作用Fig.8 DPPH free radical scavenging effect of resveratrol from coffee bean peels

由圖8 可知，20～120 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，咖啡果皮白藜蘆醇對DPPH·清除率基本隨質(zhì)量濃度的增加呈遞增趨勢，且在20 μg/mL 時清除率明顯強于抗壞血酸，可能是因為此時提取液中有高比例的原花青素、花青素和綠原酸等抗氧化物質(zhì)的溶出，對DPPH·清除率明顯高于抗壞血酸。整體來看，在試驗濃度范圍內(nèi)，咖啡果皮白藜蘆醇對DPPH·清除率和抗壞血酸接近。

2.4.2 對·OH 的清除作用

咖啡果皮白藜蘆醇對·OH 的清除效果見圖9。

圖9 咖啡果皮白藜蘆醇提取液對·OH 的清除作用Fig.9 Hydroxyl free radical scavenging effect of resveratrol from coffee bean peels

由圖9 可知，20～120 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，咖啡果皮白藜蘆醇對·OH 有較強的清除能力，清除率與濃度呈線性關系，即隨著濃度的增加清除能力增強，在分析的濃度范圍內(nèi)咖啡果皮白藜蘆醇對·OH 清除能力明顯強于抗壞血酸。

2.4.3 總還原能力的測定

咖啡果皮白藜蘆醇的總還原能力見圖10。

圖10 咖啡果皮白藜蘆醇提取液總還原能力Fig.10 Reducing power of resveratrol from coffee bean peels

由圖10 可知，20～120 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，咖啡果皮白藜蘆醇總還原能力與濃度存在一定量效關系，總還原能力隨著濃度的增加而增強，在相同試驗濃度下，咖啡果皮白藜蘆醇總還原能力始終強于抗壞血酸，表明咖啡果皮白藜蘆醇具有較強的總還原能力。

3 結論

本試驗充分利用普洱本地豐富的咖啡果皮，在70%乙醇體積分數(shù)、1∶60（g/mL）料液比、20 min 超聲時間、45 ℃超聲溫度條件下得到0.856%高提取率的白藜蘆醇。

超聲波輔助提取應用于大多數(shù)植物提取，提取時間短、操作簡單、耗能低、安全性高；果膠酶有助于白藜蘆醇的溶出，二者結合白藜蘆醇提取效果更佳。體外抗氧化試驗結果表明，在試驗濃度范圍內(nèi)咖啡果皮白藜蘆醇提取液對DPPH·和·OH 的清除能力明顯強于VC，證明其在咖啡果皮抗氧化產(chǎn)品的研究方面前景廣闊。