放療、吉西他濱聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑的三重療法對三陰性乳腺癌腫瘤微環(huán)境的作用機(jī)制

吳苗苗 房 坤

1.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院西區(qū) 安徽省腫瘤醫(yī)院 安徽省立醫(yī)院西區(qū)腫瘤表觀遺傳學(xué)研究室，安徽合肥 230031；2.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院 安徽省立醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)工程處，安徽合肥 230001

三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是一種侵襲性高、臨床預(yù)后差、平均生存期低的惡性腫瘤。目前對TNBC 患者常采用化療和放療等方法[1-2]。免疫治療，尤其是程序性死亡受體-1/程序性死亡受體配體1 抑制劑（anti-programmed death-ligand1，aPDL1），在各種癌癥中的應(yīng)用為患者帶來了臨床效益[3-5]。而TNBC 與其他腫瘤比較，aPD-L1 對其的治療效果并不理想[6-7]。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)放療（radiotherapy，RT）和一些化療藥物如吉西他濱（Gemcitabine，Gem）可以促進(jìn)aPD-L1 的效果[8-10]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-induciblefactor-1α，HIF-1α）常引起腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，也可作為一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)[11-12]。本研究擬探討放療、Gem 聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑的三重療法在小鼠三陰性乳腺癌模型中的效果及可能作用的機(jī)制，為TNBC 的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物、細(xì)胞株與主要儀器29 只5 周齡的SPF 級雌性BALB/c 小鼠，體重18～20 g，購于江蘇華創(chuàng)信諾醫(yī)藥科技有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2020-0009；質(zhì)量合格證號：202 226029；使用許可證號：SYXK（皖）2021-005。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于中國科技大學(xué)附屬第一醫(yī)院（安徽省立醫(yī)院）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，本研究經(jīng)中國科技大學(xué)附屬第一醫(yī)院（安徽省立醫(yī)院）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[2021-N（A）-230]。飼養(yǎng)條件：室溫20～25℃，相對濕度45%～65%，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食，普通光照。BALB/c 自發(fā)性乳腺癌細(xì)胞系4T1 細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo）；Tanon 6200 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海天能生命科學(xué)有限公司）；CytoFLEX 流式細(xì)胞儀（美國Beckman-Coulter）；CX43 顯微鏡（日本Olympus）；BA410E 熒光顯微鏡[麥克奧迪（廈門）電氣股份有限公司]。

1.1.2 主要試劑 鹽酸Gem（Cat.NO.MB1113，大連美侖生物技術(shù)有限公司）；aPD-L1 人源化單克隆抗體KL-A167 注射液（四川科倫博泰生物醫(yī)藥股份有限公司）；胎牛血清（Cat.NO.10099-141）和RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基（Cat.NO.31870074）（美國Gibco）；紅細(xì)胞裂解液（Cat.NO.R1010，北京索萊寶科技有限公司）；CD4-FITC 抗體（Cat.NO.11-0041-82）、CD8a-PE 抗體（Cat.NO.12-0081-82）、CD3e-PE-cyanine5 抗 體（Cat.NO.15-0031-82）（美國Invitrogen）；TUNEL 凋亡檢測試劑盒（Cat.NO.C1088，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；小鼠白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）（Cat.NO.E-EL-M0044c）、γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ）（Cat.NO.E-EL-M0048c）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）（Cat.NO.E-EL-M0049c）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）；BCA 蛋白定量分析試劑盒（Cat.NO.23227，美國Pierce）；HIF-1α 抗體（Cat.NO.#36169，美國CST）；血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗體（Cat.NO.bs-0279R，博士德生物工程有限公司）；GAPDH 抗體（Cat.NO.10494-1-AP，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；PierceTMECL-Plus-Western-Blotting 底物試劑盒（Cat.NO.#34080，美國Thermo）。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將4T1 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)基中，并置于37℃、5%CO2/95%空氣增濕的培養(yǎng)箱中。

1.2.2 分組及干預(yù)措施 實(shí)驗(yàn)第1 天，于動(dòng)物左腹部皮下注射約1×106個(gè)4T1 細(xì)胞，待腫瘤體積增長至100 mm3時(shí)采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為對照組（5 只）、aPD-L1組（6 只）、RT+aPD-L1 組（6 只）、Gem+aPD-L1 組（6 只）和三聯(lián)組（6 只）。實(shí)驗(yàn)第6、8、10 天于瘤內(nèi)注射藥物（Gem 5 mg/kg，aPD-L1 3 mg/kg），每次注射24 h 后，對RT+aPD-L1 組和三聯(lián)組用醫(yī)用電子直線加速器（瑞典醫(yī)科達(dá)）進(jìn)行RT，2 Gy/d。實(shí)驗(yàn)中每隔2 d 記錄小鼠體重，實(shí)驗(yàn)期為30 d，結(jié)束后脫頸處死小鼠，采集腫瘤、血液和主要器官進(jìn)一步分析。將小鼠的心臟、肝臟、脾臟、腎臟收集固定于4%多聚甲醛，石蠟包埋，切片后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測 取各組小鼠外周血經(jīng)紅細(xì)胞裂解液裂解后待用。另收集各組小鼠腫瘤組織，用透明質(zhì)酸酶/膠原酶Ⅳ和DNA 酶Ⅰ37℃下消化2 h，裂解紅細(xì)胞并過濾獲得單細(xì)胞懸液待用。按照說明書取CD4-FITC、CD8a-PE 和CD3e-PE-cyanine5 抗體與外周血或單細(xì)胞懸液共孵育，流式細(xì)胞儀檢測各染色細(xì)胞，并用CytExpert 2.4.0.28 進(jìn)行分析。

1.2.4 炎癥因子的檢測 取各組外周血，取血清待用。另取各組腫瘤組織勻漿后待用。根據(jù)說明書采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒檢測外周血血清中和腫瘤勻漿內(nèi)IFN-γ、TNF-α 和IL-6 的表達(dá)。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色和TUNEL 檢測 取腫瘤組織石蠟切片用Ki-67（1∶800）、CD31（1∶200）和γH2AX 的（1∶100）抗體孵育，再與種屬特異性二抗（1∶1 000）孵育。清洗后，與二氨基聯(lián)苯胺顯色劑孵育3～5 min，用蘇木精反染后在顯微鏡下觀察。另取腫瘤組織石蠟切片，根據(jù)說明書用TUNEL 檢測試劑盒染色，熒光顯微鏡下觀察，評估細(xì)胞凋亡情況。關(guān)于微血管密度（microvessel density，MVD）的測定，每組取5 個(gè)CD31 高陽性熱點(diǎn)微血管數(shù)值的平均值。每組取5 個(gè)高倍視野計(jì)算γH2AX 陽性細(xì)胞比率作為DNA 損傷的定量分析。

1.2.6 Western blot 取各組腫瘤組織提取蛋白。用BCA 蛋白定量分析試劑盒對總蛋白定量。各組蛋白（100 μg/孔）經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜，封閉后，與一抗HIF-1α（1∶1 000）、VEGF（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000）孵育。洗膜后，與種屬特異性二抗（1∶2 000）孵育。洗膜后，將膜曝光并掃描保存。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 五組體重、瘤重的比較及重要器官情況

實(shí)驗(yàn)過程中各組體重比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，RT+aPD-L1 組、三聯(lián)組瘤重均低于aPD-L1 組，三聯(lián)組低于RT+aPD-L1 組（P＜0.05）。蘇木精-伊紅染色顯示各組心臟、肝臟、脾臟、腎臟沒有明顯損傷。見圖1。

圖1 不同治療對腫瘤生長的影響

2.2 五組外周血及腫瘤中CD3+CD8+T 細(xì)胞絕對百分比、IFN-γ、TNF-α、IL-6 比較

aPD-L1 組外周血CD3+CD8+T 細(xì)胞絕對百分比、TNF-α、IL-6 高于對照組；RT+aPD-L1 組外周血IL-6 高于aPD-L1 組，三聯(lián)組外周血CD3+CD8+T 細(xì)胞絕對百分比、IFN-γ、IL-6 高于aPD-L1 組；三聯(lián)組外周血CD3+CD8+T 細(xì)胞絕對百分比高于RT+aPD-L1組、Gem+aPD-L1 組，IL-6 高于Gem+aPD-L1 組（P＜0.05）。aPD-L1 組腫瘤組織中CD3+CD8+T 細(xì)胞絕對百分比、IFN-γ、TNF-α、IL-6 高于對照組；RT+aPD-L1組、Gem+aPD-L1 組、三聯(lián)組腫瘤組織中CD3+CD8+T細(xì)胞絕對百分比高于aPD-L1 組，三聯(lián)組TNF-α、IL-6 高于aPD-L1 組；三聯(lián)組腫瘤組織中CD3+CD8+T細(xì)胞絕對百分比、IL-6 高于RT+aPD-L1 組、Gem+aPDL1 組，IFN-γ 高于RT+aPD-L1 組（P＜0.05）。見圖2。

圖2 五組外周血及腫瘤中CD3+CD8+T 細(xì)胞絕對百分比、IFN-γ、TNF-α、IL-6 比較

2.3 五組Ki-67、細(xì)胞凋亡情況及MVD-CD31、γH2AX陽性細(xì)胞比率及HIF-1α、VEGF 比較

免疫組織化學(xué)染色和TUNEL 檢測顯示三聯(lián)組腫瘤組織中Ki-67 的表達(dá)減少，凋亡的細(xì)胞增多。三聯(lián)組MVD-CD31 低于aPD-L1 組，γH2AX 陽性細(xì)胞比率高于aPD-L1 組、Gem+aPD-L1 組（P＜0.05）。aPD-L1組VEGF 低于對照組，RT+aPD-L1 組、Gem+aPD-L1組、三聯(lián)組VEGF 低于aPD-L1 組，三聯(lián)組HIF-1α 低于aPD-L1 組和RT+aPD-L1 組（P＜0.05）。見圖3。

圖3 五組Ki-67、細(xì)胞凋亡情況及MVD-CD31、γH2AX 陽性細(xì)胞比率及HIF-1α、VEGF 比較

3 討論

實(shí)體瘤的治療手段通常是化療和放療，TNBC 也不例外。近年來，能刺激宿主免疫系統(tǒng)來攻擊腫瘤細(xì)胞的免疫治療有望成為下一代癌癥治療策略。其中，免疫檢查點(diǎn)阻斷是常用的方法。

4T1 是來源于BALB/c 小鼠的三陰性乳腺癌細(xì)胞，與晚期人類癌癥相似[13]。本研究建立了小鼠乳腺癌細(xì)胞系4T1 的BALB/c 小鼠移植瘤模型，觀察到了三重治療可以減緩腫瘤的生長。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)該治療效果可能與CD8+細(xì)胞毒性T 細(xì)胞（cytotoxic T cells，CTL）數(shù)量增加有關(guān)，CD8+CTL 是直接殺死腫瘤細(xì)胞的免疫效應(yīng)細(xì)胞。研究表明，較高數(shù)量的CD8+T 細(xì)胞與各種癌癥較好的結(jié)局相關(guān)[14-16]。另外，三重治療增加了與細(xì)胞殺傷有關(guān)的炎癥因子如IFN-γ、TNF-α、IL-6 的表達(dá)。PD-L1 是由效應(yīng)T 細(xì)胞釋放的IFN-γ在轉(zhuǎn)錄水平上誘導(dǎo)的，TNF-α 可以阻止腫瘤發(fā)生、發(fā)展[17-19]。IL-6 是典型的促炎性細(xì)胞因子，可以預(yù)測免疫應(yīng)答[20]。

由于不規(guī)則的血管生成和細(xì)胞增殖，腫瘤組織比正常組織更加缺氧。在TNBC 中，腫瘤缺氧微環(huán)境的免疫抑制功能會(huì)逐漸增強(qiáng)腫瘤的進(jìn)化[21-22]。有研究表明，下調(diào)HIF-1α 在TNBC 中的表達(dá)可以部分抑制癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[23]。VEGF 是血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，同時(shí)也是一個(gè)免疫抑制因子[24-25]。三重治療組中HIF-1α 和VEGF 的表達(dá)較低，提示三重治療還可以改善腫瘤缺氧微環(huán)境，抑制微血管生成。

綜上所述，本研究在小鼠TNBC 移植瘤模型中應(yīng)用了RT、Gem 聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑的三重療法。雖然單獨(dú)使用aPD-L1 有一定治療作用，但三重療法不僅可以作為調(diào)節(jié)浸潤性T 淋巴細(xì)胞的“蓄水池”，還可以改善瘤內(nèi)缺氧狀況，并且抑制微血管生長。關(guān)于臨床的進(jìn)一步應(yīng)用，需要深入研究和優(yōu)化藥物使用劑量和治療頻率。