基于“辨狀論質(zhì)”結(jié)合熵權(quán)法的厚樸藥材質(zhì)量等級研究△

梁敬妮，李陽，由金文，楊瑞琦，李佳慧，崔陽，王亞順，鄒慧琴*，閆永紅*

1.北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京 102488；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學院 中藥材研究所，湖北 恩施 445000；3.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所，北京 100193

厚樸為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalisRehd.et Wils.或凹葉厚樸M.officinalisRehd.et Wils.var.bilobaRehd.et Wils.的干燥干皮、根皮及枝皮，具有燥濕消痰、下氣除滿的功效[1]。現(xiàn)代研究表明，酚類和揮發(fā)油類是厚樸的主要藥效成分[2]。現(xiàn)代藥理研究表明，厚樸具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗癌、心肌保護、腦缺血保護、抗焦慮、抗抑郁等廣泛的生物活性[3-8]。在《七十六種藥材商品規(guī)格標準》[9]（以下簡稱原標準）中，依據(jù)產(chǎn)地和藥用部位的不同將厚樸劃分為“溫樸筒樸”（產(chǎn)于浙江的干皮）、“川樸筒樸”（產(chǎn)于四川的干皮）、“蔸樸”（靠近根部的干皮和根皮）、“耳樸”（靠近根部的干皮）和“根樸”5 種商品規(guī)格，其中在“川樸筒樸”規(guī)格下根據(jù)長度和質(zhì)量的不同劃分為4 個等級。在市場流通中，主要以“辨狀論質(zhì)”的經(jīng)驗鑒別對厚樸進行等級劃分，即通過外部性狀特征鑒別質(zhì)量優(yōu)劣，因受產(chǎn)地、樹齡差異性大、加工隨意性強等自然和人為因素的影響，相同等級的厚樸藥材質(zhì)量參差不齊。“辨狀論質(zhì)”是中藥傳統(tǒng)經(jīng)驗鑒別的精髓[10]，但其主觀性較強，而現(xiàn)代理化鑒別具有客觀性和準確性，對傳統(tǒng)性狀鑒別結(jié)果與現(xiàn)代理化鑒別結(jié)果進行相關(guān)性研究可為“辨狀論質(zhì)”提供科學依據(jù)。

近年來，信息熵賦權(quán)法在醫(yī)藥衛(wèi)生行業(yè)應(yīng)用廣泛，其權(quán)重依據(jù)客觀的實驗數(shù)據(jù)，是研究解決多個不相容問題和方法的有力工具，能夠?qū)崿F(xiàn)多目標決策分析。這與中藥多指標質(zhì)量綜合評價思路相符合，能真實地反映客觀規(guī)律[11]，目前已經(jīng)應(yīng)用于白芷[12]、當歸[13]、羌活[14]等的質(zhì)量評價中。

研究表明，不同產(chǎn)地的厚樸藥材質(zhì)量差異較大[15]，有必要按產(chǎn)地劃分厚樸藥材的商品規(guī)格。另外，經(jīng)市場調(diào)研發(fā)現(xiàn)，市售厚樸多為“筒樸”干皮，其他規(guī)格極少見，故本研究以“川樸筒樸”為研究對象，將可量化的外觀性狀指標與內(nèi)在質(zhì)量指標相結(jié)合，采用統(tǒng)計學、化學計量學等方法，探究厚樸藥材外觀性狀與有效成分的相關(guān)性，建立“川樸筒樸”的質(zhì)量等級標準，為厚樸藥材綜合質(zhì)量評價提供參考。

1 材料

UltiMate3000 型高效液相色譜儀、TRACE GC ULTRA 型氣相色譜儀（美國賽默飛世爾科技有限公司）；FW-135 型粉碎機（北京興時利和科技發(fā)展有限公司）；BS-124S 型電子分析天平（德國Sartorius公司）。

對照品厚樸酚（批號：KS0912CB14）、和厚樸酚（批號：Z20A6L1）、β-桉葉醇（批號：P18M8F3 2040）純度均≥98%，購于上海源葉生物科技有限公司；色譜純甲醇、乙酸乙酯（美國Fisher 公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

本研究中厚樸均為已知樹齡、自然干燥、未經(jīng)發(fā)汗的自采藥材，所有樣品經(jīng)北京中醫(yī)藥大學中藥資源與鑒定系閆永紅教授鑒定為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalisRehd.et Wils.或凹葉厚樸M.officinalisRehd.et Wils.var.bilobaRehd.et Wils.的干燥干皮。a1～a16 樹齡為25 年，b1～b13 樹齡為20年，c1～c8樹齡為15年，d1～d5樹齡為20年。

2 方法與結(jié)果

2.1 外觀性狀

對42 批厚樸藥材的長度和質(zhì)量進行測定，鑒于原標準規(guī)定一等“川樸筒樸”長度為40～43 cm，因此以40 cm 作為標準對質(zhì)量進行換算，即每40 cm“川樸筒樸”的質(zhì)量為單位質(zhì)量；取厚樸藥材，將斷面修剪平整，縱向每2 cm 取1 個點，用游標卡尺測量厚度，取平均值，測定結(jié)果見表1。

表1 厚樸外觀性狀指標測量結(jié)果

2.2 厚樸酚與和厚樸酚質(zhì)量分數(shù)測定

按《中華人民共和國藥典》（以下簡稱為《中國藥典》）2020 年版[1]色譜條件進行厚樸酚與和厚樸酚質(zhì)量分數(shù)測定。

2.3 β-桉葉醇的含量測定

2.3.1 對照品溶液的制備 取β-桉葉醇對照品，精密稱定，加入乙酸乙酯制成質(zhì)量濃度為0.818 4 mg·mL-1的β-桉葉醇溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 取樣品粉末（過二號篩）約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入乙酸乙酯25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，靜置1 h，超聲處理（300 W，40 kHz）30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，加入乙酸乙酯補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即為供試品溶液。

2.3.3 色譜條件 HP-5 毛細管色譜柱（30 m×320 μm×0.25 μm），進樣口溫度為250 ℃，檢測器溫度為250 ℃；載氣為氫氣；升溫程序：初始120 ℃保持2 min，5 ℃·min-1升至240 ℃，保持5 min；流速為1 mL·min-1；進樣量為1 μL；分流比為10∶1。

2.3.4 方法學考察 精密吸取2.3.1 項下對照品溶液，配制成系列質(zhì)量濃度的對照品溶液，按2.3.3項下色譜條件測定其峰面積，分別以質(zhì)量濃度為橫坐標（X），色譜峰峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得回歸方程Y=7 531 677.5X+41 526.2（r=0.999 9）。結(jié)果表明，β-桉葉醇質(zhì)量濃度為0.005 115～0.818 400 mg·mL-1時與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

精密吸取同一樣品溶液1 μL，連續(xù)進樣6 次，按2.3.3項下色譜方法測定，計算β-桉葉醇色譜峰面積RSD為1.55%，表明儀器精密度良好。

精密稱取同一樣品粉末6份，按2.3.2項下供試品制備方法平行制備，分別進樣，按2.3.3項下色譜方法測定峰面積，計算β-桉葉醇含量RSD為1.05%，表明該方法重復性良好。

取同一樣品粉末，精密稱定，按2.3.2項下供試品溶液制備方法制備，分別于放置0、2、4、8、12、24 h后進樣，按2.3.3項下色譜方法測定峰面積，計算其RSD 為1.70%，表明供試品溶液在24 h 之內(nèi)穩(wěn)定。

取已知含量的樣品粉末6 份，每份1 g，精密稱定，分別加入等量的β-桉葉醇對照品溶液，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，按2.3.3項下色譜方法測定，計算其回收率均值為100.82%，RSD 為1.98%，符合要求。

2.3.5 樣品β-桉葉醇質(zhì)量分數(shù)測定 按2.3.2 項下方法制備供試品溶液，按2.3.3 項下色譜條件進樣2 次，計算樣品中β-桉葉醇的含量，取平均值。

2.4 信息熵權(quán)法計算綜合評分

信息熵權(quán)法是將每個評價指標作為1 個隨機變量，計算該指標的信息熵。其取值變異程度越大，指標越有序，信息熵就越小，說明信息增益越大，發(fā)生的概率越大，不確定性越小，該指標就越重要；反之，該指標就越不重要。信息熵權(quán)法的計算步驟：1）建立原始評價指標矩陣(Xij)mn：

2）將原始數(shù)據(jù)矩陣(Xij)mn轉(zhuǎn)換為概率矩陣(Pij)mn：

3）計算信息熵（Hi）：

4）計算各指標的熵權(quán)系數(shù)（Wi）：

其中，Xij表示第j次試驗時第i個評價指標的取值，i=1、2、3……m；j=1、2、3……n。Pij表示第j次試驗在i指標下的概率。

5）綜合評分的計算：按公式（1）計算厚樸藥材化學成分含量綜合評分，結(jié)果見表2。

表2 厚樸內(nèi)在成分指標及綜合評分

綜合評分=厚樸酚質(zhì)量分數(shù)×W厚樸酚+和厚樸酚質(zhì)量分數(shù)×W和厚樸酚+β-桉葉醇質(zhì)量分數(shù)×Wβ-桉葉醇（1）

2.5 相關(guān)性分析

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件對厚樸酚質(zhì)量分數(shù)、和厚樸酚質(zhì)量分數(shù)、β-桉葉醇質(zhì)量分數(shù)、綜合評分、厚度、單位質(zhì)量6 個指標進行Spearman 相關(guān)分析，見表3。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，厚樸酚質(zhì)量分數(shù)與厚度、單位質(zhì)量呈非常顯著正相關(guān)（P<0.01）；和厚樸酚質(zhì)量分數(shù)與單位質(zhì)量呈非常顯著正相關(guān)（P<0.01）；β-桉葉醇質(zhì)量分數(shù)與厚度呈非常顯著正相關(guān)（P<0.01），與單位質(zhì)量呈顯著正相關(guān)（P<0.05）；綜合評分與單位質(zhì)量、厚度均呈非常顯著正相關(guān)（P<0.01）。此外，從表3 還可以看出，單位質(zhì)量與厚度呈非常顯著正相關(guān)（P<0.01），各成分質(zhì)量分數(shù)之間也具有一定的正相關(guān)關(guān)系，厚樸酚質(zhì)量分數(shù)與β-桉葉醇質(zhì)量分數(shù)具有非常顯著正相關(guān)關(guān)系（P<0.01），與和厚樸酚質(zhì)量分數(shù)具有顯著正相關(guān)關(guān)系（P<0.05）。這說明厚樸皮越厚、質(zhì)量越大、油性越大，厚樸內(nèi)在有效成分和厚樸酚、厚樸酚質(zhì)量分數(shù)越高，厚樸質(zhì)量越好，闡明了傳統(tǒng)性狀鑒別中認為厚樸以“皮厚、油潤”為優(yōu)的科學內(nèi)涵。

表3 厚樸外觀性狀與內(nèi)在指標間的相關(guān)性分析

2.6 “川樸筒樸”等級劃分

2.6.1 聚類分析 通過對42 批“川樸筒樸”的成分含量測定發(fā)現(xiàn)，有12 批樣品的厚樸酚及和厚樸酚總量低于《中國藥典》2020 年版規(guī)定的2.0%。因此，本研究運用SPSS 26.0 軟件，以外在性狀指標（厚度、單位質(zhì)量）和內(nèi)在成分含量的綜合評分為變量，采用離差平方和（Ward）法對成分含量符合《中國藥典》2020 年版規(guī)定的30 批“川樸筒樸”進行系統(tǒng)聚類分析，以對其進行等級劃分，聚類分析結(jié)果見圖1。從圖1 可以看出，當平方歐氏距離為5時，30 批“川樸筒樸”分為3 類，其中樣品編號為a1～a7的樣品聚為第1類，編號為a8～a14和b1的樣品聚為第2類，剩余15批樣品聚為第3類。

圖1 30批“川樸筒樸”聚類分析圖

2.6.2 主成分分析 以標準化后的厚度、單位質(zhì)量、厚樸酚質(zhì)量分數(shù)、和厚樸酚質(zhì)量分數(shù)、β-桉葉醇質(zhì)量分數(shù)為變量導入SIMCA-P14.1 軟件，經(jīng)HotellingT2檢驗，30 批樣品的T2值均在95%置信區(qū)間內(nèi)，無異常數(shù)值，可進一步對其進行主成分分析。主成分分析結(jié)果顯示，前2 個主成分累積方差貢獻率為92.8%，能反映各批次“川樸筒樸”樣品92.8%的信息。根據(jù)得到的主成分，建立模型，其中能力解釋參數(shù)R2x（cum）為0.928、Q2（cum）為0.753，模型區(qū)分度和預(yù)測程度均良好，主成分分析得分圖見圖2。從圖2 可以看出30 批“川樸筒樸”樣品可分為3 個等級，一等和三等“川樸筒樸”相距最遠，說明兩者的性狀與內(nèi)在指標成分含量差異最大。

圖2 不同等級“川樸筒樸”樣品的主成分分析

2.6.3 正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）為了進一步明確不同等級“川樸筒樸”藥材的差異特征，在主成分分析的基礎(chǔ)上，通過OPLS-DA 可以實現(xiàn)3 個等級“川樸筒樸”樣品的有效區(qū)分（圖3）。本次分析中的自變量擬合指數(shù)（R2X）為0.977，因變量擬合指數(shù)（R2Y）為0.702，模型預(yù)測指數(shù)（Q2）為0.629，R2和Q2超過0.5，表示模型擬合結(jié)果可接受[16]。經(jīng)過200 次置換檢驗結(jié)果顯示，左側(cè)端隨機排列產(chǎn)生的R2、Q2全都小于右側(cè)端的原始值，Q2回歸線與縱軸的相交點小于0，說明模型不存在過擬合，模型驗證有效，認為該結(jié)果可用于“川樸筒樸”的等級劃分。

圖3 不同等級“川樸筒樸”樣品的OPLS-DA

通過計算變量重要性投影（VIP）值可分析各自變量對因變量的影響作用大小，結(jié)果顯示，VIP 值為β-桉葉醇質(zhì)量分數(shù)（1.10）>單位質(zhì)量（1.07）>厚度（1.01）>厚樸酚質(zhì)量分數(shù)（0.99）>和厚樸酚質(zhì)量分數(shù)（0.81）。

2.6.4 “川樸筒樸”質(zhì)量等級的建立 評價指標的Wi越大，表明該指標越重要，經(jīng)上述分析發(fā)現(xiàn)，化學成分熵權(quán)系數(shù)與化學成分的VIP 值的大小順序一致，均為β-桉葉醇質(zhì)量分數(shù)>厚樸酚質(zhì)量分數(shù)>和厚樸酚質(zhì)量分數(shù)。相關(guān)性分析結(jié)果也表明，由熵權(quán)系數(shù)計算得到的綜合評分與其他各項評價指標均有顯著相關(guān)性，故化學成分的綜合評分能更全面反映藥材質(zhì)量，可作為等級劃分的依據(jù)。藥材在實際采收、加工和運輸過程中質(zhì)量難免損失，導致測量不準確，而厚度則不易發(fā)生改變，且經(jīng)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，單位質(zhì)量與厚度具有非常顯著的正相關(guān)關(guān)系，為了使等級的劃分更簡便、準確，故將厚度和化學成分綜合評分2 個指標作為“川樸筒樸”等級劃分的依據(jù)，建立質(zhì)量等級。一等品的厚度為3 mm及以上，綜合評分為0.65 分及以上；二等品的厚度為2～3 mm，綜合評分為0.50～0.65 分；三等品的厚度<2 mm，綜合評分為0.25～0.50分。

根據(jù)建議標準將30 個樣品重新劃分等級，對于少數(shù)不能同時滿足以上2 個指標的樣品，將數(shù)值四舍五入，歸入對應(yīng)的等級。結(jié)果顯示，重新劃分的結(jié)果和多元統(tǒng)計分析的結(jié)果一致。采用SPSS 26.0軟件對建議標準下不同等級“川樸筒樸”樣品的厚度、單位質(zhì)量、厚樸酚質(zhì)量分數(shù)、和厚樸酚質(zhì)量分數(shù)、β-桉葉醇質(zhì)量分數(shù)及綜合評分進行單因素方差分析，結(jié)果表明，各等級樣品以上6個指標的P值均小于0，差異有統(tǒng)計學意義，證實了建議標準具有科學性與合理性。

3 討論

厚樸中的化學成分以酚類和揮發(fā)油類成分為主，其中酚類成分以厚樸酚及和厚樸酚為主，在厚樸中含量占比最高，為厚樸的主要活性物質(zhì)，對多種癌癥也有治療作用[17]；揮發(fā)油類成分中桉葉油醇及其異構(gòu)體的含量最高，具有抗氧化、抗炎等藥理作用[18]。本研究以主要藥效成分和厚樸酚、厚樸酚的含量，以及厚樸揮發(fā)油中主要成分β-桉葉醇作為厚樸的內(nèi)在質(zhì)量指標，將外觀性狀和內(nèi)在質(zhì)量結(jié)合，體現(xiàn)了傳統(tǒng)“辨狀論質(zhì)”的內(nèi)涵，更能全面地反映厚樸藥材的真實質(zhì)量。

目前，市場上厚樸藥材多以統(tǒng)貨流通，導致其質(zhì)量參差不齊。本研究測定了42 批“川樸筒樸”樣品的厚樸酚、和厚樸酚與β-桉葉醇含量，發(fā)現(xiàn)其中12 批按原標準劃分為三等或四等的樣品中厚樸酚及和厚樸酚總量不符合《中國藥典》2020 年版規(guī)定，且部分四等品的成分含量比三等品更高，其原因除藥材內(nèi)在質(zhì)量因素外，還有另一個因素就是原標準的局限性，僅憑外觀性狀劃分等級導致其劃分的結(jié)果具有較大誤差。故本研究在測定2 個可量化的外觀指標基礎(chǔ)上引入信息熵權(quán)法，對厚樸中的3 個化學成分含量進行客觀賦權(quán)，再根據(jù)各成分的權(quán)重計算綜合評分，有效避免了因主觀判斷誤差對權(quán)重分配的影響。通過分析內(nèi)在成分含量及其綜合評分與外觀性狀的相關(guān)性，證實了綜合評分與其他各項評價指標均具有較強的相關(guān)性，較為全面地反映厚樸藥材質(zhì)量，可作為等級劃分的依據(jù)。本研究根據(jù)外觀性狀與內(nèi)在品質(zhì)對符合《中國藥典》2020 年版規(guī)定的30 批“川樸筒樸”樣品經(jīng)無監(jiān)督模式的聚類分析和主成分分析，將其分為3 個等級，再經(jīng)有監(jiān)督模式的OPLS-DA 對等級模型進行優(yōu)化，最后對各等級的厚度和化學成分綜合評分的范圍作出限定，使建立的等級標準更科學、準確。

本研究證實了外觀性狀指標與內(nèi)在活性成分厚樸酚、和厚樸酚和β-桉葉醇具有顯著的相關(guān)性。另外，β-桉葉醇作為厚樸揮發(fā)油的主要成分，表征厚樸藥材的油潤性，與有效成分厚樸酚、和厚樸酚質(zhì)量分數(shù)呈顯著正相關(guān)，初步闡明了傳統(tǒng)性狀鑒別中厚樸以“皮厚、質(zhì)重、氣辛”為佳的科學內(nèi)涵，即深層次的化學成分含量差異表現(xiàn)為性狀差異，而性狀和成分的差異，預(yù)示著藥效的差異性。傳統(tǒng)“辨狀論質(zhì)”觀點認為厚樸以皮厚肉紫、油性大、斷面紫棕色有發(fā)亮結(jié)晶物、氣香苦者為佳，故建議在后續(xù)研究中將厚樸的顏色、氣味、滋味等性狀特征采用機器視覺、嗅覺和味覺等技術(shù)對“肉紫、氣香、味苦”進行數(shù)據(jù)量化呈現(xiàn)，同時將傳統(tǒng)經(jīng)驗鑒別與現(xiàn)代理化鑒別和生物評價相結(jié)合，為闡明厚樸“辨狀論質(zhì)”的科學內(nèi)涵提供更豐富科學的依據(jù)。