酸棗仁-五味子藥對(duì)抗焦慮藥效及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制分析研究△

劉潔，王曉玫，楊雪，石晉麗*，張建民

1.首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院，北京 100020；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 102488

焦慮癥是以焦慮為主要特征的神經(jīng)癥，表現(xiàn)為持續(xù)性的緊張、驚恐不安，并伴有自主神經(jīng)功能紊亂及運(yùn)動(dòng)性不安等癥狀[1]。焦慮癥的終身患病率最高，影響到全球30%人口的壽命[2-3]，隨著生活節(jié)奏的加快，學(xué)習(xí)工作壓力的增大，焦慮癥已成為當(dāng)今社會(huì)危害人類(lèi)身體健康的主要疾病[4-5]，對(duì)焦慮癥的治療成為國(guó)際研究的熱點(diǎn)。目前，化學(xué)藥[包括苯二氮類(lèi)藥物和5-羥色胺（5-HT）再攝取抑制劑]為臨床常用治療藥物，其療效顯著，但同時(shí)也存在諸多不良反應(yīng)[6]。

中醫(yī)將焦慮癥歸屬于情志病、心腦病范疇，與中醫(yī)的郁證、心悸、不寐、臟躁、驚恐等有關(guān)[7]。當(dāng)代醫(yī)家對(duì)焦慮癥的治療主要以肝心為主，可涉及脾腎[7-9]。中醫(yī)藥治療焦慮癥具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，還能避免出現(xiàn)使用抗焦慮化學(xué)藥產(chǎn)生的不良反應(yīng)[10]。中藥復(fù)方配伍是中醫(yī)藥文化的精髓，而藥對(duì)配伍則是復(fù)方的核心[11]。酸棗仁（Ziziphi Spinosae Semen）為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujubaMill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou 的干燥成熟種子，性平，味甘、酸，歸肝、膽、心經(jīng)，有養(yǎng)心補(bǔ)肝、寧心安神、斂汗、生津功能；五味子（Schisandrae Chinensis Fructus）為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實(shí)，性溫，味酸、甘，歸肺、心、腎經(jīng)，主要功效為收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心[12]。兩者均始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[13]，收載于《中華人民共和國(guó)藥典》2020 年版[12]，具有養(yǎng)心安神、收斂固澀之功效，符合“七情和合”的組合原理，作為相須藥對(duì)常用于治療失眠、健忘、焦慮等[14]。本課題組前期研究確定了酸棗仁-五味子藥對(duì)（S-W，2∶1）配伍后的抗焦慮作用[15]，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了初探[14]。但其配伍前與配伍后抗焦慮作用機(jī)制仍需深入研究。因此，本研究利用束縛應(yīng)激（RS）模型大鼠對(duì)酸棗仁、五味子配伍前后藥效學(xué)進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)大鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子含量進(jìn)行測(cè)定；并運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，對(duì)S-W 配伍后治療焦慮癥的關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號(hào)通路進(jìn)行預(yù)測(cè)，以期為S-W 治療焦慮癥的臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)雄性SD 大鼠36只，體質(zhì)量150～170 g，購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，環(huán)境溫度（20～22）℃，相對(duì)濕度為40%～60%，明暗節(jié)律12 h/12 h。實(shí)驗(yàn)前給予大鼠不受限制的標(biāo)準(zhǔn)飼料和潔凈飲用水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案由北京中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審定，符合國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理相關(guān)規(guī)定，審核批準(zhǔn)號(hào)為BUCM-4-2021032201-1027。

1.2 樣品

炒酸棗仁產(chǎn)地河北邢臺(tái)，購(gòu)自河北安國(guó)藥材市場(chǎng)，批號(hào)為20191022，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)石晉麗教授鑒定為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujubaMill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou 的干燥成熟種子。醋五味子產(chǎn)地遼寧，購(gòu)自河北安國(guó)藥材市場(chǎng)，批號(hào)為20190601，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)石晉麗教授鑒定為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實(shí)。

1.3 試藥

0.9 %氯化鈉注射液（石家莊四藥有限公司，批號(hào)：2009222009）；磷酸鹽緩沖液（PBS，武漢市皮諾飛生物科技有限公司，批號(hào)：PN0001）；大鼠5-HT 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒（批號(hào)：MM-0442R2，48T）、大鼠多巴胺（DA）ELISA 試劑盒（批號(hào)：MM-0355R2，48T）、大鼠去甲腎上腺素（NE）ELISA 試劑盒（批號(hào)：JL-13428，48T）、大鼠γ-氨基丁酸（GABA）ELISA 試劑盒（批號(hào)：MM-0441R2，48T）、大鼠谷氨酸（Glu）ELISA 試劑盒（批號(hào)：MM-0601R2，48T）、大鼠促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）ELISA 試劑盒（批號(hào)：MM-0520R2，48T）、大鼠皮質(zhì)酮（CORT）ELISA試劑盒（批號(hào)：MM-0559R2，48T）、大鼠腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）ELISA 試劑盒（批號(hào)：MM-0209R2，48T）均購(gòu)自江蘇寶萊生物科技有限公司；地西泮（DZP，北京益民藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20150305）。

1.4 儀器

RT-6100型酶標(biāo)分析儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）；大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)裝置為北京中醫(yī)藥大學(xué)自制；ZH-DSG 型大鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)裝置（安徽省淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）。

2 方法

2.1 樣品提取

取炒酸棗仁30 g，置于1000 mL圓底燒瓶中，加8倍量80%乙醇浸泡30 min，第1次回流提取1 h，趁熱抽濾；第2 次加10 倍量水回流提取1 h，趁熱抽濾，合并兩次濾液，濃縮，烘干，即得酸棗仁提取物浸膏。取醋五味子30 g，同法制備五味子提取物浸膏。取炒酸棗仁20 g、醋五味子10 g，混合后同法制備酸棗仁-五味子提取物浸膏。

2.2 動(dòng)物模型制備與給藥

將36 只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、DZP組、酸棗仁組、五味子組、S-W 合煎液組，每組6只。應(yīng)用孤養(yǎng)結(jié)合RS 方法建立RS 焦慮大鼠模型。除空白組大鼠外，各組大鼠孤養(yǎng)，每籠1 只，每天上午將每只大鼠束縛于大鼠固定器內(nèi)30 min，不壓迫大鼠，僅使其活動(dòng)受限，并禁食水，束縛完成后釋放回籠，允許自由攝食飲水，不予任何干預(yù)，持續(xù)7 d。酸棗仁組按1.0 g·kg-1灌胃給藥，五味子組按0.5 g·kg-1灌胃給藥，S-W 合煎液組按1.5 g·kg-1灌胃給藥（以上均為生藥量，給藥體積按10 mL·kg-1），DZP組按1.0 mg·kg-1灌胃給藥，空白組和模型組灌服等體積的水。除空白組外，其他各組在灌胃給藥后進(jìn)行束縛造模。第7 天，酸棗仁組、五味子組、S-W 合煎液組、模型組、空白組末次給藥1 h，DZP末次給藥0.5 h 后，進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（OFT）和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)（EPM）[14]。

2.3 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.3.1 OFT OFT 為考察動(dòng)物焦慮樣行為的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)[16]。曠場(chǎng)操作環(huán)境為燈光較暗的安靜場(chǎng)所。曠場(chǎng)大小：長(zhǎng)100 cm，寬100 cm，高50 cm，被均分為25 個(gè)方格，中間的9 個(gè)方格為曠場(chǎng)的中央?yún)^(qū)，其余為邊緣區(qū)。實(shí)驗(yàn)時(shí)先將大鼠放置在空曠的環(huán)境中適應(yīng)5 min，然后將其置于曠場(chǎng)的中央?yún)^(qū)，記錄大鼠在曠場(chǎng)5 min內(nèi)的活動(dòng)情況。檢測(cè)指標(biāo)為大鼠在曠場(chǎng)中進(jìn)入中央?yún)^(qū)的次數(shù)和停留時(shí)間（s）。

2.3.2 EPM EPM 由2 個(gè)開(kāi)臂（長(zhǎng)50.8 cm，寬10.2 cm）與2 個(gè)閉臂（長(zhǎng)50.8 cm，寬10.2 cm）組成，距地面50 cm。開(kāi)始測(cè)試前將每只大鼠放入1 個(gè)45 cm×30 cm×15 cm塑料盒中，任其自由探究，5 min后迅速置于EPM 的中央平臺(tái)處，使其頭部正對(duì)其中1 個(gè)開(kāi)放臂，采用紅外線技術(shù)記錄5 min 內(nèi)大鼠的活動(dòng)情況。觀測(cè)指標(biāo)為進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)/總?cè)氡鄞螖?shù)的百分比（OE%）及開(kāi)臂內(nèi)運(yùn)動(dòng)時(shí)間/（開(kāi)臂+閉臂）總時(shí)間的百分比（OT%）。

2.4 神經(jīng)遞質(zhì)水平及BDNF的檢測(cè)

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，并立即處死大鼠，于冰上迅速分離出大腦雙側(cè)海馬區(qū)、前額葉皮質(zhì)，稱(chēng)質(zhì)量，-80 ℃冰箱凍存。血液樣本4 ℃、15 000 r·min-1離心20 min（離心半徑為15 cm），取上清液按照ELISA試劑盒進(jìn)行CRH和CORT的含量測(cè)定；腦組織樣本進(jìn)行低溫勻漿，4 ℃、15 000 r·min-1離心20 min（離心半徑為15 cm），取上清液按照ELISA 試劑盒進(jìn)行5-HT、DA、NE、GABA、Glu 和BDNF的含量測(cè)定。

2.5 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)S-W抗焦慮機(jī)制

2.5.1 酸棗仁、五味子主要成分及靶點(diǎn)的篩選 應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP）[17]篩選酸棗仁、五味子的化學(xué)成分，篩選條件為口服生物利用度（OB）≥30% 及藥物動(dòng)力學(xué)（ADME）[18]參數(shù)藥物相似性（DL）≥0.18[19]，同時(shí)根據(jù)文獻(xiàn)補(bǔ)充酸棗仁、五味子中的化學(xué)成分；將檢索到的化學(xué)成分進(jìn)行整合并去重，得到最終化學(xué)成分。在PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取化合物對(duì)應(yīng)的SMILES結(jié)構(gòu)，錄入 SwissTargetPrediction（http://www.Swisstargetprediction.ch/）網(wǎng)站，對(duì)酸棗仁、五味子化學(xué)成分的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2.5.2 焦慮癥相關(guān)靶點(diǎn)的收集 應(yīng)用GeneCards（https://www.genecards.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/）、DisGeNET（https://www.disgenet.org/）及OMIM（https://www.omim.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)以“anxiety”為檢索詞獲取relevance score≥10 的靶點(diǎn)。匯總整理去重，得到焦慮癥對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。

2.5.3 藥物與疾病共同靶點(diǎn)的篩選 利用R語(yǔ)言軟件（https://www.r-project.org/）及VennDiagram 2.1.0對(duì)S-W 化學(xué)成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)和焦慮癥的相關(guān)靶點(diǎn)取交集，得到兩者的共同靶點(diǎn)，即S-W 治療焦慮癥的潛在作用靶點(diǎn)。

2.5.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將S-W 治療焦慮癥的潛在作用靶點(diǎn)輸入String（https://string-db.org/cgi/input.pl）數(shù)據(jù)庫(kù)[20]構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，限定物種為人，設(shè)置最小蛋白間相互作用分值為0.7，通過(guò)NetworkAnalyzer 工具進(jìn)行拓?fù)浞治觯鶕?jù)網(wǎng)絡(luò)中基因與鄰接基因的數(shù)目，找出網(wǎng)絡(luò)的核心基因。

2.5.5 基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路富集分析 通過(guò)DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/）對(duì)S-W 治療焦慮癥的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，利用SangerBox（http://sangerbox.com/）平臺(tái)對(duì)排名前20的通路進(jìn)行可視化分析。

2.5.6 藥物-活性成分-疾病-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 運(yùn)用Cystoscape 3.8.0 軟件[21]，將藥物-活性成分-疾病-靶點(diǎn)-通路的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系可視化，進(jìn)一步了解酸棗仁和五味子兩味中藥的活性成分與治療焦慮癥潛在作用靶點(diǎn)的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism6.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，利用單因素方差進(jìn)行多組間比較，Tukey 檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較。各組數(shù)據(jù)均采用（）表示，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 藥效學(xué)評(píng)價(jià)

3.1.1 OFT 結(jié)果 OFT 結(jié)果表明，與空白組相比，RS 可造成大鼠焦慮，與模型組相比，酸棗仁組、五味子組對(duì)大鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)次數(shù)和中央?yún)^(qū)停留時(shí)間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，未顯示出抗焦慮藥效；S-W 在1.5 g·kg-1劑量下可明顯增加RS 大鼠在曠場(chǎng)中進(jìn)入中央?yún)^(qū)的次數(shù)及停留時(shí)間（P<0.05），見(jiàn)表1。

表1 酸棗仁、五味子單藥及配伍后在OFT中對(duì)RS模型大鼠的抗焦慮作用（,n=6）

表1 酸棗仁、五味子單藥及配伍后在OFT中對(duì)RS模型大鼠的抗焦慮作用（,n=6）

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；表2、表3同。

3.1.2 EPM 結(jié)果 EPM 結(jié)果表明，與空白組相比，RS可造成大鼠焦慮，與模型組相比，S-W（1.5 g·kg-1）和酸棗仁（1.0 g·kg-1）組均可顯著增加RS模型大鼠進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)百分比（P<0.01），五味子（0.5 g·kg-1）可明顯增加RS模型大鼠進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)的百分比（P<0.05），見(jiàn)表2。

表2 酸棗仁、五味子單藥及配伍后在EPM中對(duì)RS模型大鼠的抗焦慮作用（,n=6）

表2 酸棗仁、五味子單藥及配伍后在EPM中對(duì)RS模型大鼠的抗焦慮作用（,n=6）

3.1.3 S-W 對(duì)RS 模型大鼠血清及腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的影響 酸棗仁、五味子單藥及配伍給藥對(duì)RS模型大鼠雙側(cè)海馬中5-HT、DA、NE、BDNF 含量影響結(jié)果表明，與空白組相比，RS 模型大鼠雙側(cè)海馬中5-HT 和NE 含量都顯著升高（P<0.01），DA 和BDNF含量顯著降低（P<0.01）。與模型組相比，DZP 可顯著降低RS 模型大鼠海馬區(qū)5-HT 含量（P<0.01）和NE 含量（P<0.05）。酸棗仁可顯著降低RS 模型大鼠海馬區(qū)5-HT 和NE 含量（P<0.01），顯著升高DA和BDNF含量（P<0.01）。五味子可顯著升高RS模型大鼠海馬區(qū)DA 含量（P<0.01）。S-W 配伍可明顯降低RS模型大鼠海馬區(qū)5-HT含量（P<0.05），明顯增加DA（P<0.05）和BDNF 含 量（P<0.01），見(jiàn)表3。

表3 酸棗仁、五味子單藥及配伍后對(duì)RS模型大鼠各指標(biāo)含量影響（,n=6）

表3 酸棗仁、五味子單藥及配伍后對(duì)RS模型大鼠各指標(biāo)含量影響（,n=6）

酸棗仁、五味子單藥及配伍給藥對(duì)RS模型大鼠前額葉皮質(zhì)中GABA、Glu、Glu/GABA 含量影響結(jié)果表明，與空白組相比，RS 模型大鼠前額葉皮質(zhì)中GABA 含量顯著下降（P<0.01），Glu/GABA 水平顯著升高（P<0.01）。與模型組相比，DZP 可顯著升高RS 模型大鼠前額葉皮質(zhì)GABA 含量（P<0.01），可明顯降低Glu/GABA水平（P<0.05）。酸棗仁可明顯升高RS 模型大鼠前額葉皮質(zhì)中GABA 含量（P<0.05），明顯降低RS 模型大鼠Glu/GABA 水平（P<0.05）。S-W 配伍對(duì)RS 模型大鼠前額葉皮質(zhì)中GABA 和Glu 含量、Glu/GABA 水平無(wú)顯著意義，見(jiàn)表3。

酸棗仁、五味子單藥及配伍給藥對(duì)RS模型大鼠血清中CRH、CORT 含量影響結(jié)果表明，與空白組相比，RS 模型大鼠血清中CRH 含量明顯升高（P<0.05）、CORT 含量顯著升高（P<0.01），提示RS 模型大鼠的HPA 軸功能亢進(jìn)。DZP 可明顯降低RS 模型大鼠血清CORT含量（P<0.05）。酸棗仁可明顯降低RS模型大鼠血清CRH 含量（P<0.05），顯著降低RS 模型大鼠血清CORT（P<0.01）。五味子對(duì)RS 模型大鼠血清CRH 和CORT 含量變化無(wú)顯著意義。SW 配伍對(duì)RS 模型大鼠亢進(jìn)的HPA 軸的作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3。

3.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果

3.2.1 S-W的活性成分及治療焦慮癥的潛在靶點(diǎn) 通過(guò)檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（OB≥30%，DL≥0.18），得到酸棗仁6 個(gè)化合物，五味子7 個(gè)化合物，共13 個(gè)化合物，見(jiàn)表4。利用SwissTargetPrediction 平臺(tái)預(yù)測(cè)出酸棗仁潛在靶點(diǎn)423 個(gè)，五味子潛在靶點(diǎn)449 個(gè)。通過(guò)GeneCards、TTD、DisGeNET 及OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)收集去重，得到與焦慮癥相關(guān)的1318 個(gè)作用靶點(diǎn)。R 語(yǔ)言軟件對(duì)S-W 化學(xué)成分和焦慮癥的相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行分析，獲得148個(gè)治療焦慮癥的潛在作用靶點(diǎn)。

表4 酸棗仁、五味子的主要活性成分信息

3.2.2 共同靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用STRING 平臺(tái)構(gòu)建S-W 治療焦慮癥潛在靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖1。圖1 中S-W 與焦慮癥潛在靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)中有148 個(gè)節(jié)點(diǎn)，1068 條邊，平均degree值為14.4。通過(guò)NetworkAnalyzer進(jìn)行拓?fù)浞治觯鶕?jù)degree排序，選取分值>平均分的基因作為關(guān)鍵靶點(diǎn)，S-W 中篩選出66個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，分析前20個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)中degree>25 的靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，Akt絲氨酸/蘇氨酸激酶1（Akt1）、腫瘤壞死因子（TNF）、鈉依賴型5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（SLC6A4）、鈉依賴型多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（SLC6A3）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、雌激素受體1（ESR1）、熱激蛋白家族（HSP90AA1）、細(xì)胞周期蛋白D1（CCND1）、多巴胺受體D2（DRD2）、雷帕霉素激酶的機(jī)制靶點(diǎn)（MTOR）等可能是S-W治療焦慮癥的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖1 酸棗仁-五味子與焦慮共同靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

3.2.3 GO 富集分析 應(yīng)用DAVID 對(duì)S-W 化學(xué)成分和焦慮癥相關(guān)的148個(gè)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO 的生物過(guò)程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cell component，CC）、分子功能（molecular function，MF）富集，引用String 數(shù)據(jù)庫(kù)，將校正P值<0.05的項(xiàng)目進(jìn)行篩選。

S-W-焦慮癥相關(guān)靶點(diǎn)總共富集到1700 條生物過(guò)程，111 項(xiàng)細(xì)胞組成相關(guān)，162 項(xiàng)分子功能相關(guān)。對(duì)排名前10 的GO 條目進(jìn)行可視化處理，結(jié)果見(jiàn)圖2。BP 主要包括膜電位調(diào)節(jié)、G 蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路、血液循環(huán)調(diào)節(jié)過(guò)程等；CC 主要涉及突觸前膜、突觸后膜等；MF主要涉及神經(jīng)遞質(zhì)受體活動(dòng)、G 蛋白偶聯(lián)受體活動(dòng)和配體門(mén)控離子通道活性等。

圖2 酸棗仁-五味子與焦慮癥相關(guān)靶點(diǎn)基因GO富集

3.2.4 KEGG 富集分析 在KEGG 通路富集分析中，得到103條通路（P≤0.001），利用SangerBox分析平臺(tái)對(duì)前20 條信號(hào)通路進(jìn)行可視化處理，結(jié)果見(jiàn)圖3。通過(guò)分析KEGG 信號(hào)富集通路，發(fā)現(xiàn)S-W 配伍后，主要涉及神經(jīng)遞質(zhì)配體-受體相互作用通路、鈣信號(hào)通路、環(huán)磷酸腺苷（cAMP）信號(hào)通路、血清素神經(jīng)突觸、環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷酸-環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷酸效應(yīng)蛋白激酶G（cGMP-PKG）信號(hào)通路等。結(jié)果表明S-W化學(xué)成分主要分布于多條代謝通路，通過(guò)它們之間的相互協(xié)調(diào)作用，發(fā)揮調(diào)控體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平[22]和激素水平[23]作用來(lái)治療焦慮癥。

圖3 酸棗仁-五味子與焦慮癥靶點(diǎn)基因KEGG信號(hào)通路富集分析

3.2.5 藥物-活性成分-疾病-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 根據(jù)KEGG 富集分析得到的結(jié)果，篩選出與治療焦慮癥最相關(guān)的通路，并將其與酸棗仁、五味子活性成分和治療焦慮癥的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0，構(gòu)建酸棗仁-五味子-活性成分-疾病-靶點(diǎn)-通路互作網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖4。

圖4 酸棗仁-五味子-活性成分-疾病-靶點(diǎn)-通路互作網(wǎng)絡(luò)

圖4為酸棗仁-五味子-活性成分-疾病-靶點(diǎn)-通路的可視化網(wǎng)絡(luò)圖，該網(wǎng)絡(luò)包含13 種化學(xué)成分、148個(gè)作用靶點(diǎn)及20條重要通路。利用NetworkAanlyzer插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的成分進(jìn)行分析，根據(jù)degree 值排序得到S-W 治療焦慮癥的化學(xué)成分主要為酸棗仁堿、當(dāng)藥黃素、胡蘿卜甾醇、五味子乙素、五味子丙素、戈米辛A 等，這些成分作用的靶點(diǎn)有AKT1、TNF、SLC6A4、SLC6A3、EGFR、ESR1、HSP90AA1、CCND1、DRD2 等；這些靶點(diǎn)主要集中在神經(jīng)遞質(zhì)配體-受體相互作用通路、含血清素神經(jīng)突觸信號(hào)通路、cAMP 信號(hào)通路、cGMP-PKG 信號(hào)通路等信號(hào)通路中。S-W 中的每個(gè)化學(xué)成分都對(duì)應(yīng)著多個(gè)靶點(diǎn)及通路，進(jìn)一步證明S-W 是通過(guò)多組分、多靶點(diǎn)的協(xié)同作用來(lái)治療焦慮癥。

4 討論

焦慮癥是一種常見(jiàn)的精神障礙性疾病，可損害患者的記憶、智能和社會(huì)活動(dòng)功能，對(duì)其日常生活有較大影響。酸棗仁和五味子配伍具有明顯的鎮(zhèn)靜、催眠作用，可以有效地改善睡眠。本研究在RS焦慮大鼠模型基礎(chǔ)上，通過(guò)OFT 和EPM 兩經(jīng)典行為學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了S-W 配伍前后治療焦慮癥的藥效。進(jìn)一步探究了S-W 對(duì)大鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)，血清中CRH、CORT 的影響，這一結(jié)論在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析中得到了驗(yàn)證。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示，S-W 配伍后，其治療焦慮癥的關(guān)鍵靶點(diǎn)涉及148 個(gè)；關(guān)鍵通路包括神經(jīng)遞質(zhì)配體-受體相互作用通路、含血清素神經(jīng)突觸信號(hào)通路、cAMP 信號(hào)通路、cGMP-PKG 信號(hào)通路，也有與激素調(diào)節(jié)相關(guān)的通路，如雌激素信號(hào)通路、促性腺激素分泌通路、催乳激素信號(hào)通路等。表明S-W 配伍后治療焦慮癥是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)的相互調(diào)節(jié)作用實(shí)現(xiàn)的。

4.1 S-W配伍后治療焦慮癥的關(guān)鍵靶點(diǎn)分析

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，酸棗仁、五味子配伍后靶點(diǎn)主要集中于Akt1、TNF、SLC6A4、SLC6A3、DRD2 等。Akt/蛋白激酶B 信號(hào)作用通道調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，參與的細(xì)胞過(guò)程包括細(xì)胞凋亡和葡萄糖代謝。Akt 的激活需要PI3K 的活化，PI3K-Akt 通路在改善焦慮抑郁中具有重要作用[24]。TNF-α是一種具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，具有殺傷腫瘤細(xì)胞、介導(dǎo)炎性反應(yīng)、參與免疫調(diào)節(jié)、抑制脂蛋白脂質(zhì)活性等作用[25]。相關(guān)研究顯示，TNF-α與焦慮癥相關(guān)[26-27]，其可通過(guò)下丘腦-垂體-腎上腺軸系統(tǒng)促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素的釋放，從而引起神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂，促進(jìn)焦慮抑郁的發(fā)生[28]。SLC6A4 基因可編碼5-HT 轉(zhuǎn)運(yùn)體，SLC6A3 可編碼多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在應(yīng)激反應(yīng)中，5-HT2A受體表達(dá)升高會(huì)增進(jìn)動(dòng)物焦慮和抑郁樣行為，當(dāng)其下調(diào)后癥狀明顯減輕[29-30]。多巴胺能突觸參與腦內(nèi)DA 的合成，DA在愉快感覺(jué)的產(chǎn)生、傳遞及愉快信息的存儲(chǔ)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。相應(yīng)膜受體激活是DA 發(fā)揮作用的關(guān)鍵，DA 受體可分成DRD1 和DRD2 兩類(lèi)。當(dāng)DRD2 被激活后，細(xì)胞內(nèi)cAMP 水平降低，DRD2的表達(dá)明顯升高不但抑制cAMP的產(chǎn)生而且也影響DA生成，進(jìn)而導(dǎo)致抑郁焦慮的發(fā)生[31]。

4.2 S-W配伍后治療焦慮癥的關(guān)鍵通路分析

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究顯示，S-W 配伍后治療焦慮癥的關(guān)鍵通路主要集中在神經(jīng)遞質(zhì)配體-受體相互作用通路、含血清素神經(jīng)突觸信號(hào)通路、cAMP 信號(hào)通路等信號(hào)通路中。神經(jīng)遞質(zhì)配體-受體相互作用通路是酸棗仁、五味子配伍后最重要的通路，該通路與相應(yīng)的受體結(jié)合后可參與機(jī)體的生理節(jié)律、情緒、學(xué)習(xí)和記憶等生物功能的調(diào)節(jié)，如與Drd5 受體結(jié)合，可參與認(rèn)知、情感以及運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)，緩解焦慮情緒和運(yùn)動(dòng)障礙[32]。含血清素神經(jīng)突觸信號(hào)通路（也叫5-HT 能突觸通路）也是酸棗仁、五味子配伍后抗焦慮的主要通路。5-HT 廣泛存在于與焦慮相關(guān)的腦區(qū)，特別是下丘腦隔區(qū)和杏仁核[33]。從背縫核發(fā)出止于杏仁核和額葉皮質(zhì)的5-HT能神經(jīng)通路，已被公認(rèn)參與條件性恐懼，背側(cè)中縫核能抑制焦慮特有的適應(yīng)行為[33]。cAMP 信號(hào)通路又稱(chēng)PKA 系統(tǒng)，該通路在抗焦慮作用中有著重要的作用。其下游PI3K-Akt 通路，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[34]，尤其是焦慮抑郁關(guān)系密切[35]；該通路具有胰島素受體底物（IRS1）、糖原合成酶激酶3（GSK3）等與代謝功能相關(guān)的下游蛋白，和一系列與翻譯、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、血管生成相關(guān)的下游蛋白，與學(xué)習(xí)記憶有著密切的聯(lián)系，且與BDNF 雙向調(diào)節(jié)，與CREB、原肌球蛋白受體激酶B（TrkB）等蛋白一起構(gòu)成一個(gè)閉合回路，即PI3K-Akt-pCREB-BDNF-TrkB-PI3K回路[36]。由于BDNF 與CREB 之間的雙向調(diào)控作用[37]，BDNF 在MAPK-ERK 和PI3K-Akt 通路中，都發(fā)揮著重要作用。本研究結(jié)果中，酸棗仁可顯著升高RS 模型大鼠海馬區(qū)BDNF 含量，S-W 配伍后也可顯著升高RS 模型大鼠海馬區(qū)BDNF 含量。結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，表明大鼠海馬區(qū)BDNF 也是S-W配伍前后發(fā)揮抗焦慮作用的重要靶標(biāo)。

綜上所述，本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行藥效學(xué)觀察，并通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩選出了酸棗仁、五味子配伍后治療焦慮癥的主要化學(xué)成分，預(yù)測(cè)了關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號(hào)通路。本研究為S-W 治療焦慮癥的臨床應(yīng)用及進(jìn)一步藥理機(jī)制研究提供了參考依據(jù)。