藏族藥甘青青蘭不同花色花朵的代謝組學(xué)分析△

趙翔，賽曼*，張艷鵬，于曉銳，王勇，蘭世超，申振，段亞玲

1.西藏自治區(qū)藏醫(yī)院 生藥研究所，西藏 拉薩 850000；2.道地藥材國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100700；3.西南林業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院，云南 昆明 650224；4.貴州大學(xué) 精細(xì)化工研究開(kāi)發(fā)中心，貴州 貴陽(yáng) 550025；5.貴州師范學(xué)院 生物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550018；6.貴州省分析測(cè)試研究院，貴州 貴陽(yáng) 550014

甘青青蘭Dracocephalum tanguticumMaxim.屬唇形科（Lamiaceae）青蘭屬（DracocephalumL.）多年生草本植物[1]，俗名則羊古、隴塞青蘭、唐古特青蘭，分布于西藏、青海、四川和甘肅等地[2]，喜干燥環(huán)境，主要生長(zhǎng)在海拔1900～4000 m 的河谷岸、田野、草灘或林邊等[2-9]。據(jù)記載，甘青青蘭味甘、苦，可清膽熱、止血、愈瘡、燥黃水[10]，陰陽(yáng)兩坡均生，花及葉皆蘭色[11]，藏族醫(yī)常用其地上部分入藥，在民間亦將其作為香料使用[12]，具有抗氧化、保護(hù)心臟、抑菌、抗炎、抗病毒等功效，常用于治療胃炎、氣管炎、黃疸性肝炎、頭暈、神疲、關(guān)節(jié)炎及癤瘡等[2,13-17]。

資料顯示，甘青青蘭（原變種）、矮生變種及灰毛變種僅存在1 種花色，其花冠為紫藍(lán)色至暗紫藍(lán)色，并未發(fā)現(xiàn)其他顏色[1]。但經(jīng)實(shí)地考察發(fā)現(xiàn)，除了記載的正?；ㄉ纤{(lán)色外，還存在粉色花，且2 種花色差異明顯，目測(cè)可辨。顏色出現(xiàn)差異主要源于其代謝產(chǎn)物，如黃酮苷，是紫藍(lán)色和粉色的顏色來(lái)源，黃酮類(lèi)結(jié)構(gòu)含有重要的生色基團(tuán)，生色基團(tuán)與黃酮苷元耦合產(chǎn)生顏色的差異[18-19]。同時(shí)，中藥藥效與其代謝產(chǎn)物有密切關(guān)系[20-22]。近年來(lái)，在甘青青蘭有效成分提取及其功效研究方面已取得顯著進(jìn)展[1,4,7,9,22-33]，然而關(guān)于其花色與生藥藥性的相關(guān)性研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

代謝組學(xué)主要分為靶向代謝組學(xué)和非靶向代謝組學(xué)[34-35]。目前非靶向代謝組學(xué)的應(yīng)用比較普遍，可以全面分析生物體內(nèi)代謝物種類(lèi)，但是其存在準(zhǔn)確度、特異性缺乏等缺點(diǎn)。靶向代謝組學(xué)利用前期建立的各種代謝物數(shù)據(jù)庫(kù)并結(jié)合多種代謝通路，對(duì)目標(biāo)代謝物進(jìn)行定量分析，準(zhǔn)確度高、特異性強(qiáng)，能夠彌補(bǔ)非靶向代謝組學(xué)的不足[36-38]。代謝組學(xué)提供的眾多的潛在生物標(biāo)志物及其代謝網(wǎng)絡(luò)為表征“傳統(tǒng)藥物的成分巨系統(tǒng)”作用于“機(jī)體巨系統(tǒng)”的有效性和作用機(jī)制提供了一個(gè)可能的思路。因此開(kāi)展甘青青蘭不同花色花朵的比較代謝組學(xué)研究有重要意義。本研究以2 種不同花色的甘青青蘭為材料，利用非靶向代謝組學(xué)分析不同花色花朵中代謝物的差異，并對(duì)差異代謝通路進(jìn)行富集，初步明確形成不同花色的原因及產(chǎn)生花色差異的代謝物和通路。

1 材料

1.1 樣品

甘青青蘭樣品于2022 年8 月采自西藏自治區(qū)瀕危藏藥材人工種植研究基地（E91°15'6.19″，N29°37'14.55″），采集同一范圍內(nèi)植株（50 m×50 m），保證其生境的相似性，減少環(huán)境因素影響。隨機(jī)選取2019 年種植的6 株處于盛花期、生長(zhǎng)狀況基本一致的甘青青蘭植株，采集花朵，清理灰塵及雜質(zhì)，將處理完成的潔凈樣品依據(jù)顏色分開(kāi)，用錫箔紙封裝標(biāo)記，迅速置于液氮中，處理時(shí)間30 min。處理完成后的樣品放置于-80 ℃超低溫冰箱，備用。轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中采用足量干冰以保持恒定溫度，以避免樣品產(chǎn)生劇烈物質(zhì)變化。

對(duì)樣品顏色進(jìn)行定性比較，第1 組顏色鑒定為紫藍(lán)色，編號(hào)為Z1～Z3；第2 組顏色確定為粉色，編號(hào)為F1～F3。所有樣品經(jīng)西藏自治區(qū)藏醫(yī)院達(dá)娃頓珠副主任藥師鑒定為甘青青蘭Dracocephalum tanguticumMaxim.的花。

1.2 儀器與試劑

SQP型電子天平 [賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；SG9200HDT 型超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司）；DW-86L829BPT型醫(yī)用低溫保存箱（青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司）；BL-200SM300L 型防爆冰箱（廣東安菲環(huán)?？萍加邢薰荆籘issuelyser-24L 型高通量組織研磨儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；5430R 型高速冷凍離心機(jī)（艾本德中國(guó)有限公司）；超高效液相色譜聯(lián)用四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜（UPLC-Q-Exactive-MS/MS）儀 [賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]；甲醇、乙腈、甲酸均購(gòu)自美國(guó)Fisher Chemical 公司；屈臣氏超純水；2-氯-苯丙氨酸（上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%，批號(hào)：J15J7E9147）。

2 方法

2.1 樣品制備

精確稱(chēng)取樣品100 mg，放置于2 mL 離心管中，液氮預(yù)冷，高通量組織研磨儀研磨，研磨充分后，加入提取液 [甲醇-乙腈-水（2∶2∶1）]，含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)2-氯-苯丙氨酸（0.1 mg·mL-1）。隨后進(jìn)行渦旋、振蕩，超聲處理。4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min（離心半徑為10 cm），取上清液，過(guò)0.22 μm 濾膜，置于2 mL 棕色液相進(jìn)樣瓶中，通過(guò)UPLC-QExactive-MS/MS 進(jìn)行分析。所有樣品提取物在分析期間均保存在4 ℃條件下，同時(shí)，將所有樣本的提取液等比例混合作為質(zhì)量控制（QC）樣本，每6 個(gè)檢測(cè)樣本插入1個(gè)QC 樣本進(jìn)行檢測(cè)，以監(jiān)測(cè)儀器分析的穩(wěn)定性。

2.2 UPLC-Q-Exactive-MS/MS分析條件

色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～11.0 min，95%～5%A；11.0～12.0 min，5%A；12.0～12.1 min，5%～95%A；12.1～15.0 min，95%A）；流速為0.4 mL·min-1；進(jìn)樣量為5 μL；柱溫為40 ℃。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），正、負(fù)離子模式，掃描質(zhì)量范圍為m/z70～1050，ESI 加熱溫度為500 ℃，離子源Gas1 和Gas2 壓力分別為50、50 psi（1 psi≈6.895 kPa），Curtain Gas 壓力為30 psi，離子噴霧電壓浮動(dòng)（ISVF）在負(fù)離子模式下為-3 kV，在正離子模式下為3 kV，MS/MS 去簇電壓為80 V，碰撞能量（CE）為20～60 eV。

2.3 代謝物鑒定

經(jīng)UPLC-Q-Exactive-MS/MS 檢測(cè)后，將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入代謝組學(xué)處理軟件Progenesis QI v2.0.5542進(jìn)行基線(xiàn)過(guò)濾、峰識(shí)別、積分、tR校正、峰對(duì)齊，最終得到1 個(gè)tR、m/z和峰強(qiáng)度的數(shù)據(jù)矩陣。保留至少1 組樣品中非零值80%以上的變量；對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行缺失值填充值（原始矩陣中最小值填補(bǔ)空缺值）；對(duì)總峰進(jìn)行歸一化處理，并刪除QC 樣本RSD≥30%的變量；對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換得到最終用于后續(xù)分析的數(shù)據(jù)矩陣。利用精確的質(zhì)譜、質(zhì)譜片段譜和同位素比值差在人體代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)（HMDB，https://hmdb.ca）中進(jìn)行搜索鑒定。

2.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用主成分分析（PCA）觀(guān)察各樣品之間的總體分布和組間的離散程度，推測(cè)組內(nèi)樣本的相似性和組間樣本的差異性。采用正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）區(qū)分各組間代謝輪廓的總體差異，根據(jù)P值（P<0.01）和log2FC（FC 為差異倍數(shù)）值篩選組間的差異代謝物。

2.5 差異代謝物通路分析

將差異代謝物注釋到京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG，http://www.genome.jp/kegg/）、人類(lèi)代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)（HMDB，https://hmdb.ca）和小分子通路數(shù)據(jù)庫(kù)（SMPDB，http://smpdb.ca/），獲得代謝物在數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋信息，利用MetaboAnalyst（https://www.metaboanalyst.ca）進(jìn)行差異代謝物的代謝途徑和富集情況表征，并統(tǒng)計(jì)其在數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋情況。

3 結(jié)果與分析

3.1 顏色差異

花朵顏色是植物重要且基礎(chǔ)的理化特征之一，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育起到重要作用，對(duì)于植物的生殖生長(zhǎng)、抵御外界環(huán)境脅迫、引誘害蟲(chóng)天敵均具有重要作用。根據(jù)顏色比對(duì)分析，可以看出甘青青蘭花朵顏色存在顯著差異（圖1），通過(guò)植物照片可以看出，兩者之間除了花朵顏色差異外，花瓣形狀和大小、苞片和輪傘花序及形成的間斷穗狀花序類(lèi)型基本無(wú)差異。

圖1 不同顏色的甘青青蘭花

3.2 代謝物的鑒定

甘青青蘭樣本檢測(cè)完成的數(shù)據(jù)經(jīng)Progenesis QI軟件分析處理，并經(jīng)過(guò)HMDB 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜庫(kù)鑒定分析，在正、負(fù)離子模式下共鑒定得到560 個(gè)代謝物?；贖MDB 分析，甘青青蘭中的代謝物主要包括脂類(lèi)和類(lèi)脂類(lèi)223 個(gè)、含氧有機(jī)物77 個(gè)、苯丙素和聚酮76 個(gè)、有機(jī)雜環(huán)化合物74 個(gè)、有機(jī)酸及其衍生物59 個(gè)、苯環(huán)衍生物31 個(gè)、含氮有機(jī)物10 個(gè)、核苷/核苷酸和類(lèi)似物4 個(gè)、木脂素/新木脂素及相關(guān)化合物4 個(gè)、烴類(lèi)衍生物1 個(gè)、生物堿及其衍生物1 個(gè)。樣本中占比最高的為脂類(lèi)和類(lèi)脂類(lèi)（39.82%），其次為含氧有機(jī)物類(lèi)（10.54%）、苯丙素和聚酮類(lèi)、有機(jī)雜環(huán)化合物，其他包括有機(jī)酸及其衍生物、苯環(huán)衍生物及含氮有機(jī)物等占比較少。

通過(guò)對(duì)化合物進(jìn)行具體分析發(fā)現(xiàn)，在紫藍(lán)色花中含量排名前10 位的化合物為刺槐素-7-[芹糖基-(1→6) -葡萄糖苷] {acacetin-7-[apiosyl-(1→6) -glucoside]，圖2}、L-2-氨基-3-亞甲基己酸（L-2-amino-3-methylenehexanoic acid）、藥芹二糖苷B（graveobioside B）、L-組氨醇（L-histidinol）、棕櫚酸（palmitic acid）、N1,N10-二香豆酰基亞精胺（N1,N10-dicoumaroylspermidine，圖2）、芹菜苷（apiin）、苯基膦酸（phenylphosphonic acid）、鹿花菌素（gyromitrin）、xi-10-羥基十八烷酸（xi-10-hydroxyoctadecanoic acid）。在粉色花中含量前10 位的化合物為N1,N10-二香豆?；鶃喚贰⒋袒彼?7-[ 芹糖基-(1→6) -葡萄糖苷]、藥芹二糖苷B（graveobioside B）、L-2-氨基-3-亞甲基己酸、羥基洋艾烯內(nèi)酯（hydroxypelenolide）、L-組氨醇、黃麻脂肪酸F（corchorifatty acid F）、棕櫚酸、蓖麻油酸（ricinoleic acid）和日當(dāng)藥黃素（swertiajaponin）。

圖2 不同顏色甘青青蘭花中代表性化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)

不同花色花朵樣本中共有的化合物為刺槐素-7-[芹糖基-(1→6)-葡萄糖苷]、L-2-氨基-3-亞甲基己酸、藥芹二糖苷B、L-組氨醇、棕櫚酸和N1,N10-二香豆酰基亞精胺。

3.3 代謝物的相關(guān)性分析

為了了解不同顏色甘青青蘭樣品之間代謝物的變異程度，依據(jù)不同樣本間代謝物表達(dá)情況對(duì)樣本進(jìn)行PCA，結(jié)果見(jiàn)圖3。紫藍(lán)色花和粉色花的代謝數(shù)據(jù)矩陣見(jiàn)圖3A。經(jīng)過(guò)Hotelling 的T2分析，確定所有樣本均分布在95%置信區(qū)間內(nèi)（圖3B）。在PCA圖的6 個(gè)主成分解釋了總方差值的94.05%，而第1個(gè)主成分方差貢獻(xiàn)率高達(dá)50.28%，可對(duì)不同花色花朵樣本進(jìn)行區(qū)分（圖3C）。在PCA圖中，2個(gè)分析組和QC 組分離良好，且樣本之間分離度很好，表明這些組之間的代謝存在顯著差異（圖3A）。此外，QC樣本的不同生物學(xué)重復(fù)樣品緊密聚集在一起，表明分析過(guò)程中系統(tǒng)穩(wěn)定性好、分析可靠性高。圖3D系統(tǒng)評(píng)價(jià)了各組內(nèi)代謝物的成分和含量分布，紫藍(lán)色花組和粉色花組組內(nèi)顯示出明顯的組聚類(lèi)趨勢(shì)，組間個(gè)體代謝物分布的顯著差異表明紫藍(lán)色花和粉色花之間存在顯著的生物學(xué)差異。本研究中應(yīng)用的儀器分析穩(wěn)定可靠，得到的代謝物數(shù)據(jù)矩陣可用于后續(xù)分析。

圖3 不同顏色甘青青蘭花中代謝物的PCA得分

3.4 甘青青蘭代謝物的OPLS-DA

依據(jù)前述結(jié)果對(duì)所得數(shù)據(jù)模型進(jìn)行OPLS-DA，使用OPLS-DA 可以使樣本之間的微小差異最大化，以利于篩選差異代謝物。在OPLS-DA 中（圖4），R2和模型預(yù)測(cè)能力（Q2）越接近1，模型擬合精度越高，反之亦然。根據(jù)圖4 可知，左側(cè)的R2和Q2的模擬值小于右上角的原始模型，表明原始模型是有效和可靠的，且未過(guò)度擬合。由這些結(jié)果表明，OPLS-DA 模型具有很好的預(yù)測(cè)能力，可用于進(jìn)一步篩選差異代謝物。

圖4 不同顏色甘青青蘭花中代謝物的OPLS-DA置換檢驗(yàn)

3.5 甘青青蘭顯著性差異代謝物的分析

甘青青蘭不同花色代謝組學(xué)樣本相關(guān)性熱圖和差異代謝物火山圖見(jiàn)圖5。對(duì)不同顏色花朵的甘青青蘭樣本檢測(cè)所得的560 個(gè)代謝物進(jìn)行相關(guān)性熱圖表征。圖5A 中每個(gè)色條表示2 個(gè)樣本之間的相關(guān)性，不同顏色代表樣本間相關(guān)系數(shù)的相對(duì)大小，聚類(lèi)長(zhǎng)度表示樣本間相對(duì)距離的遠(yuǎn)近，同一聚類(lèi)樹(shù)上的樣本相似性更接近。依據(jù)樣本相關(guān)性聚類(lèi)熱圖可以看出，紫藍(lán)色花組和粉色花組之間代謝物積累模式存在明顯變化，但組內(nèi)無(wú)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5A）。根據(jù)火山圖（圖5B）對(duì)560 個(gè)代謝物進(jìn)行差異分析和表征，上調(diào)代謝物為120個(gè)，下調(diào)代謝物為59個(gè)，其余差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖5 不同顏色甘青青蘭花中代謝物聚類(lèi)熱圖和差異代謝物火山圖

3.6 甘青青蘭差異代謝物代謝途徑和富集分析

對(duì)紫藍(lán)色花和粉色花甘青青蘭樣品鑒定出的179 個(gè)差異代謝物進(jìn)行進(jìn)一步篩選分析，設(shè)置篩選條件為變量重要性投影（VIP）值>1，且P<0.01，數(shù)據(jù)經(jīng)Progenesis QI 處理，并經(jīng)過(guò)HMDB 數(shù)據(jù)庫(kù)搜庫(kù)鑒定分析，共篩選出33個(gè)差異代謝物（圖6）。這些差異代謝物中上調(diào)代謝物20 個(gè)，下調(diào)代謝物13個(gè)。

圖6 不同顏色甘青青蘭花中33個(gè)差異代謝物

將33 個(gè)差異代謝成分進(jìn)行KEGG 通路富集分析，其主要富集到苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成；泛醌和其他萜類(lèi)化合物-醌生物合成；不飽和脂肪酸的生物合成；酪氨酸代謝；嘌呤代謝5 條代謝通路（圖7A）。通路富集主要與氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸有關(guān)，這三者與色素生成有關(guān)[39]。其中，酪氨酸酶是色素細(xì)胞中黑色素生物合成的關(guān)鍵和限速酶[40]，苯丙氨酸在體內(nèi)可以在苯丙氨酸羥基酶的催化下轉(zhuǎn)化為酪氨酸。并且，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸屬于結(jié)構(gòu)和化學(xué)特征相似的芳香族氨基酸，表明這3 個(gè)氨基酸之間可能存在代謝上的交互作用。證明了紫藍(lán)色花與粉色花甘青青蘭樣本相比，其色素相關(guān)代謝通路存在差異，佐證了顏色差異的來(lái)源。同時(shí)，差異通路富集到含有不飽和結(jié)構(gòu)和共軛結(jié)構(gòu)，推測(cè)這些代謝物可能與花色顏色差異有關(guān)[41-42]。

圖7 不同顏色甘青青蘭花中差異代謝物的代謝通路富集

基于SMPDB 藥物途徑代謝物數(shù)據(jù)庫(kù)，將33 個(gè)代謝物進(jìn)行注釋和富集（圖7B）分析，其主要富集到依普利酮作用途徑、雙硫侖作用途徑、巰嘌呤作用途徑、硫鳥(niǎo)嘌呤作用途徑、硫唑嘌呤作用途徑。依普利酮作用途徑和雙硫侖作用途徑富集率較高，表明其花色差異可能與功效[43]存在一定關(guān)聯(lián)。

4 討論與結(jié)論

本研究采用UPLC-Q-Exactive-MS/MS 結(jié)合PCA和OPLS-DA 等統(tǒng)計(jì)分析方法，對(duì)甘青青蘭不同花色的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分析比較。研究結(jié)果表明，6個(gè)甘青青蘭樣品在正、負(fù)2 個(gè)離子模式下共定性得到560 個(gè)代謝物，歸為11 類(lèi)，其中脂類(lèi)和類(lèi)脂類(lèi)分子最為豐富。紫藍(lán)色花和粉色花中相對(duì)含量最高的代謝物分別為刺槐素-7-[芹糖基-(1→6)-葡萄糖苷] 和N1,N10-二香豆?；鶃喚贰Ｆ涔灿谐煞肿貦八崾且环N飽和脂肪酸，是血液中含量最高的游離脂肪酸[44]，通過(guò)激活蛋白磷酸酶2A（PP2A）減少內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（eNOS）Ser1177磷酸化、降低eNOS活性及細(xì)胞內(nèi)NO含量[45]。芹菜苷是芹菜中芹菜素的主要存在形式之一，具有緩解結(jié)腸炎的效果[46]。紫藍(lán)色花和粉色花的代謝物存在顯著差異，從2 種不同顏色的花中共鑒定出差異代謝物33 個(gè)，與粉色花相比，紫藍(lán)色花中共有20個(gè)代謝物上調(diào)，13個(gè)代謝物下調(diào)。KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)差異代謝物被富集到縮醛磷脂合成、苯丙氨酸和酪氨酸代謝、長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸的線(xiàn)粒體β-氧化、酪氨酸代謝、嘌呤代謝5 個(gè)代謝通路中，相關(guān)通路富集到的差異成分[39,42]與其不飽和結(jié)構(gòu)[41]可能與顏色差異有關(guān)?；赟MPDB 藥物途徑代謝物數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋和富集，其主要富集到依普利酮、雙硫侖、巰嘌呤、硫鳥(niǎo)嘌呤、硫唑嘌呤等作用途徑，依普利酮作用途徑富集率最高。依普利酮是鹽皮質(zhì)激素受體（MR）拮抗劑，可有效降低高血壓等心血管疾病[43]。這也說(shuō)明了紫藍(lán)色花和粉色花的甘青青蘭存在一定的功效差異，后期可通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。