氧化-堿化聯合活化腐植酸機制及其對氮素利用率的影響

沈玉文 李國棟 林海濤 高文勝 劉兆輝*

1 養分資源高效利用全國重點實驗室，農業農村部廢棄物基質化利用重點實驗室，山東省環保肥料工程技術研究中心，山東省農業科學院農業資源與環境研究所 濟南 250100

2 山東省農業技術推廣中心 濟南 250014

近年來，為了提高風化煤中腐植酸的提取效率，并賦予腐植酸鹽其他功能，有研究者對活化技術做了進一步改進，如采用氫氧化鈉和尿素為活化劑制成的腐植酸脲溶液對肥料進行包膜來制備緩控釋肥料[1]，不但顯著提高了腐植酸的提取率，而且大大降低了氫氧化鈉的用量。此活化技術的不足之處是，僅將大部分的游離態腐植酸轉化為溶于水的腐植酸鹽，并沒有顯著提高腐植酸含氧官能團數量，對風化煤活化效果低于氧化法效果[2]。因此，我們準備采用氧化和堿化法聯合的方式對風化煤進行活化，以顯著提高其水溶性腐植酸含量。

本文采用氧化-堿化聯合方法活化風化煤來提高水溶性腐植酸含量并明確其活化機制，進一步與尿素結合得到一種活性腐植酸緩釋肥料——腐植酸尿素，通過結構表征、土壤培養試驗、淋洗等手段明確氧化-堿化聯合活化腐植酸產品對提高氮素利用率效果的影響，并進一步探討其增效機理。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗選取的風化煤來自內蒙古烏海市，粒度小于10 目，含水量約15 ～20 wt%，總腐植酸含量為72.5 wt%，其中的水溶性腐植酸含量為5 wt%。

供試土壤采集于黃河下游濟陽地區的沖積土，土壤類型為潮土。從0 ～20 cm 深度的不同位置隨機采集土壤樣本，并匯集形成復合土壤樣本。土壤樣本被放在塑料袋中，用冷卻器送回實驗室，在進一步分析之前通過2 mm 尼龍篩。供試潮土的物理化學性質見表1。

表1 潮土物理化學性質Tab.1 Physical and chemical properties of tidal soil

1.2 活化腐植酸材料及腐植酸尿素制備

將風化煤、8 mol/L 濃硝酸和KOH 固體按重量比為1 ∶0.2 ∶0.1 的比例混合，得到混合料，然后將混合料與水按重量比1 ∶0.3 的比例攪拌均勻后置于180 ℃陳化12 h，然后冷卻、干燥、粉碎，得到活性腐植酸。

將活性腐植酸和尿素以1 ∶3 的重量比混合，再在120 ～130 ℃熔融，冷卻后制備出腐植酸尿素產品。

1.3 腐植酸活化前后結構及熱力學性質表征

采用傅里葉紅外光譜儀（FT-IR，VERTEX-70/70v，德國布魯克光學公司）獲得400 ～4000 cm-1波長范圍內非常細的粉末樣品的FT-IR 光譜。

采用熱重分析法（TG，DSC 250）測定不同物質的熱量和質量的準確變化。將樣品加入鋁鍋中，在試驗過程中密封。在25 ～500 ℃的溫度范圍內，以10 ℃/min 的加熱速率（由液氮控制）記錄TG譜圖。

1.4 土壤理化性質及酶活性表征

將112 組風干土樣（各200 g）分別放入300 mL塑料容器中，與去離子水混合，使土壤持水率達到40%。所有容器都覆蓋有10 個孔的塑料薄膜，以允許氣體交換，同時將水分損失降至最低。這些樣品在25 ℃下預培養1 周，以減少由于試驗開始時干燥土壤的復濕而引起的微生物活性變化。平衡期結束后，建立4 個處理，分別為不施氮肥（CK）、尿素（U）、腐植酸（F，0.278 mg HA/g 土壤）和腐植酸尿素（FU）。U 和FU 處理氮素濃度一致，均為500 μg N/g 土壤。在整個試驗過程中，每4天補充一次水分，使土壤含水量保持在土壤持水量的60%左右。采用完全隨機區組設計，評估4 組土壤理化和微生物特性的顯著差異。所有土壤樣品在25 ℃下培養，在培養的第0、1、3、7、15、30和90 d 測定脲酶活性和理化性質。

采用自動流動注射分析儀（Foss FIA 5000，丹麥）測定土壤樣品中硝態氮（NO3--N）和銨態氮（NH4+-N）含量；用96 孔微孔板法測定土壤樣品的酶活性[3，4]；以尿素為底物，測定脲酶活性；在578 nm 波長處測定了光強。

1.5 土壤室內淋洗試驗

主體是PVC 管柱、土柱、定制不銹鋼架。玻璃柱的內徑、外徑和高分別為11、12、50 cm。在淋溶柱底部放置濾紙和1 層200 目的濾布。每柱中裝入4 kg 過2 mm 篩后的風干土壤的土肥混合物。淋溶時用醫用輸液管，減緩水在土壤中的滲透速度增強淋溶的效果，加水時可起到緩沖作用，以防止土壤沖散影響淋溶效果。

采用間歇淋溶法，淋溶前加1200 mL 水使土壤水分接近飽和持水量，室溫下放置1 d，使土肥充分混合。首次淋溶加入500 mL 水，收集24 h 淋溶液，每次淋溶過程相同，在培養第2、8、14、20 和26 d 時進行連續5 次淋溶。

1.6 數據分析

原始數據經Excel 2016 匯總整理后，采用方差分析法（ANOVA）研究了不同處理對土壤理化性質和酶活性的影響。采用Duncan 試驗來確定不同處理方法之間的差異。用OriginPro 8.0 對試驗數據進行作圖。

2 結果與討論

2.1 活化前后腐植酸含量變化

與傳統堿化活化方法相比（表2），采用氧化-堿化聯合活化方法可使風化煤中水溶性腐植酸鹽的活化率提高26%～38%，提取的大部分水溶性腐植酸鹽在陳化12 h 后仍能穩定存在，不僅顯著提高了水溶性腐植酸含量，還解決了氨化法效果不穩定的問題，便于后續的肥料造粒工藝。

表2 風化煤中水溶性腐植酸提取量Tab.2 Extraction amount of water soluble humic acid from weathered coal

2.2 活化前后腐植酸結構及熱力學性質分析

濃硝酸作用下，風化煤中芳核上氫可以被硝基離子取代而硝化，從而提高活化后風化煤水溶性腐植酸含量，但風化煤中羧基含量較多，羧基無法被硝化，但可通過加入KOH，生成羧酸鹽的方式提高水溶性腐植酸鹽的含量。在氧化-堿化聯合作用下，風化煤中腐植酸在活化前后必定產生官能團變化以及隨之而來的熱力學穩定性變化。因此，我們采用FT-IR 和TG 分析表征了風化煤中腐植酸活化前后官能團及熱力學穩定性變化，并進一步明確活化后腐植酸水溶性提高的原因。

2.2.1 活化前后腐植酸FT-IR

采用氧化-堿化聯合方法活化前后腐植酸FT-IR 如圖1 所示。活化后，樣品的FT-IR 發生了多處顯著變化，證明活化后腐植酸分子結構變化顯著。如圖1b，在3694.87 cm-1新出現的峰為硝酸氧化下與腐植酸分子形成伯胺或伯酰胺的N-H 伸縮振動峰；在2919.04 和2849.98 cm-1處新出現的峰為羧酸羥基伸縮振動峰，說明硝酸氧化后，不僅硝酸中的氮進入了腐植酸分子中，腐植酸分子中羧基數量顯著增加，這也是活化后水溶性腐植酸含量顯著增加的重要原因。在圖1b 中新出現在1191.08、1107. 81 和1034.10 cm-1處的峰均屬于C-N 拉伸振動峰，證明硝酸中的氮不僅與腐植酸分子端基發生反應，還進一步進入了腐植酸碳鏈中。

圖1 氧化-堿化聯合活化前（a）和活化后（b）腐植酸FT-IRFig.1 FT-IR of humic acid before (a) and after (b) activation by oxidation-alkalization combination

2.2.2 活化前后腐植酸熱力學性質變化

采用氧化-堿化聯合方法活化前后TG 分析曲線如圖2 所示。圖2a 中，在35 ～298 ℃范圍產生23.61%的失重量，主要是由風化煤中水分喪失造成，在298 ～500 ℃產生16.03%的熱失重，主要是由于有機分子鏈脫氫和氨基、羰基和烷氧基官能團的分解所致。圖2b 中，發現有機分子鏈脫氫和氨基、羰基和烷氧基官能團的熱失重起始溫度降低到220 ℃，說明活化后腐植酸分子熱穩定性降低，很可能是活化后腐植酸分子量減小導致的。

圖2 氧化-堿化聯合活化前（a）和活化后（b）TG 分析曲線Fig.2 TG analysis curves before (a) and after (b) activation by oxidation-alkalization combination

綜上所述，活化后腐植酸分子由原來的大分子變為多個小分子，胺基、羧基、羥基等親水官能團增多，氮原子不僅進入端基，也進入了分子碳鏈，從而提高了水溶性腐植酸含量。

2.3 腐植酸尿素對土壤脲酶活性影響

脲酶是一種催化尿素水解生成氨和碳酸鹽的酶。大量研究表明，脲酶活性與合成氮肥的施用量成反比[5]。脲酶活性的降低可以解釋為硝化和反硝化作用的激活抑制了脲酶的產生[6]。氮肥對脲酶活性的抑制作用可能是由于最終產物NH4+-N所致。

Bollmann 等[7]曾報道，褐煤作為腐植酸的原料摻入土壤抑制了土壤中的脲酶活性。本研究發現，隨著尿素與活化后腐植酸結合成腐植酸尿素產品的施入，土壤中的脲酶活性顯著降低。如圖3 所示，向土壤單施尿素，會顯著抑制土壤中脲酶活性，而施用腐植酸尿素處理（FU），土壤脲酶活性比單施尿素處理還要低，說明施用腐植酸尿素產品具有緩釋氮肥的效果。

圖3 4 種處理土壤脲酶活性隨時間變化趨勢Fig.3 Variation trend of soil urease activity under four treatments with time

2.4 腐植酸尿素對土壤氮素淋溶影響

尿素施入土壤后，在脲酶的作用下水解為銨態氮，并進一步被土壤中硝化細菌氧化成硝態氮。由于土壤帶負電，因此對硝態氮不會產生吸附作用，大量的硝態氮會通過土壤淋溶作用進入地下水，產生嚴重的地下水硝酸鹽污染，是引起農業面源污染的重要原因。近年來，科學家們通過多種途徑提高氮素利用率，減少氮素淋溶[8~13]，本研究將腐植酸尿素產品替代傳統尿素進行農業生產就是一種有效減少土壤氮素淋溶的方法。

圖4 、圖5 顯示的是土壤銨態氮和硝態氮淋溶量隨時間變化趨勢。結果表明，與單施尿素相比，施用腐植酸尿素產品可以顯著降低土壤NH4+-N 和NO3--N 含量。初步認為是腐植酸尿素抑制脲酶（圖3）和尿素與腐植酸之間的化學反應（氫鍵等）的結果[14]，二者都可以降低尿素水解。腐植酸具有豐富的羧基、羥基和酚羥基，可以提供大量的陽離子交換位點來保留NH4+[15]。因此，腐植酸尿素處理的土壤中，NH4+-N 淋出量遠低于僅施用尿素處理的土壤，它還具有減少土壤中NH3揮發的潛力。4 個處理中土壤NO3--N 淋出量均在培養的第7 天達到最大值。單施尿素土壤中NO3--N 淋出量在幾乎所有處理中最高，施用腐植酸尿素處理NO3--N 淋出量顯著低于尿素處理。在腐植酸尿素處理中，NH4+-N 轉化為NO3--N 的速率降低，這是由于NH4+-N 在腐植酸尿素處理中被固定了，減少了其轉化為NO3--N 的總量。

圖4 4 種處理土壤NH4+-N 淋失量隨時間變化趨勢Fig.4 Variation trend of the content of NH4+-N leaching soil under four treatments with time

圖5 4 種處理土壤NO3--N 淋失量隨時間變化趨勢Fig.5 Variation trend of the content of NO3--N leaching soil under four treatments with time

綜上所述，與單施尿素相比，腐植酸尿素處理能夠降低土壤氮素淋溶量，提高氮素利用率。

3 結論

風化煤中腐植酸的高效活化可以通過以下3種措施實現[2]：（1）增加結構單元上的活性官能團數量；（2）使官能團處于親電或親核狀態，或通過引入相關原子或原子團，提高官能團反應能力；（3）切斷化學鍵，降低分子量。本文通過氧化-堿化聯合方法活化風化煤，一方面通過硝基引入，取代風化煤中腐植酸芳核上氫而硝化，同時通過硝酸氧化作用，切斷化學鍵，將復雜的大分子腐植酸變為比較簡單的小分子量物質，從而提高活化后風化煤水溶性腐植酸含量；另一方面，風化煤腐植酸中羧基含量較多，羧基無法被硝化，通過加入KOH，生成羧酸鹽的方式提高水溶性腐植酸鹽的含量。通過FI-IR、TG 表征結果證明，活化后腐植酸分子量降低，羧基、羥基等水溶性官能團增多，氧化劑硝酸中的氮不僅進入腐植酸端基，還進入到腐植酸碳鏈，從而提高了腐植酸分子的水溶性，驗證了我們的假設，明確了其氧化-堿化相協同的活化機制。

將得到的活性腐植酸產品與熔融尿素制備成腐植酸尿素，通過土壤培養試驗發現，與傳統尿素相比，腐植酸尿素可以顯著抑制土壤中脲酶活性。已有研究證明[16]，腐植酸中官能團與脲酶中硫醇基作用形成復合物，從而抑制脲酶活性，減緩土壤中酰胺態氮向銨態氮、銨態氮向硝態氮的進一步轉化。土壤淋洗試驗表明，施用腐植酸尿素，土壤淋溶中硝態氮和銨態氮含量均低于常規尿素處理。因此，通過氧化-堿化聯合活化腐植酸進一步制成的腐植酸尿素，能顯著抑制土壤脲酶活性并顯著降低土壤硝態氮和銨態氮的淋溶量，從而提高氮素在土壤中利用率，具有作為增效氮肥的廣泛應用市場。