大腸埃希菌對細粒棘球蚴活性影響的體外研究

苗章　程蕭　滿洋　林芷伊　吳向未　伍希雅　蔡克豐　崔杰　張宏偉

摘要：目的 研究細粒棘球蚴與大腸埃希菌體外共培養的條件下活性、形態的變化，以及部分參與通路。研究細粒棘球蚴與特定濃度大腸埃希菌體外共培養的條件下活性、形態隨時間的變化，以及部分參與通路。方法 將羊源性原頭蚴重懸計數，分為空白組、0.5麥氏濃度大腸埃希菌組（實驗組），并以12、24、48、72、96 h為時間節點，使用0.1％伊紅染液按照體積1∶1的比例染色2 min后顯微鏡下觀察并計算兩組原頭蚴的存活率；使用活性氧試劑盒在上述時間點檢測兩組原頭蚴體內ROS水平；在12、48、96 h分別檢測Caspase-3、9；Bax、Bcl-2、Nrf2蛋白的表達水平。結果 實驗組原頭蚴存活率隨時間延長降低，在96 h降至為0%；兩組原頭蚴體內活性氧檢測顯示：實驗組ROS水平明顯提高，12 h最高，差異具有統計學意義（T=11.638， P<0.05），在72 h ROS水平與空白組相近；Western blot實驗表明，凋亡蛋白Bax（T=4.997，P＜0.05）、Caspase-3蛋白（T=6.118，P＜0.05）、Caspase-9蛋白（T=3.435，P＜0.05），實驗組的蛋白水平大于空白組，有統計學意義。抗凋亡蛋白Bcl-2，實驗組的蛋白水平小于空白組，有統計學意義（T=9.184，P＜0.05），兩組Nrf2蛋白水平差異無統計學意義（T=0.902，P=0.418）。結論 大腸埃希菌在體外可以快速致細粒棘球蚴死亡。0.5 mol·L-1大腸埃希菌在體外可以快速致細粒棘球蚴死亡，氧化應激通路可能參與了此過程。

關鍵詞：細粒棘球蚴；大腸埃希菌；活性氧（ROS）；Bcl-2蛋白；Nrf2蛋白

中圖分類號：中圖分類號R532.32文獻標志碼：A文獻標識碼

In vitro study of the pathway associated with the death of Echinococcus granulosus by Escherichia coli

MIAO Zhang1，CHENG Xiao1，MAN Yang1，LIN? Zhiyi2，WU? Xiangwei2，WU? Xiya1，CAI? Kefeng1，CUI? Jie1，ZHANG? Hongwei2，3*

（1 School of Medicine， Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832008， China; 2 First Affiliated Hospital， School of

Medicine， Shihezi University， Shihezi，Xinjiang 832008， China; 3 NHC Key Laboratory of Prevention and Treatment

of Central Asia High Incidence Disease，Shihezi，Xinjiang 832008， China）

Abstract： ?Objective To study the changes in activity and morphology of Echinococcus granulosus under the conditions of co-culture with Escherichia coli in vitro， and some of the involved pathways.To study the changes in activity and morphology over time of Echinococcus granulosus co-cultured with specific concentrations of Escherichia coli in vitro， and some of the pathways involved. Methods The sheep-derived protozoa were resuspended and counted， divided into blank group and 0.5 maixa concentration Escherichia coli group （experimental group）， and stained with 0.1% eosin staining solution at a ratio of 1∶1 by volume for 2 min at 12， 24， 48， 72， 96 h as time points and then observed under microscope and calculated the survival rate of protozoa in both groups; the reactive oxygen species kit was used to detect the protozoa in both groups at the above time points The expression levels of Caspase-3 and 9， Bax， Bcl-2 and Nrf2 were measured at 12， 48， 96 h.Results The survival rate of protozoa in the experimental group decreased with time， and decreased to 0% at 96 h. The detection of reactive oxygen species in the two groups showed that the level of ROS in the experimental group increased significantly， with the highest level at 12 h. The difference was statistically significant （T=11.638， P<0.05）， and the level of ROS at 72 h was similar to that of the blank group. Western blot experiment showed that the protein levels of apoptotic protein Bax（T=4.997， P<0.05）， Caspase-3 protein （T=6.118， P<0.05）， Caspase-9 protein （T=3.435， P<0.05）， the protein levels in the experimental group were greater than those in the blank group， which was statistically significant. For anti-apoptotic protein Bcl-2， the protein level of the experimental group was smaller than that of the blank group， which was statistically significant （T=9.184， P<0.05）， and the difference in Nrf2 protein level between the two groups was not statistically significant （T=0.902， P=0.418）; Conclusion Escherichia coli can rapidly cause death of Echinococcus granulosus in vitro. Escherichia coli（0.5 mol·L-1） can rapidly cause death of Echinococcus granulosus in vitro， The oxidative stress pathway may be involved in this process.

Key words： Echinococcus granulosus; escherichia coli; ROS; Bcl-2 protein;? Nrf2 protein

細粒棘球蚴（CE）所致的囊性肝包蟲病是一種世界范圍內流行的人畜共患病［1-2］，通過大量的臨床觀察以及包蟲影像學分型［3］依據肝兩型包蟲病診斷與治療專家共識（2019版）［3］并通過大量的臨床觀察，我們認為，包蟲可以走向自然死亡，膽瘺和感染是兩大重要因素，很多合并細菌感染的包蟲囊腫會發生膿腫樣改變，可發生快速死亡，引起肝包蟲囊內細菌感染的主要病原菌是大腸埃希菌［4］。本課題組實驗證明大腸埃希菌在體外可以通過內質網通路導致原頭蚴死亡，那么此過程是否有氧化應激、線粒體等死亡通路的參與，目前尚無確切證據，本研究延續前期實驗［5］，使用最佳0.5麥氏濃度大腸埃希菌與細粒棘球蚴原頭蚴體外共培養，連續觀察原頭蚴形態學及活性的變化，并探討氧化應激通路是否參與其中，以期為進一步研究肝包蟲的自然病程提供證據。

1 材料與方法

1.1 材料

細粒棘球蚴含細粒棘球蚴囊泡的羊肝購于新疆維吾爾自治區昌吉屠宰場；大腸埃希菌標準菌株（ATCC 25922）來源于石河子大學醫學院第一附屬醫院微生物室。

1.2 主要試劑

磷酸鹽緩沖液（PBS）、1640培養基、胎牛血清，伊紅染液等購于美國Life Gibco公司；Caspase-3、Caspase-9、Bax、bcl-2、Nrf2蛋白抗體購于Boster公司。

1.3 方法

1.3.1 細粒棘球蚴原頭蚴的收集培養

將新鮮包蟲羊肝放于提前滅菌后的自來水中沖洗3遍，去除羊肝表面殘留血漬及雜質，使用75%的酒精擦洗羊肝表面3次后抽取養肝囊泡內的囊液，并將囊液注入高壓滅菌的玻璃試劑瓶中，將囊液移入超凈操作臺中，沉淀靜置3 min后，去除上層囊液，再次加入PBS溶液后靜置2 min，使用注射器去除上層液體，重復10次。將收集到的細粒棘球蚴移入15mL離心管中，加入PBS溶液的將總體積定容至10mL，混勻后抽取20μL加入同體積0.1%伊紅染液，3 min后在顯微鏡下觀察計算染色率。當染色率≤2%時可用于后續實驗研究，如染色率大于2%，繼續重懸、靜置步驟。放入細胞培養箱中培養。每隔48h更換一次培養基并使用無菌PBS溶液清洗原頭蚴，如培養基顏色變黃則根據實際情況更換培養基。原頭蚴存活率（%）=（未染色原頭蚴個數／原頭蚴總和）×100%。

1.3.2 觀察大腸埃希菌對體外培養細粒棘球蚴原頭蚴活性的影響

在12、24、48、72、96h觀察兩組原頭蚴形態及存活情況，具體如下：使用移液槍將兩組觀察時間點細粒棘球蚴移至15mL離心管，吹打混勻培養基，抽取100μL（約100個原頭蚴）含原頭蚴的培養液懸液至載玻片上，同體積伊紅染液染色3 min，使用顯微鏡觀察兩組原頭蚴活力變化、形態結構的變化。原頭蚴在活力較好的時候，不會被伊紅染液染色，當期活力差或已發生死亡的時候會被染成紅色。在倒置顯微鏡下計算原頭蚴染色個數和總個數。

1.3.3 活性氧測定

分別按照觀察時間點從兩組六孔板中移取適量原頭蚴，放入離心管中使用PBS清洗重懸3次；將DCFH-DA與1640培養基按1∶1 000比例稀釋，兩組原頭蚴分別設置陽性對照管和DCFH-DA管，DCFH-DA管內加入稀釋后的DCFH-DA；陽性空白組內加入Rosup；分別將兩組的陽性對照管、DCFH-DA管孵育30 min；調整離心機轉速到1 000g，離心時間10 min，去除上層液體，使用PBS清洗重懸原頭蚴3次；避光環境下使用熒光顯微鏡觀察原頭蚴ROS水平，拍攝熒光圖片。

1.3.4 Western blot 檢測Caspase-3、9、Bcl-2、Bax、Nrf2蛋白的表達水平

將兩組六孔板中的原頭蚴放入離心管，洗滌離心后加入蛋白裂解液RIPA∶PMSF=100∶1，冰上裂解20 min后使用超聲粉碎儀提取蛋白；用金屬浴將加入loading buffer的蛋白變性。按WB實驗法依次完成電泳、電轉、封閉、一抗孵育、二抗孵育、曝光。

1.4 統計學分析

計量資料以平均值±標準偏差（±S）表示；兩組之間比較時用χ2檢驗，P<0.05時表示差異有統計學意義。應用SPSS 23.0軟件作數據統計分析，ROS熒光圖片、WB條帶灰度采用Image J進行量化分析，Graphpad Prism 5作圖。

2 結果

2.1 大腸埃希菌對體外細粒棘球蚴原頭蚴形態的影響

不同時間點下，空白組原頭蚴變化不明顯，形態規則，呈橢圓形；隨著時間的延長，實驗組原頭蚴呈外翻型，表面相對粗糙、皺縮、變形，邊界不清晰，隨時間延長被伊紅染色的原頭蚴個體數量逐漸增多，在96 h鏡下原頭蚴被全部染色（圖1）。

2.2 大腸埃希菌對體外細粒棘球蚴原頭蚴活力的影響

在大腸埃希菌作用12、24、48、72、96h，分別用0.1%伊紅染色，計算原頭蚴的存活率。空白組的存活率分別為99.80%±0.35%、98.59%±0.05%、98.22%±0.30%、97.72%±0.14%、96.96%±0.30%，實驗組存活率分別為70.03%±1.39%、56.11%±2.94%、20.61%±3.44%、8.85%±1.95%、0，隨著時間的延長，細粒棘球蚴原頭蚴活性降低，大腸埃希菌對細粒棘球蚴致死作用顯著增強（圖2）。

2.3 大腸埃希菌對體外細粒棘球蚴原頭蚴活性氧（ROS）的影響

采用DCFH-DA熒光探針檢測不同時間兩組原頭蚴體內活性氧（ROS）濃度，并使用熒光顯微鏡觀察并拍攝熒光圖片。

結果顯示空白組的原頭蚴ROS濃度幾乎無變化，與大腸埃希菌共培養的原頭蚴體內ROS濃度在72 h前均高于空白組，在72 h兩組ROS濃度近乎持平。在72 h后由于實驗組原頭蚴死亡ROS含量低于空白組。實驗組ROS于12 h表達峰值，兩組差異具有統計學意義（T=11.638， P<0.05）（圖3，圖4）。

2.4 大腸埃希菌對體外細粒棘球蚴原頭蚴Caspase-3、9；Bax、Bcl-2、Nrf2蛋白水平的影響

由圖5可知，在12、48、96h檢測蛋白水平，與空白組相比，不同時間點內，凋亡蛋白Bax（T=4.997，P＜0.05）、Caspase-3（T=6.118，P＜0.05）、Caspase-9（T=3.435，P＜0.05），實驗組的蛋白表達均高于對照組，具有統計學差異。實驗組的抗凋亡蛋白Bcl-2（T=9.184，P＜0.05）表達水平明顯低于對照組，具有統計學差異，實驗組Nrf2蛋白（T=0.902，P=0.418）的表達水平在12 h高于對照組，但兩組比較無統計學差異。

3 討論

大腸埃希菌是無芽孢革蘭陰性短桿菌，周身鞭毛，可運動，胃腸道內多見。其在正常棲居環境中不會致病，但當進入膽囊、膀胱會引起炎癥。大腸埃希菌毒力因子包括內毒素、莢膜、黏附素和腸毒素等，是引起囊性肝包蟲常見并發癥囊內細菌感染的主要致病菌［6］。目前認為囊型肝包蟲發生細菌感染與膽瘺緊密相關，且前期本中心術中證實部分囊型包蟲內囊黃染，合并膽瘺［7］，有文獻分析為包蟲囊周圍肝內膽管長時間受到壓迫［8-9］，發生狹窄、扭曲，膽汁淤積外滲，蟲囊與膽道相通，細菌隨膽汁進入蟲囊形成感染［10］。

課題組前期使用小鼠接種膽汁處理后的原頭蚴模擬膽瘺的發生，實驗發現包蟲囊腫生長受到抑制［11］，后延續實驗將膽汁與原頭蚴體外共培養，發現膽汁并不能直接滅活原頭蚴 ［12］，那么隨膽汁進入囊內的大腸埃希菌能否直接殺死原頭蚴？這一現象在體內很難進行單一因素觀察，所以通過建立體外感染模型進行研究。結果表明大腸埃希菌可以降低體外細粒棘球蚴活性，同時活性氧（ROS）、部分凋亡蛋白參與了此過程。

ROS在細胞增殖和凋亡中起著至關重要的作用，適當較低的ROS水平可以作為第二信使促進細胞增殖，當機體內ROS水平過高時，抗氧化功能系統發生破壞［13-14］，迫使細胞處于氧化應激的環境中［15］，引起細胞損傷。有研究表明，細胞內過多ROS的產生，可以導致線粒體結構受損［16］，促使細胞凋亡。本次實驗中，在大腸埃希菌的作用下，細粒棘球蚴體內ROS快速積聚，12h時達到頂峰，致使細粒棘球蚴存活率降低。提示大腸埃希菌可能通過提高ROS的水平，影響細粒棘球蚴的活性。

Nrf2可以調控抗氧化應激因子表達，從而對抗氧化損傷，但有文獻報道，一些毒性藥物可以增強氧化應激的發生，但Nrf2的表達卻是降低的［17］。本次實驗中，實驗組和對照組各時間點Nrf2的表達并無統計學意義，但在第12 h，實驗組Nrf2表達水平是略高于對照組的，針對這一現象，本實驗尚不能明確原因，其中涉及因素仍需進一步實驗去證實。

Caspase家族蛋白啟動和執行的細胞凋亡是一種不可逆轉的級聯反應［18］，在Caspase家族中，Caspase-9可以通過內源性的途徑激活Caspase-3，誘導細胞發生凋亡［19］。在機體內，抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax相互結合，Bcl-2/Bax的相對比值是調控凋亡的決定因素［20-21］。本實驗中，實驗組不同時間點Caspase-9、Caspase-3、Bax表達均顯著升高，Bcl-2出現下調，表明大腸埃希菌感染細粒棘球蚴后，使Caspase-9發生同源活化，直接激活Caspase-3，導致細粒棘球蚴死亡，同時Bax表達增加，Bcl-2/Bax比值減小，促進細粒棘球蚴發生死亡。結合上述實驗結果，我們可知大腸埃希菌在體外可以降低細粒棘球蚴的活性，原因可能是改變了其生存環境，同時氧化應激及線粒體通路部分相關蛋白參與了此過程。但具體哪些通路參與或者主要調節了此過程，這些都仍需更深一步研究。

此外在臨床觀察中發現，自然狀態下，病程較長的囊型肝包蟲內多有鈣化發生，提示包蟲活性降低，彭心宇教授認為這是機體產生的一種營養不良性鈣化［22］。馬志剛等［11］研究表明囊型肝包蟲病囊腫分型從CL型向V型演變，膽瘺發生率增高，膽瘺可以引起囊內包蟲活性轉變。而囊內細菌感染與膽瘺緊密相關，因此包蟲活性的降低與膽瘺、囊內感染、囊壁鈣化都有著一定的聯系，但是囊內細菌感染、膽瘺與囊壁鈣化之間有無因果關系需要繼續研究，人體內包蟲囊腫自然演變受多種因素影響，是一個復雜漸進的過程，囊內細菌感染只是包蟲囊腫活性降低的一種因素，肝包蟲的自然病程還需要我們更全面更深層次的研究。

參考文獻（References）

［1］BUDKE C M，DEPLAZES P，TORGERSON P R.Global socioeconomic impact of cystic echinococcosis［J］.Emerging Infectious Diseases，2006，12（2）：296-303.

［2］CRAIG P S，MCMANUS D P，LIGHTOWLERS M W，et al.Prevention and control of cystic echinococcosis［J］.Lancet Infect Dis，2007，7（6）：385-394.

［3］中國醫師協會外科醫師分會包蟲病外科專業委員會.肝兩型包蟲病診斷與治療專家共識（2019版）［J］.中華消化外科雜志，2019，18（8）：711-721.

Chinese Doctor Association，Chinese College of Surgeons （CCS），Chinese Committee for Hadytidology （CCH）.Expert consensus on diagnosis and treatment of hepatic cystic and alveolar echinococcosis （2019 edition）［J］.Chin J Dig Surg，2019，18（8）：711-721.

［3］溫浩，吐爾干艾力·阿吉，邵英梅.肝兩型包蟲病診斷與治療專家共識（2019版）［J］.中華消化外科雜志，2019，18（8）：711-721.

WEN H，TUERGANAILI AJI.Expert consensus on diagnosis and treatment of hepatic cystic and alveolar echinococcosis （2019 edition）［J］.Chinese Journal of Digestive Surgery，2019，18（8）：711-721.

［4］CASTILLO S，MANTEROLA C，GRANDE L，et al.Infected hepatic echinococcosis Clinical therapeutic and prognostic aspects，A systematic review［J］.Ann Hepatol，2021，22：100237.

［5］郭煒.囊型肝包蟲病自然病程的體外基礎實驗研究［D］.石河子：石河子大學，2019.

［6］張峰，楊青，劉會苗.肝包蟲囊腫細菌感染病原菌分布、影像學表現及超聲引導下穿刺不同處理措施對治療療效的影響［J］.中華醫院感染學雜志，2016，26（23）：5361-5363.

ZHANG F，YANG Q，LIU H M.Distribution，imaging performance and efficacy of different treatment measures of ultrasound guided puncture on the treatment of hepatic hydatid cyst patients with bacterial infections［J］.Chinese Journal of Nosocomiology，2016，26（23）：5361-5363.

［7］楊宏強，彭心宇，張示杰，等.囊性肝包蟲病合并膽瘺的手術治療［J］.中國綜合臨床，2006（4）：360-362.

YANG H Q，PENG X Y，ZHANG S J，et al.Surgical treatment of cystic hepatic echinococcosis complicated with biliary fistula［J］.China Comprehensive Clinic，2006（4）：360-362.

［8］ECKERT J，DEPLAZES P.Biological，epidemiological，and clinical aspects of echinococcosis，a zoonosis of increasing concern［J］.Clin Microbiol Rev，2004，17（1）：107-135.

［9］溫浩，徐明謙.實用包蟲病學［M］.北京：科學出版社，2007.

WEN H，XU M Q.Practical hydatid disease［M］.Beijing：science Press，2007.

［10］BUDKE C M，DEPLAZES P，TORGERSON P R.Global socioeconomic impact of cystic echinococcosis［J］.Emerg Infect Dis，2006，12（2）：296-303.

［11］馬志剛.囊型肝包蟲病合并膽瘺對其生命周期影響的研究［D］.石河子：石河子大學，2010.

［12］郭煒，王朝陽，于云寶，等.膽汁對體外培養人細粒棘球蚴原頭蚴生長發育的影響［J］.石河子大學學報（自然科學版），2018，36（2）：259-264.

GUO W，WANG C Y，YU Y B，et al.Effect of bile on the growth and development of human Echinococcus granulosus protoscoles in vitro［J］.Journal of Shihezi University （Natural Science Edition），2018，36 （2）：259-264.

［13］SHI H，LEI Y，WANG B，et al.Protoscolicidal effects of chenodeoxycholic acid on protoscoleces of Echinococcus granulosus［J］.Experimental Parasitology，2016，167：76-82.

［14］WANG B，JIANG Y F，WANG Z，et al.Arsenic trioxide negatively affects echinococcus granulosus［J］.Antimicrob Agents Chemother，2015，59（11）：6946-6951.

［15］SHEN S，YAN Z，WU J，et al.Characterization of ROS metabolic equilibrium reclassifies pan-cancer samples and guides pathway targeting therapy［J］.Front Oncol，2020，20（10）：581197.

［16］HE H，WANG L，QIAO Y，et al.Doxorubicin induces endotheliotoxicity and mitochondrial dysfunction via ROS/eNOS/NO Pathway［J］.Front Pharmacol，2020，10（10）：1531.

［17］YUN Q，WU Y，MENG M，et al.GYY4137 protects against myocardial ischemia/reperfusion injury via activation of the PHLPP-1/Akt/Nrf2 signaling pathway in diabetic mice［J］.Journal of Surgical Research，2018，225：29-39.

［18］AMPTOULACH S，LAZARIS A C，GLANNOPOULOU I，et al．Expression of Caspase-3predicts prognosis in advanced noncardia gastric cancer［J］．Med Oncol，2015，32 （1）：416.

［19］THORNBERRY N A，LAZEBNIK Y.Caspases：Enemies within（1998）［J］.Science，2018（5381），1312-1316.

［20］OLA M S，NAWAZ M，AHSAN H.Role of Bcl-2 family proteins and caspases in the regulation of apoptosis［J］.Mol Cell Biochem，2011，351（1-2）：41-58.

［21］ZHUANG Y，XU H，Richard S A，et al.Inhibition of EPAC2 attenuates intracerebral hemorrhage-induced secondary brain injury via the p38/BIM/Caspase-3 pathway［J］.Mol Neurosci，2019，67（3）：353-363.

［22］彭心宇，李建輝，趙瑾.肝細粒棘球蚴周圍纖維囊壁鈣化分布及意義［J］.中國人獸共患病學報，2006，22（9）：825-827，832.

PENG X Y，LI J H，ZHAO J.Distribution of calcium deposits in the pericystic layers of hepatic hydatid cyst and its significances［J］.Chinese Journal of Zoonoses，2006，22（9）：825-827，832.

（責任編輯：編輯唐慧）

收稿日期：中文收稿日期2022-05-16

基金項目：國家自然科學基金項目（81860363）;中國醫學科學院中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金（2020-PT330-003）

作者簡介：苗章（1992—），男，碩士研究生，住院醫師，專業方向為普通外科。

*通信作者：張宏偉（1983—），男，副教授，從事肝膽胰外科研究，e-mail：zhw0108@163.com。