兩性霉素B菌種選育及發(fā)酵工藝研究

隨子華,孫術超,鞠加學,葛鹍鵬,趙國忠,陳瑤瑤

(1.華北制藥華勝有限公司,河北石家莊052160;2.微生物藥物國家工程研究中心,河北石家莊 052165;3.河北省工業(yè)微生物代謝工程技術研究中心,河北石家莊 052165;4.華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司,河北石家莊 052165)

兩性霉素B(amphotericin B,AmB)是由結節(jié)鏈霉菌(Streptomycesnodosus)產生的一種多烯大環(huán)內酯類抗生素。其作為重要的廣譜抗真菌藥物[1-3],通過與敏感真菌細胞膜上的固醇相結合形成通道,損傷細胞膜的通透性,破壞細胞的正常代謝,從而抑制真菌生長,這種獨特的抗菌機制避免了真菌產生耐藥性[4]。兩性霉素B自上市以來,不可替代地被用于治療全身真菌感染[5-6]。兩性霉素B對新型隱球菌、毛霉菌、念珠菌和曲霉菌等[7-10]侵襲性真菌感染治療效果優(yōu)異。毛霉菌病在過去的病死率高達50%,一線藥物也是兩性霉素B,與其他藥物聯用可以進一步提高療效[11-12]。此外,兩性霉素B脂質體[13-14]以及兩性霉素B納米復合物[15]的出現,不但提高了藥物穩(wěn)定性,還使不良反應的發(fā)生率明顯下降。

工業(yè)上通過生物發(fā)酵法獲得兩性霉素B,提高發(fā)酵單位,降低生產成本,才能滿足兩性霉素B及其相關產品的臨床需求。張雨函[16]和王昂等[3]通過在發(fā)酵過程中添加不同的前體物質和調控發(fā)酵策略優(yōu)化發(fā)酵工藝等方式來提高兩性霉素B的發(fā)酵單位。選育高產菌株提升菌種的生產性能可進一步降低生產成本。紫外誘變是傳統(tǒng)誘變方式之一,王亞軍等[17]采用紫外誘變選育的兩性霉素B高產菌株發(fā)酵單位較出發(fā)菌株提高了20%。單一誘變劑的重復使用往往會導致抗性飽和,而2種或2種以上誘變方式的合理搭配會產生協(xié)同效應。胡悅等[18]采用LiCl-ARTP復合誘變處理地衣芽孢桿菌,獲得了高產堿性蛋白酶的優(yōu)良菌株。張昳[19]采用“ARTP+EMS+Strr”三重復合誘變處理篩選,得到刺糖多孢菌突變菌株AES-8,其多殺菌素產量較出發(fā)菌株提高86.81%,且具有遺傳穩(wěn)定性。

目前工業(yè)生產兩性霉素B發(fā)酵水平低、生產工藝不穩(wěn)定,導致生產成本高,難以滿足逐漸擴大的市場需求。本研究通過對兩性霉素B產生菌采用紫外誘變和常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma, ARTP)誘變的復合誘變方式進行菌株選育,經抗性篩選,最終獲得穩(wěn)定傳代的兩性霉素B高產菌株。采用響應面設計對發(fā)酵培養(yǎng)基配方進行優(yōu)化,獲得適合高產菌株的培養(yǎng)基組成。高產菌株和發(fā)酵配方經50 L發(fā)酵罐試驗驗證,提高了兩性霉素B發(fā)酵水平,對提高工業(yè)化生產水平、降低生產成本、提高企業(yè)競爭力具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實驗材料

結節(jié)鏈霉菌(Streptomycesnodosus)A318-10,由華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司菌種保藏中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基配制

向種子培養(yǎng)基中加入葡萄糖20 g、酵母粉15 g、魚蛋白胨1.5 g、氯化鉀0.8 g、七水硫酸鎂2.5 g、碳酸鈣8 g,加蒸餾水定容至1 L,用NaOH調節(jié)pH值至7.0,120 ℃滅菌30 min。

向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入葡萄糖30 g、淀粉10 g、中溫豆粉15 g、魚蛋白胨2 g、氯化鉀1 g、碳酸鈣8 g,加蒸餾水定容至1 L,用NaOH調節(jié)pH值至7.0,120 ℃滅菌30 min。

1.1.3 實驗儀器設備

常溫常壓等離子體誘變育種儀(ARTP-IIS型),天木生物科技有限公司提供;高速冷凍離心機(64R型),美國貝克曼庫爾特有限公司提供;電子天平(JJ2000型)、分析天平(JJ224BC型),常熟市雙杰測試儀器廠提供;超凈工作臺(BCM-1600A),蘇州安泰空氣技術有限公司提供;真空干燥箱(DZF-6050型),上海簡戶儀器設備有限公司提供;高壓蒸汽滅菌鍋(LMQ.C-100E),濟南來寶醫(yī)療器械有限公司提供;酸度計(FE20),梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司提供;搖床(New Brunswick Innova 2300),新澤西科學公司提供;恒溫恒濕培養(yǎng)箱(LRH-150-SH),廣東泰宏君科學儀器股份有限公司提供;高效液相色譜儀(Waters e2695-2489)、色譜柱(Symmetry C18),沃特世科技(上海)有限公司提供;15 L種子罐、50 L發(fā)酵罐,上海國強生化工程裝備有限公司提供。此外,紫外誘變箱為自制。

1.2 方 法

1.2.1 培養(yǎng)方法

將結節(jié)鏈霉菌保藏種液以4%(體積分數,下同)的接種量接種于裝有15 mL培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中,26 ℃,180 r/min振蕩培養(yǎng)2 d,再將培養(yǎng)好的種子液以5%(體積分數,下同)的接種量接種于裝有300 mL培養(yǎng)基的1 L三角瓶中,在26 ℃,220 r/min振蕩條件下培養(yǎng)6 d。

1.2.2 效價測定

1)樣品處理 取1.0 mL發(fā)酵液于試管中,加入9.0 mL二甲基亞砜,室溫條件下振蕩搖勻,然后靜置浸泡15 min。取2.0 mL上清液置于離心管中,10 000 r/min離心3 min。移取離心液1.0 mL,用甲醇稀釋于100 mL容量瓶中,得樣品溶液。用0.22 μm微孔濾膜過濾,濾過液進行HPLC分析。

2)檢測條件 Waters e2695-2489高效液相色譜儀,色譜柱為Symmetry C18(4.6 mm × 250 mm,5 μm);流動相為甲醇-乙腈-EDTA溶液(2.5 mmol/L)(體積比為50∶25∶35),用4.25%(質量分數)磷酸調節(jié)pH值為5.00±0.05;流速為1.0 mL/min;柱溫為30 ℃;檢測器波長為405 nm;進樣量為20 μL。

1.3 試驗設計

1.3.1 高產菌株誘變試驗

1)紫外誘變 取結節(jié)鏈霉菌單孢子懸液置無菌平皿中,于紫外誘變箱(照射距離為32 cm,紫外功率為30 W)分別照射10,20,30,60和90 s,同時以未經照射的菌液為空白對照,于平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)后分別計算致死率和正突變率。

2)ARTP誘變 取結節(jié)鏈霉菌單孢子懸液涂于金屬載片上,于ARTP誘變箱(照射距離為2 mm,電源功率為110 W,工作氣流量為10 L/min),分別處理20,35,50,70和90 s后,以未經誘變的菌液為對照,于平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)后分別計算致死率和正突變率。

3)兩性霉素B抗性質量濃度的選擇 取兩性霉素B單孢子懸液涂布于含不同質量濃度(7 000,8 000,9 000,11 000,13 000,15 000 μg/mL)的兩性霉素B抗性平板上培養(yǎng)。

誘變菌株致死率=(未誘變平板菌落數—誘變后平板菌落數)/未誘變平板菌落數×100%。誘變菌株突變率的計算以發(fā)酵效價為標準,發(fā)酵效價提高或降低10%以上的誘變菌株定義為突變株。發(fā)酵效價提高的突變株定義為正突變株。正突變率=正突變株數/總誘變菌株數×100%。

1.3.2 單因素試驗

在均勻設計獲得的已知配方中挑選主要碳源和氮源的4個效應因子進行單因素分析,篩選影響較大的效應因子進行響應面優(yōu)化,試驗設計見表1。

表1 單因子試驗設計表

1.3.3 響應面優(yōu)化試驗

在前期單因素試驗的基礎上,結合單因子試驗結果,選取葡萄糖、中溫豆粉、淀粉作為試驗考察因素,采用Box-Behnken Design(簡稱BBD)在Design-Expert 12軟件上進行響應面分析試驗,各因素水平編碼見表2。

表2 Box-Behnken設計的因素水平及編碼

1.3.4 發(fā)酵優(yōu)化配方驗證

依據軟件Design-Expert 12優(yōu)化后得到的最佳添加量,在1 L三角瓶中進行試驗,以及在50 L發(fā)酵罐進行發(fā)酵驗證。

2 結果與分析

2.1 誘變條件的選擇

采用方法“1.3.1”進行誘變條件的選擇,由表3可見,隨著紫外線(ultraviolet,UV)處理時間延長,致死率逐漸增加,而正突變率呈先上升后下降的趨勢。當UV處理60 s時,正突變率最大,達到25.2%,因此選取60 s為UV處理最適時間。由表4可見,當ARTP處理時間為35 s時,正突變率高達24.5%,選取35 s為ARTP處理最適誘變時間。

表3 不同UV處理時間的致死率和正突變率

表4 不同ARTP處理時間的致死率和正突變率

由表5可見,當兩性霉素B質量濃度在13 000 μg/mL及以上時,會抑制菌體生長,因此選取13 000 μg/mL為抗性質量濃度反復處理,篩選抗性菌株。

表5 不同抗性質量濃度對兩性霉素B菌株生長的影響

2.2 復合誘變

根據確定的最適誘變條件將兩性霉素B單孢子懸液經UV照射60 s后再經ARTP照射35 s,采用復合誘變處理后的兩性霉素B菌懸液于平板培養(yǎng)基中培養(yǎng),挑取單菌落經搖瓶發(fā)酵初篩,篩選出的菌株經3次搖瓶復試,最終獲得較對照產量提高10%以上的3株高產菌株,其中菌株20-1-25較出發(fā)菌株提高20.8%,結果見表6。

表6 復合誘變篩選的兩性霉素B高產菌株

2.3 自身產物抗性篩選

將復合誘變篩選的高產菌株20-1-25制備成單孢子懸液,涂布于含13 000 μg/mL兩性霉素B的平板培養(yǎng)基上,培養(yǎng)結束后將生長出的單菌落轉接于斜面培養(yǎng)基,篩選到的菌株經3次復試,獲得6株高產菌株,其中菌株20-2-15提高達15.7%,結果見表7。

表7 抗性篩選的兩性霉素B高產菌株

將比菌株20-1-25提高10%以上的3株菌,與出發(fā)菌株A318-10對比,經復合誘變和自身抗性篩選獲得的高產菌株20-2-15比出發(fā)菌株提高37.5%,結果見表8。

2.4 穩(wěn)定性試驗

將選育的高產菌株20-2-15采用斜面?zhèn)鞔绞?考察穩(wěn)定性,連續(xù)傳代5次,進行搖瓶試驗測定發(fā)酵效價。由表9可見,菌株20-2-15從F1代到F4代,發(fā)酵效價波動水平不超過10%,說明高產菌株具有良好的傳代穩(wěn)定性,有利于規(guī)模化工業(yè)生產。

表9 高產菌株20-2-15遺傳穩(wěn)定性

2.5 效應因子的篩選

以選育出的高產菌株20-2-15為試驗菌株,在均勻設計確定的培養(yǎng)基基礎上,使用響應面分析再次對培養(yǎng)基配方進行優(yōu)化。

在均勻設計獲得的已知配方中挑選主要碳源和氮源的4個效應因子進行單因素分析,結果如圖1所示。從圖中可以看出,不同碳源和氮源濃度條件下,葡萄糖、淀粉、中溫豆粉對發(fā)酵水平影響較為顯著,魚蛋白胨影響較小,所以選取葡萄糖、中溫豆粉、淀粉進行響應面優(yōu)化試驗。

圖1 碳源和氮源濃度對發(fā)酵水平的影響Fig.1 Effect of carbon and nitrogen sources concentration on fermentation level

2.6 響應面優(yōu)化試驗

對葡萄糖、中溫豆粉、淀粉進行響應面優(yōu)化試驗,按照軟件Design-Expert 12中的BBD生成的試驗設計表進行試驗,試驗結果見表10。

表10 BBD試驗設計及結果

經Design-Expert 12軟件擬合,各因素對兩性霉素B產量的編碼值回歸方程如下:

效價=-206 734+752.99A+12 945.75B+1 075.99C+1.27AB+43.76AC-8.37BC-10.31A2-231.97B2-98.67C2。其中:A為葡萄糖;B為中溫豆粉;C為淀粉。回歸方程校正系數R2為0.949 5,說明方程的擬合度良好,可有效預測兩性霉素B產量的最優(yōu)組合。方差分析結果見表11,殘差正態(tài)分布如圖2所示。

圖2 殘差正態(tài)分布圖Fig.2 Normal distribution of residuals

表11 BBD方差分析結果

由表11和圖2可知,模型顯著(p<0.05),失擬項不顯著(p=0.067 5>0.05),殘差正態(tài)分布明顯趨近于直線,說明該模型選擇合適。將葡萄糖、中溫豆粉和淀粉兩兩組合,繪制與效價的3D響應面和等高線,如圖3所示。

圖3 3個主要因素交互影響兩性霉素B產量的響應面優(yōu)化結果Fig.3 Response surface optimization result of pairwise interaction of the three main factor on amphotericin B yield

根據軟件預測優(yōu)化結果:葡萄糖為94.6 g/L,中溫豆粉為27.7 g/L,淀粉為24.1 g/L,最優(yōu)解的效價預測值為19 213.3 μg/mL。

2.7 發(fā)酵優(yōu)化配方驗證

用篩選得到穩(wěn)定高產菌株20-2-15進行1 L搖瓶發(fā)酵配方驗證,結果見表12。由表可見,高產菌株20-2-15采用發(fā)酵新配方后效價比原配方提高了32.6%。

表12 高產菌株20-2-15搖瓶驗證結果

采用優(yōu)化后配方進行3批50 L發(fā)酵罐驗證,結果見表13。由表可見,50 L罐發(fā)酵平均效價達到20 856 μg/mL,比原配方提高29.4%。

表13 高產菌株20-2-15 50 L發(fā)酵罐驗證結果

3 結 語

本研究通過菌種選育獲得了穩(wěn)定遺傳的高產菌株,可用于兩性霉素B工業(yè)化發(fā)酵生產,采用配方優(yōu)化可進一步提高發(fā)酵水平,降低生產成本。

1)建立了UV-ARTP復合誘變策略,以結節(jié)鏈霉菌A318-10為出發(fā)菌株,采用紫外誘變和ARTP誘變2種方式進行評估,選取UV處理60 s后再經ARTP照射35 s,獲得的菌株經兩性霉素B自身抗性篩選,最終獲得一株高產菌株20-2-15,發(fā)酵單位較出發(fā)菌株提高37.5%。該菌株經斜面?zhèn)鞔€(wěn)定性研究,連續(xù)傳代4次,發(fā)酵效價波動水平不超過10%,說明復合誘變策略對結節(jié)鏈霉菌的選育可行有效。

2)采用響應面試驗設計對發(fā)酵配方中的主要碳源和氮源進行優(yōu)化,獲得了適合高產菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基配方,50 L發(fā)酵罐發(fā)酵水平最高可達到21 257 μg/mL,應用于工業(yè)化發(fā)酵生產后可降低生產成本。

工業(yè)發(fā)酵生產兩性霉素B的過程中會產生副產物兩性霉素A。本研究采用的紫外誘變和ARTP誘變都具有操作簡單、突變率高且突變穩(wěn)定性好的特點,但兩者都是在不明晰微生物遺傳背景的條件下進行。后期可考察不同的誘變處理方式對兩性霉素A組分的影響,開發(fā)出新型誘變策略選育菌株,在提高兩性霉素B發(fā)酵水平的同時降低副產物兩性霉素A的含量,降低生產成本。

優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基配方適合簡單的分批發(fā)酵,后續(xù)可開發(fā)分批補料控制工藝,提高底物的利用率,使物質代謝最大程度地向有利于產物合成的代謝途徑進行,提高兩性霉素B的產量。在此基礎上通過代謝組學篩選關鍵前體物質,以關鍵代謝物為物質代謝流的控制節(jié)點,促進兩性霉素 B 的生物合成,同時能夠有效控制副產物兩性霉素A的增長,降低生產成本。