基于CDs@SiNWs的光電化學免疫傳感器構建及性能研究

摘要：

采用金屬輔助化學蝕刻法制備高定向硅納米線陣列（silicon nanowire arrays， SiNWs），結合碳點（carbon dots，CDs）改性制備了一種新型無標記光電免疫傳感器，用于心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I， cTnI）的檢測。N型SiNWs作為光陽極，可獲得強的光電信號基底響應。采用旋涂法將CDs負載于SiNWs表面，可以提高SiNWs對可見光的吸收能力，促進光生載流子分離，從而提高SiNWs的光電性能；同時，CDs為抗體連接提供了羧基活性位點。基于CDs@SiNWs的光電免疫傳感器對cTnI的檢測具有良好的線性范圍（0.005～5.000 ng/mL）和較低的檢出限（3.79 pg/mL）。所設計的光電化學（photoelectrochemical， PEC）免疫傳感器具有良好的靈敏度、穩定性和重復性。該電極可實現無標簽檢測，為實現cTnI的即時檢測提供了新的途徑。

關鍵詞：光電免疫傳感器；心肌肌鈣蛋白 I；硅納米線陣列；碳點

中圖分類號：TQ 127 " " " " " "文獻標志碼：A

Construction and performance of photoelectrochemical

immunosensor based on CDs@SiNWs

HUANG Yueyi， " " "ZHI Shibo， " " "LI Huijun

（School of Materials and Chemistry， University of Shanghai for Science and Technology， Shanghai 200093， China）

Abstract：A novel label-free photoimmunosensor was prepared by metal-assisted chemical etching of highly oriented silicon nanowire arrays （SiNWs） combined with carbon dots （CDs） modification for the detection of cardiac troponin I （cTnI）. N-type SiNWs were used as photoanodes to obtain a strong photoelectric signal response. CDs are loaded on the surface of SiNWs by the spin-coating method. CDs can improve the photoelectric performance of SiNWs by enhancing the absorption of visible light and promoting the separation of photogenerated carriers; meanwhile， CDs provide the carboxyl active site for antibody attachment. The CDs@SiNWs-based immunosensor has a good linear range （0.005-5.000 ng/mL） and a low detection limit （3.79 pg/mL） for the detection of cTnI. The designed photoelectrochemical （PEC） immunosensor has good sensitivity， stability， and reproducibility. The electrode enables label-free detection and provides a new way to achieve immediate detection of cTnI.

Keywords： "photoelectrochemical immunosensor; "cardiac troponin I; "silicon nanowire arrays; "carbon dots

急性心肌梗死（acute myocardial infarction， AMI）已成為最直接危及生命的心血管疾病之一^[1]。心肌肌鈣蛋白I （cTnI）是AMI診斷的主要生物標志物，cTnI的檢測可應用于AMI的早期篩查、診斷和預后^[2]。光電化學（photoelectrochemical， PEC）生物免疫傳感器具有靈敏度高、操作簡單、易于小型化、成本低等優點，被認為是生物分析的有力工具^[3]。

近年來，許多具有優異性能的半導體材料被用于設計光電化學傳感器，硅納米線（（silicon nanowire arrays， SiNWs））是一種窄禁帶（Eg=1.12 eV）半導體材料，具有較低的反射率以改善光捕獲，較大的比表面積以提供更多的活性位點，快速和直接的載流子傳輸途徑以提高載流子的分離效率等優點^[4]，能成為PEC分析的高活性光電材料。碳點（carbon dots，CDs）由于其優異的光學性能、出色的導電性、低生物毒性、高化學穩定性、良好的水溶性等，被廣泛應用于生物醫學等領域^[5-6]。CDs與半導體材料復合，一方面CDs促進電子的轉移，同時可以擴大對光的吸收范圍，增強半導體材料的光電性能^[7-8]。

本文以含有豐富羧基的沒食子酸為前驅體，以N，N?二甲基甲酰胺（DMF）為溶劑，通過溶劑熱法制備了含有羧基的碳點（COOH-CDs）。將制備的COOH-CDs通過旋涂法修飾在SiNWs表面，在提高SiWNs光電性能的同時，為抗體的固定也提供了活性位點；通過系列表征手段對其光電性能進行探究。

1 " "試 驗

1.1 " "CD @SiNWs 的制備

采用金屬輔助化學蝕刻法^[9]制備SiNWs。首先清洗（100）硅片（n型），將硅片放置到濃硫酸：雙氧水體積比為7：1的清洗液中浸泡30 min，依次用丙酮、去離子水（3次）、乙醇、去離子水（3次）進行超聲清洗。將清洗好的硅片，放入5 mol/L氫氟酸和0.04 mol/L硝酸銀混合溶液中蝕刻1 min，去離子水沖洗硅表面多余離子。將沉積好Ag^＋的硅片放入含有0.3 mol/L過氧化氫和5 mol/L氫氟酸混合溶液中蝕刻 1 h。最后將蝕刻好的SiNWs放入濃硝酸溶液中浸泡30 min以上，去除殘余銀納米顆粒得到SiNWs。

以含有豐富羧基的沒食子酸為前驅體，DMF為溶劑，通過溶劑熱法制備COOH-CDs。將200 mg沒食子酸加入到30 mL DMF溶液中，攪拌10 min至溶液澄清；然后將燒杯中溶液轉移到聚四氟乙烯（50 mL）內襯中，將內襯放入不銹鋼高壓反應釜，在180 ℃下溶劑熱反應8 h。反應結束后，將溶液放置24 h后，通過0.22 μm的濾膜真空抽濾，經透析后得到COOH-CDs。COOH-CDs通過旋涂的方法將其修飾在SiNWs表面。旋涂速度設置為3 000 r/min，旋涂時間為30 s；重復3次，得到CDs-SiNWs電極。

1.2"材料表征

采用掃描電子顯微鏡（scanning electron micro-scope，SEM）和透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）分析樣品形貌。采用傅里葉變換紅外光譜儀（Fourier transform infrared spectrometer，FTIR），拉曼光譜儀（Raman spectrometer，Raman），X射線衍射儀（X-ray diffractometer，XRD）分析樣品的相組成和化學鍵合性質。用X射線光電子能譜（X-ray photoelectron spectrometer，XPS）研究樣品物相組成。

1.3" 光電免疫測試

首先，活化負載于電極表面CDs的羧基。將CDs-SiNWs電極浸泡在含有1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞氨（EDC，10 mg/mL）和 N-羥基琥珀酰?亞氨（NHS，10 mg/mL）的混合溶液15 min；然后，將羧基活化后的CDs-SiNWs電極表面滴加0.1 mg/mL的肌鈣蛋白抗體，在37 ℃恒溫箱中孵育1 h（電極放置于濕盒中避免電極表面干燥）；反應結束后，用PBS緩沖液沖洗電極表面得CDs-SiNWs/Ab電極，然后將該電極浸泡在1 mg/mL的BSA溶液中30 min，封閉電極表面活性位點；最后，用PBS沖去未結合的BSA，得到PEC免疫傳感器CDs-SiNWs/Ab/BSA電極。CDs-SiNWs/Ab/BSA免疫傳感器的構建如圖1所示。

采用Ivium電化學工作站對電極進行光電性能測試。選用三電極體系，Ag/AgCl為參比電極，鉑片（Pt）為對電極，樣品為工作電極。PEC檢測過程采用模擬太陽光源，光照強度為100 mW/cm²。測試在PBS（0.01 mol/L，pH=7.2）溶液中進行。進行免疫傳感檢測時，將不同濃度的抗原滴加到電極表面，孵育1 h；孵育完成后PBS緩沖液漂洗，得到的電極進行PEC測試。

2 " "結果與分析

2.1 " "材料結構表征

從圖2（a）上可以看出，在XRD譜圖中29°和41.2°的位置有兩個峰衍射峰，分別對應于石墨的（002）晶面和（100）晶面，可以證明所制備得到的固體是CDs。圖2（a）下為SiNWs電極的XRD譜圖，在69°處出現了硅的特征峰，對應（400）晶面，這表明成功制備出SiNWs^[10]。為了進一步證明CDs成功修飾在SiNWs表面，對修飾前后的SiNWs進行了FTIR測試。如圖2（b）所示，SiNWs在1078cm^?1處的吸收峰是由Si?O的拉伸振動引起^[11]。經CDs修飾后，SiNWs的紅外光譜在3 436、2 934、2 856、1 629、1 430 cm^?1處出現新吸收峰。其中，3 436、1 430 cm^?1的吸收峰歸因于?OH的伸縮振動；2 934、285 6 cm^?1是由于C?H的伸縮振動；1 629 cm^?1是由于C=O的伸縮振動^[12]。紅外光譜表明CDs-SiNWs的表面成功修飾了CDs，并具備用于固定抗體的羧基活性位點。

2.2"材料形貌表征

圖3比較了CDs修飾前后SiNWs形貌的變化。圖3（a）和3（b）是修飾前SiNWs的俯視圖和截面圖，從圖中可以看出SiNWs分布均勻。TEM對CDs微觀形貌進行表征。如圖3（c）和3（d）所示，TEM圖顯示CDs粒徑分布均勻，從高分辨TEM圖中可以看到該CDs具有清晰的晶格條紋，測量其晶格間距為0.33 nm，對應于石墨碳的（002）晶面。圖3（e）和3（f）顯示了修飾CDs后SiNWs的形貌，對比CDs修飾前SiNWs的形貌幾乎沒有發生變化。由于CDs的尺寸只有10 nm左右，且負載量較少，因此，在SEM圖中無法直接觀察到CDs。

2.3"材料成分分析

為了探究CDs是否成功修飾于SiNWs表面，通過XPS對修飾后的SiNWs進行元素分析。如圖4（a）所示，CDs-SiNWs的XPS全譜顯示新增了N。進一步對各元素分析后，圖4（b） C1s高分辨能譜顯示，CDs-SiNWs上存在C=O（288.1 eV）、C?O（286.0 eV）和C?C/C=C（284.6 eV）3種不同類型的碳，這與CDs點中C種類一致^[13]。圖4（c）中N1s高分辨譜中，吡咯N和吡啶N也與CDs保持一致^[14]。圖4（d）中高分辨O1s譜顯示，在533.2、532.2、531.4 eV處存在吸附氧、C?O和C=O，與CDs中O種類相對應^[15-16]。此外，532.2、531.4 eV處C?O和C=O鍵表明CDs-SiNWs表面可能含有?COOH官能團，為后續生物傳感器的構建提供活性位點。

2.4"免疫傳感器性能研究

如圖5（a）所示，CDs修飾首先提高了SiNWs的光電流密度，但隨著Ab、BSA、Ag等蛋白質分子依次負載于電極表面，其光電流密度逐漸下降。圖5（b）的電化學阻抗譜（electrochemical impedance spectroscopy， EIS）表明了蛋白質連接過程中電極表面電阻變化情況。從圖5中可以看到，CDs修飾明顯降低了電極表面阻值，由于蛋白質的絕緣特性，隨著電極表面連接蛋白質數量不斷增加，電極阻值也在逐漸增大。EIS的變化進一步證明了Ab成功固定于電極表面。

將不同濃度的cTnI分別滴加在免疫傳感器電極表面，孵育1 h 后用PBS沖去未結合的抗原。每個濃度準備3個電極為平行實驗。cTnI會與免疫傳感器表面固定好的Ab發生特異性結合，非目標抗原不會結合在電極表面，免疫傳感器在不同濃度的抗原溶液中結合不同數量的抗原；由于空間位阻效應，抗原結合在免疫傳感器表面后，會引起免疫傳感器光電流密度變化。圖6（a）顯示，隨著抗原濃度的增加，光電流密度逐漸降低。為了減少不同批次之間初始空白電極性能波動帶來的影響，用光電流的相對變化值作為對不同濃度cTnI的信號響應值。I₀表示空白電極的光電流值，I表示某濃度cTnI下光電流信號。以光電流下降的百分比（I₀-I）/I₀作為縱坐標，cTnI 濃度取對數作為橫坐標作圖，其線性關系如圖6（b）所示。檢測結果顯示，在0.005～5.000 ng/mL內，cTnI 濃度與光電流下降百分比成線性關系，線性方程為Y=0.434 92+0.179 65X，線性相關系數R²=0.97，cTnI 的檢測下限（LOD）為3.79 pg/mL（S/N=3）。

3"結 論

本文采用金屬輔助化學蝕刻法制備了SiNWs，CDs用于SiNWs表面改性，可促進電子的轉移，并進一步連接cTnI抗體。基于CDs@SiNWs制備的光電免疫傳感器具有較好的檢測性能，在0.005～5.000 ng/mL，cTnI抗體濃度與光電流下降百分比成線性關系，線性方程Y=0.43492+0.17965X，線性相關系數為0.97，cTnI的檢測下限（LOD）為3.79 pg/mL（S/N=3），實現對cTnI的超靈敏檢測，在生物免疫傳感領域具有一定的應用潛力。

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（編輯：畢莉明）