水稻核糖體失活蛋白家族基因OsRIP8的生物信息學與功能分析

摘要：核糖體失活蛋白（RIPs）是一種能使真核細胞核糖體功能被抑制的毒蛋白。OsRIP8是屬于該家族的一個功能未知基因。為研究該基因生物學功能，通過數據庫對其進行生物信息學分析，利用qRT-PCR驗證其表達模式，同時構建OsRIP8-RNAi 干涉載體并利用農桿菌轉化水稻，采用PCR技術鑒定出轉基因陽性植株，分析陽性植株的表達和農藝性狀，初步揭示該基因的功能。結果表明，水稻OsRIP8蛋白為不穩定親水蛋白，不含信號肽及完整的跨膜結構域，蛋白結構以α螺旋為主；在OsRIP8基因啟動子區域存在著與植物生長發育、生物與非生物脅迫以及植物激素響應有關的元件；OsRIP8基因的共表達基因富集到多種大分子的生物合成與蛋白代謝等途徑；qRT-PCR分析結果表明，OsRIP8基因在發育的小穗及抽穗前1 d的花藥中優先表達；RNAi干涉后OsRIP8基因的表達下調造成植株花粉育性和結實率顯著降低。暗示該基因對水稻小穗的發育具有重要作用，可能參與調控花粉發育過程。

關鍵詞：水稻；核糖體失活蛋白；生物信息學分析；功能分析；基因表達

中圖分類號：S511.01" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）04-0071-09

收稿日期：2023-04-12

基金項目：貴州省科學技術基金（編號：黔科合基礎［2020］1Z020）；貴州省農業科學院青年科技基金（編號：黔農科院青年基金［2019］01號）；貴州省科技計劃（編號：黔科合支撐［2022］重點028號）；貴州省水稻研究所青年基金（編號：黔水稻所青年基金［2021］018號）。

作者簡介：徐 婭（1991—），女，貴州貴陽人，碩士，助理研究員，研究方向為水稻生殖發育生物學。E-mail：xu_ya_1991@163.com。

通信作者：李樹杏，碩士，正高級農藝師，研究方向為水稻栽培生理學。E-mail：24406882@qq.com。

核糖體失活蛋白（RIPs）是一類通過去除核糖體RNA的腺嘌呤殘基從而使核糖體結構被破壞無法正常結合蛋白質合成時的延伸因子，進而導致蛋白質生物合成受抑制的一類毒蛋白，大部分存在于植物體中［1］。根據核糖體失活蛋白的大小、結構及組成，一般將RIPs分為3個類型［2］。第Ⅰ類分子量約為30 ku，為單肽鏈，具有RNA N-糖苷酶活性，該類型分布最為廣泛，但由于缺少與細胞結合的配體B鏈而不能進入細胞內，對無細胞結構系統的蛋白合成有抑制作用，對完整細胞的毒性很小［3］。第Ⅱ類分子量約為60 ku，由A鏈和B鏈組成，其中A鏈與Ⅰ型RIPs的多肽鏈相似，B鏈具有凝集素（lectin）活性，能識別并結合細胞膜上的特異受體［4］。第Ⅲ類RIPs是先合成無活性前體，經酶解加工后產生2個大小分別為16.5、8.5 ku的亞基，該類型RIPs較為少見，僅在玉米和大麥中被鑒定出來［5-6］。諸多研究發現，RIPs對病毒、真菌和昆蟲均能產生抗性［7-10］，這為作物病蟲害防治提供了新的解決思路，故而RIPs的功能研究受到植物抗病蟲害領域研究者的普遍關注。

早期已報道的RIPs多以煙草為受體植物進行試驗，Huang等從麻瘋樹幼苗中分離出核糖體失活蛋白（curcin 2）的cDNA，將其轉入煙草后發現轉基因植株立枯絲核菌的抗性增加顯著［11］；Krishnan等將來自于藥用植物栝樓的天花粉蛋白（TCS）重組后轉入煙草，轉基因煙草植株對于黃瓜花葉病毒和煙草花葉病毒（TMV）的感染較對照有所延遲且癥狀較輕［12］。后來轉RIPs基因的受體植物拓展至水稻等糧食作物上，例如在Qian等的研究中，在水稻中異源表達苦瓜素（α-MC）可有效防止轉基因水稻中稻瘟病的發生［13］；Kim等認為幾丁質酶與核糖體失活蛋白具有很強的協同作用，他們將水稻幾丁質酶基因同玉米核糖體失活蛋白基因協同在轉基因水稻中表達，最終獲得紋枯病抗性植株［14］。這些研究均圍繞外源基因展開。近些年有幾個水稻自身RIP基因被克隆出來，這些RIPs在體外試驗以及轉基因植株中對病蟲害都具有一定的抗性。在水稻中過表達水稻RIP基因OsRIP8后，水稻對干旱和鹽脅迫的耐受性比野生型顯著提高［15］；de Zaeytijd等發現在被褐飛虱侵染的水稻植株中，OsRIP1的表達被高度誘導，其重組蛋白對褐飛虱有一定的毒力，能在體外滅活昆蟲核糖體［16］；Wytynck等構建了過表達OsRIP1以及nuRIP的轉基因株系，溫室條件下過表達nuRIP的植株莖長顯著縮短。此外，還研究了轉基因幼苗對干旱、鹽、脫落酸和茉莉酸甲酯處理的響應性能，結果表明，這2種RIP均可影響茉莉酸甲酯介導的脅迫反應［17］。Jiang等和Wytynck等2個團隊先后鑒定了水稻全基因組中的核糖體失活蛋白［18-19］，絕大部分未見功能報道。

本研究發現水稻RIPs家族基因OsRIP8在水稻小穗中高表達，暗示其對于水稻生殖發育具有重要作用。采用生物信息學的方法對水稻OsRIP8蛋白的結構、功能和基因表達模式等進行分析，構建OsRIP8干涉載體并轉化水稻獲得表達量下調的轉基因植株，對轉基因植株及野生型植株農藝性狀進行觀察與統計對比，初步揭示OsRIP8在水稻中的生物學功能。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試水稻品種 本研究采用的水稻品種是粳稻中花11號（Zhonghua11，ZH11），于2019年種植于華中農業大學試驗田。

1.1.2 菌株與載體 本研究所用菌株有克隆菌株大腸桿菌DH5α，水稻遺傳轉化菌株農桿菌EHA105。常用載體有T載體pMD18-T（TaKaRa公司）；RNAi載體為pDS1301。

1.1.3 試劑與儀器 抽提RNA所用的RNAiso、RNase-free DNaseⅠ、擴增基因序列所用LA Taq酶及熒光定量所用 的SYBR Premix EX Taq Master Mix、 ROX Reference DyeⅡ均購自TaKaRa公司；消化30 min去除DNA。反轉錄使用的酶M-MLV購自Promega公司，引物為oligo（dT）。所用儀器是ABI StepOneTM 實時熒光定量PCR儀。

1.2 生物信息學分析

1.2.1 水稻 OsRIP8蛋白的性質和結構分析 水稻OsRIP8蛋白的性質和結構分析通過 Protparam （https：//web.expasy.org/protparam/）所提供的蛋白序列分析工具，對OsRIP8蛋白的理化性質（分子量、理論pI、正負電荷殘基總數及半衰期等）進行預測與分析。利用 ProtScale （https：//web.expasy.org/protscale/）預測疏水性/親水性，用SignalP （https：//services.healthtech.dtu.dk/service/Singal P- 3.01）對蛋白質的信號肽進行預測，用TMHMM（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）預測其跨膜結構域，用NetPhos（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？NetPhos-3.1）預測磷酸化位點。通過SMART工具 （http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析 OsRIP8蛋白的結構域，利用在線網站 PSIPRED （http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）對OsRIP8蛋白的二級結構進行預測，利用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）同源建模網站預測 OsRIP8蛋白的三級結構。

1.2.2 水稻OsRIP8基因共表達基因的GO富集和KEGG富集分析 通過IC4R數據庫（http：//expression.ic4r.org/co-search）中的共表達數據，篩選皮爾遜相關系數（Pearson correlation coefficient，PCC）大于0.8的基因作為OsRIP8基因的共表達基因。然后通過agriGO 網站（http：//systemsbiology.cau.edu.cn/agriGOv2/）以及Kobas網站（http：//kobas .cbi.pku.edu.cn/genelist/）對這些基因進行GO富集和KEGG富集分析。

1.2.3 水稻OsRIP8基因表達分析與啟動子順式作用元件分析 OsRIP8基因在明恢63（MH63）各發育階段的表達數據從CREP數據庫獲得（http：//crep.ncpgr.cn/）。選取OsRIP8基因起始密碼子ATG上游2 kb的DNA序列，利用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）網站進行OsRIP8啟動子順式作用元件分析。

1.3 RNA提取、反轉錄和實時熒光定量PCR檢測

水稻樣品RNA抽提采用TRIzol抽提試劑盒（Invitrogen，USA）進行，樣品（新鮮葉片或者稻穗等）經液氮充分研磨，具體操作步驟詳見試劑盒說明書。提取完成后自然風干，加入滅菌的DEPC水20 μL溶解，于Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies，美國）檢測RNA質量，-80 ℃保存備用。

取抽提好的RNA 5 μL作為模板，加入1 μL DNase 和1 μL DNase Buffer，混勻，于37 ℃消化 30 min，以去除RNA樣品中的DNA污染。RNA的反轉錄采用M-MLV反轉錄酶進行操作，具體操作詳見說明書。反轉錄產物于-20 ℃保存備用。

RNAi轉基因植株的表達量檢測以及基因表達譜檢測，引物為QRIP8-F/R（表1），均采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）儀進行檢測分析，循環數設為40個，具體分析操作參照2×SYBR Premix EX Taq（TaKaRa）試劑盒以及儀器提供的標準定量PCR分析方法。每個樣品3次重復，以Ubiquitin作為內參基因，引物信息見表1。

1.4 OsRIP8-RNAi干涉載體的構建及遺傳轉化

OsRIP8-RNAi干涉轉化載體的構建：采用pDS1301，根據基因的編碼序列（CDS）設計擴增產物為447 bp的特異引物IRIP8-F/R，見表1。特異片段經PCR擴增后連T載體，測序確定片段正確后，釆用雙酶切獲得目的片段，并分別連到pDS1301的多克隆位點。

采用CaCl2法將構建好的載體轉至農桿菌菌株EHA105中，挑取陽性農桿菌菌液保存備用。農桿菌介導的水稻愈傷遺傳轉化受體材料為ZH11，具體操作流程參照Wu等建立的高效水稻遺傳轉化體系［20］。

1.5 轉基因植株DNA提取、PCR陽性檢測

水稻樣品DNA提取采用改進的CTAB法（小樣快速制備法），具體操作步驟參照Hills 等的方法［21］，沉淀自然風干后，加30～50 μL ddH2O溶解，-20 ℃保存備用。

RNAi轉基因植株通過PCR進行陽性檢測，以潮霉素引物Hpt-F/R對RNAi轉基因植株進行PCR陽性檢測（表1）。選取陽性植株進行加代種植以及后續試驗。

1.6 轉基因植株表型鑒定及農藝性狀統計

對RNAi轉基因植株以ZH11為對照，觀察記錄突變體和RNAi轉基因植株的農藝性狀，包括結實率、萌發率、花粉育性等。收取種子后，對結實率等農藝性狀進行考察分析，每個家系選取20個單株進行考種，采用Excel 2013進行數據統計和差異顯著性分析。

使用1% I2-KI溶液檢測花粉育性（即淀粉積累）。材料取自RNAi轉基因植株和野生型，每個家系取25個單株，每個單株取3個不同稻穗上的3朵小花。將碘液滴加在玻片上，然后將花粉粒剝離并置于滴有碘液的玻片上，用鑷子擠壓，使花粉游離在玻片上，染色2～3 min后蓋上蓋玻片鏡檢觀察。同樣剝取即將開放的小花，放置于滴有萌發液的載玻片上進行萌發，取樣數量、方法與碘染相同。萌發環境濕度需大于90%，溫度為35 ℃。制好的片子用光學顯微鏡（BX53，Olympus，日本）觀察，用SPOT FLEXTM CCD（Diagnostic Instrument，美國）進行顯微攝影，獲得的花粉育性數據采用Excel 2013統計并進行差異顯著性分析。

1.7 水稻OsRIP8基因的克隆

根據OsRIP8的CDS加入酶切位點及保護堿基設計克隆引物CRIP8-F/R（表1），以中花11的 cDNA 為模板進行擴增。擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用回收試劑盒回收后進行TA克隆，轉化后對菌液進行測序。

2 結果與分析

2.1 水稻OsRIP8蛋白的性質

水稻OsRIP8基因的基因組序列全長5 387 bp，包括4個內含子、5個外顯子。CDS 全長1 062 bp，編碼353個氨基酸。OsRIP8蛋白分子量為 39.621 7 ku，理論pI為8.7，負電荷殘基總數（Asp+Glu）為43，正電荷殘基總數（Arg+Lys）為47，分子式：C1 764H2 820N486O517S16，總原子數為5 603，脂肪酸指數為90.88，不穩定指數（Ⅱ）為 41，該蛋白為不穩定蛋白。OsRIP8蛋白磷酸化位點有35個，包括 Ser 17個、Thr 12個和 Tyr 6個（圖1-A）。信號肽平均分值（S值）為 0.004 7，說明該蛋白不含有信號肽（圖1-B）。平均親水性（GRAVY）為 -0.256，為親水蛋白（圖1-C）。該蛋白不存在完整的跨膜結構（圖1-D）。

2.2 水稻OsRIP8蛋白的結構

二級結構預測結果顯示，OsRIP8蛋白有3種二級結構，其中α螺旋有167個氨基酸殘基參與，占 47.31%；延伸鏈有45個氨基酸殘基參與，占12.75%；無規則卷曲有141個氨基酸殘基參與，占39.94% （圖2-A）。從三級結構可以看出，水稻OsRIP8蛋白的三級結構以α螺旋為主（圖2-B）。

2.3 水稻OsRIP8基因共表達基因的GO富集和KEGG富集

為探索OsRIP8可能的調控機制，在IC4R數據庫中檢索與其表達相關系數超過0.8的基因，得到共表達基因609個。共表達基因功能注釋主要富集在大分子分解代謝過程（GO：0043632）、蛋白質氨基酸去磷酸化（GO：0006470）、調節細胞蛋白質代謝過程（GO：0032268）、翻譯調控（GO：0006417）、基因表達轉錄后調控（GO：0010608）、細胞大分子分解代謝過程（GO：0044265）、絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶活性（GO：0004722）、磷酸蛋白磷酸酶活性（GO：0004721）、水解酶活性（GO：0016799）、磷酸酯水解酶活性（GO：0042578）（圖3-A）。KEGG 富集40個代謝通路，包括泛素介導的蛋白質水解，甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸代謝，異喹啉生物堿的生物合成，內質網中的蛋白質加工，莨菪烷、哌啶和吡啶生物堿的生物合成，鞘糖脂生物合成，糖胺聚糖降解，生物素代謝，角質、蠟質的生物合成，氮代謝，脂肪酸合成與代謝，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成等多種物質代謝過程（圖3-B）。

2.4 水稻OsRIP8基因啟動子元件

在水稻OsRIP8基因啟動子區域，除存在RNA聚合酶結合位點 TATA-box、CAAT-box 等基本調控元件外，還存在與植物生長發育相關的其他元件，如胚乳特異性元件、分生組織特異性元件，與脅迫相關的干旱誘導元件、光誘導元件，還有一些激素響應元件，如生長素響應元件、脫落酸響應元件（表2）。從OsRIP8基因啟動子區域具有的順式作用元件種類和數量推測，OsRIP8基因的表達可能受光、激素、脅迫的誘導，且參與植物器官的生長與發育。

2.5 水稻OsRIP8基因的克隆

從粳稻品種中花11號中提取總RNA，經反轉錄得到cDNA，用于基因克隆。設計克隆引物，以cDNA為模板對OsRIP8進行擴增，擴增產物經電泳檢測，獲得與預期大小（1 059 bp） 一致的特異性條帶。純化回收PCR 產物進行TA 克隆（圖4），挑選單菌落測序，測序結果與密歇根州立大學水稻基因組注釋項目（MSU-RGAP）公布的OsRIP8的 CDS 完全一致，確定擴增產物就是目的基因OsRIP8。

2.6 水稻OsRIP8基因的表達譜驗證

以芯片表達數據分析結果來看，OsRIP8表現為幼穗優先表達模式（圖5-A）。為驗證其表達模式，取抽穗前1 d的根、莖、劍葉；P3～P8期（1 mm長到抽穗前）的小穗；抽穗前1 d的花藥；開花前1 d的內外稃；開花前1 d除去花藥的其他組織。采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）進行表達量檢測，結果表明OsRIP8在P6（花粉母細胞減數分裂期）到P8（花粉完熟期）期的小穗以及開花前1 d的花藥中表達量較高（圖5-B），和芯片數據一致。

2.7 OsRIP8-RNAi T1代轉基因植株的獲得和表型分析

通過Blast（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）尋找OsRIP8基因的特異片段， 以此設計OsRIP8基因的RNAi引物（表1），以中花11（ZH11）的P6期小穗cDNA為模板，PCR擴增出相應片段，大小為447 bp，采用SpeⅠ/SacⅠ和KpnⅠ/BamHⅠ雙酶切的方法將獲得的片段連接到RNAi載體pDS1301上，構建好的RNAi載體采用農桿菌介導的遺傳轉化方法轉化ZH11種子誘導的愈傷組織，得到OsRIP8的RNAi轉基因植株11株。通過潮霉素進行篩選，獲得獨立的T0代轉基因陽性植株9株。熒光定量PCR檢測其干涉效率。最后，選擇轉基因陽性單株中表達量低、中、高3個層次的單株進行傳代種植（圖6-A）。

選取T0代株系中的RIP8-2、RIP8-8、RIP8-10在華中農業大學實驗基地進行加代種植，對T1代不同株系進行陽性檢測（圖6-B），對純合家系進行農藝性狀的考察。發現OsRIP8-RNAi T1代轉基因植株在營養生長階段與野生型相比無明顯異常，而碘染的結果表明其成熟花粉育性與野生型相比明顯下降，在成熟花粉萌發正常的情況下（圖 6-C至圖6-F），其結實率與對照相比極顯著降低（表3）。

3 討論

盡管關于RIPs的研究早在20世紀90年代就有報道，當時大多是分離出表達量很高的一些毒蛋白例如蓖麻毒蛋白［22］，后來隨著全基因組測序和生物信

息學技術的發展，很多無法被直接純化的RIPs被鑒定出來，其中就包括水稻全基因組中的RIPs［18-19］。水稻中OsRIP1、OsRIP18和nuRIP等3個基因曾有功能分析報道，除此之外絕大多數水稻RIPs基因的功能仍不清楚。本研究在對水稻RIPs基因家族進行表達分析時發現該家族基因OsRIP8在水稻幼穗中優先表達，對其進行進一步的生物信息學分析和初步的功能分析。結果表明，OsRIP8在花粉母細胞減數分裂期的小穗中表達量最高，該基因表達下調導致花粉育性降低，結實率下降，推測該基因參與水稻生殖發育。

OsRIP8蛋白不含信號肽，這種沒有信號肽的RIPs基因很可能定位于植物核糖體附近的細胞質中［23］。OsRIP8蛋白屬于親水蛋白且不含完整的跨膜結構域，推測其不參與物質的跨膜運輸。GO及KEGG富集分析結果表明，OsRIP8的共表達基因主要富集在大分子分解代謝、蛋白質代謝過程的調節，參與調控磷酸酶、磷酸酯水解酶活性，參與轉錄后調控和翻譯調控；主要富集的代謝通路包含蛋白質水解、各種氨基酸代謝、各類生物堿、鞘糖脂、角質和蠟質的生物合成。推測OsRIP8共表達基因可能參與翻譯和轉錄后調控以及酶活調節來控制各類大分子的代謝及生物合成。在水稻OsRIP8基因啟動子區域包括與植物生長發育有關的元件，如胚乳特異性元件、分生組織特異性元件、晝夜節律控制元件；與脅迫有關的干旱誘導元件、光誘導元件；還有一些激素響應元件，如生長素響應元件、脫落酸響應元件、赤霉酸響應元件等。赤霉素和光周期是植物花期調控中的2條通路［24］，結合OsRIP8基因表達模式，推測該基因受光、激素、脅迫的誘導，參與植物花期調控及植物的生長與發育。OsRIP8-RNAi T1代株系可育花粉比例在57.25%～84.63%之間且萌發正常，但相應的結實率卻在36.88%～52.25%之間，且在其啟動子區域發現了和胚乳發育有關的元件GCN4-motif及O2-site，因此推測OsRIP8基因除了影響花粉發育外可能也參與雌配子或者胚乳的發育。GCN4-motif是一種在谷作物種子貯藏蛋白啟動子中高度保守的順式元件，對控制醇溶蛋白和谷蛋白的胚乳特異性表達起著核心作用［25-26］。本研究只涉及試驗材料的創建和初步的表型觀察，該基因在水稻生殖發育中的具體功能和機制還有賴于更多遺傳材料的創建和進一步研究。下一步將補充CRISPR/cas9突變體植株及超表達植株，對這些轉基因植株在小穗和胚乳發育時期分別進行干旱、光和激素誘導處理，對其花粉、胚囊和胚乳發育及花期等性狀進行對比，進一步明確OsRIP8在水稻生殖發育中的功能。

4 結論

OsRIP8基因在花粉母細胞減數分裂期到花粉完熟期的小穗中高表達；OsRIP8的表達下調造成植株花粉育性和結實率降低。暗示該基因對水稻小穗的發育具有重要作用，可能受光、激素、脅迫的誘導參與調控水稻生殖發育過程。

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