甘薯苗期黑斑病對薯苗生長的影響及藥劑浸種對黑斑病的防治效果

關(guān)鍵詞甘薯；甘薯長喙殼；甘薯苗期黑斑病；浸種；產(chǎn)苗量

甘薯是重要的糧食作物，也是營養(yǎng)全面的健康食品，我國甘薯產(chǎn)量占世界總產(chǎn)的近60%。由甘薯長喙殼Ceratocystis firnbriata Ellis et Halsted侵染引起的甘薯黑斑病是重要的甘薯病害。甘薯黑斑病在育苗期、生長期和儲藏期均可發(fā)生，由該病造成的產(chǎn)量損失為5%～10%，甚至更高。育苗期發(fā)生黑斑病會影響薯苗的產(chǎn)量和質(zhì)量，病苗移栽到大田還可造成大田死苗和土壤帶菌，導(dǎo)致缺苗斷壟和病害進一步蔓延。

我國于20世紀(jì)50年代開始研究甘薯苗期黑斑病的防治技術(shù)，主要措施包括種薯藥劑處理、溫湯浸種，以及頓水頓火育苗等；也有高剪苗和藥劑處理薯苗預(yù)防大田期甘薯黑斑病發(fā)生的報道。美國也通過藥劑處理種薯防治黑斑病等多種病害。隨著育苗技術(shù)發(fā)展和種植模式的變化，甘薯育苗主要由種苗生產(chǎn)企業(yè)和種植專業(yè)戶在溫室大棚等固定設(shè)施內(nèi)進行，苗床的連年使用增加了苗床的帶菌量和黑斑病發(fā)生風(fēng)險，部分防治措施也已不適合當(dāng)前薯苗生產(chǎn)，甘薯苗期黑斑病的防控水平急需提高。

研究發(fā)現(xiàn)，育苗初期發(fā)生的甘薯黑斑病可導(dǎo)致幼芽變黑腐爛，但因從地表觀察不到幼芽破土前的發(fā)病癥狀，只能從出苗遲早、多少和薯苗顏色去推斷是否有黑斑病發(fā)生。以往研究均以成苗數(shù)量和成苗的發(fā)病率作為防控效果的評價指標(biāo)，未見對出芽、破土階段薯苗黑斑病的詳細(xì)調(diào)查和防控措施的效果評價。因此，從種薯出芽階段研究種薯或苗床帶菌對苗期黑斑病發(fā)生和薯苗生長的影響，篩選有效的防控藥劑，對于提高黑斑病防控水平具有重要意義。

目前，在甘薯上登記的防治苗期黑斑病的藥劑較少。此前作者曾與拜耳有限責(zé)任公司合作開展試驗，發(fā)現(xiàn)25%肟菌·異菌脲懸浮劑浸種對苗期黑斑病有較明顯的防治效果。在此基礎(chǔ)上，本研究擬通過人工接種使種薯或育苗基質(zhì)攜帶黑斑病菌，再利用不同劑量藥劑處理，研究苗期黑斑病對薯塊出芽和薯苗生長的影響，進一步明確25%肟菌·異菌脲懸浮劑浸種對苗期黑斑病的防治效果，期望為甘薯苗期黑斑病的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

供試甘薯品種及菌株：供試品種為‘商薯19’。甘薯長喙殼由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所分離，菌株編號CFSC-01（CGMCC

No.3.18030），將菌株在PSA平板上25℃避光培養(yǎng)10d，無菌水洗下分生孢子，根據(jù)試驗要求調(diào)節(jié)孢子懸浮液至合適的濃度，備用。

藥劑與試劑：試驗藥劑25%肟菌·異菌脲懸浮劑（trifloxystrobin．iprodione 25% SC），拜耳有限責(zé)任公司；對照藥劑36%甲基硫菌靈懸浮劑（ thio-phanate-methyl 36% SC），江蘇藍(lán)豐生物化工股份有限公司。Ezup柱式DNA抽提試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司；rTaq DNA聚合酶和DL2000 DNA Marker，寶生物工程（大連）有限公司；其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

儀器：Axio Scope. A1型正置顯微鏡，德國CarlZeiss公司；FYL-YS-280L恒溫箱，北京福意電器有限公司；96-Well Thermal Cycler PCR擴增儀，美國ThermoFisher公司；JY600HE電泳儀，北京君意東方儀器廠；Fresc0 17離心機，美國Thermo Fisher公司；Alphalm-agernNi凝膠成像系統(tǒng)，美國Protein Simple公司。

1.2方法

1.2.1苗床接菌及藥劑浸種試驗

為初步評價25%肟菌·異菌脲懸浮劑浸種對甘薯苗期黑斑病的防治效果，2018年和2019年在育苗期進行了試驗。采取拱棚育苗，育苗小區(qū)為長方形（1.1m×1m），四周用土埂與其他小區(qū)隔開，單獨灌水。25%肟菌·異菌脲懸浮劑浸種處理的藥液質(zhì)量濃度分別為250、333、500mg/L，36%甲基硫菌靈懸浮劑藥液質(zhì)量濃度500mg/L，另設(shè)清水對照處理。每處理4次重復(fù)，將薯塊在藥液中浸10min后取出晾干備用。人工接種在排種后隨灌水進行，每小區(qū)使用孢子含量為1×106個/mL的甘薯黑斑病菌孢子懸浮液0.3L。浸種前稱量各小區(qū)種薯重，當(dāng)薯苗長至5葉或株高達到25cm時達到成苗調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)，拔出小區(qū)內(nèi)所有符合標(biāo)準(zhǔn)的薯苗進行病株率和成苗量調(diào)查，根據(jù)薯塊出苗先后共調(diào)查4次。

1.2.2種薯接菌及藥劑浸種試驗

種薯接菌方法：使用孢子含量為5×105個/mL的甘薯黑斑病菌分生孢子懸浮液與潤濕的蛭石和珍珠巖組成的接種載體混勻（接種載體與孢子懸浮液體積比6. 5：1），然后將大小均勻、無損傷的健康薯塊埋入接種載體，25℃保濕48h，獲得帶菌種薯，此時種薯外表無病斑顯現(xiàn)。

藥劑浸種及育苗方法：25%肟菌·異菌脲懸浮劑浸種的藥液質(zhì)量濃度分別為250、333mg/L和500mg/L，另設(shè)清水對照處理（CK1）和未接種甘薯黑斑病菌的健康種薯處理（CK2）。育苗在塑料筐（60cm×50cmX25cm）中進行，育苗基質(zhì)為蛭石和草炭，體積比為3：1，每筐30塊種薯為一個重復(fù)，每處理重復(fù)3次，浸種前稱量各重復(fù)薯塊總重。將薯塊在藥液中浸10min，晾干后排種育苗。當(dāng)薯苗生長至5～6片葉時達到成苗標(biāo)準(zhǔn)，拔出成苗進行調(diào)查，統(tǒng)計每重復(fù)成苗數(shù)和病苗數(shù)，根據(jù)薯塊出苗先后共進行4次薯苗調(diào)查。為觀察出芽和破土過程中發(fā)病對薯苗的影響，第1次調(diào)查時，每筐挖出10個薯塊，對薯塊上所有幼苗的發(fā)病情況進行統(tǒng)計，后3次調(diào)查只針對成苗。

1.2.3育苗基質(zhì)接菌及藥劑浸種試驗

育苗基質(zhì)的配比同1.2.2，甘薯黑斑病菌孢子懸浮液濃度為2×105個/mL，每筐基質(zhì)與3L孢子懸浮液均勻混合，用于種薯育苗。種薯選擇、每重復(fù)薯塊數(shù)、浸種處理以及育苗和調(diào)查方法同1.2.2，同樣設(shè)清水對照（CK1）和健康薯塊在未接菌基質(zhì)中育苗的處理（CK2）。

1.2.4出芽和破土階段黑斑病發(fā)生情況調(diào)查及帶菌情況檢測

從筐中挖出薯塊時，觀察記載種薯發(fā)芽階段和薯苗不同生長階段的發(fā)病情況。每處理3個重復(fù)共挖出30個薯塊，從中隨機抽取種薯帶菌和基質(zhì)帶菌試驗CK1處理的15個薯塊，統(tǒng)計薯苗的發(fā)病部位；取每個重復(fù)顯癥薯苗和無癥薯苗各7株，取樣部位為顯癥薯苗的病斑部分和無癥薯苗的白色莖基部，利用PCR技術(shù)檢測帶菌情況。檢測方法如下，根據(jù)GenBank中登錄的甘薯長喙殼甘薯分離物的Cera-to-platanin基因序列設(shè)計1對引物：CFCPF417：5-gttctctatcctacccatgat-3;CFCPR417：5-gacgttgtcga-cacggccagct-3。截取取樣部位的莖段約1cm長，在干凈研缽中加液氮充分研磨，使用Ezup柱式DNA抽提試劑盒提取樣品總DNA。20uL PCR反應(yīng)體系：rTaq預(yù)混酶1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3數(shù)據(jù)分析方法

試驗數(shù)據(jù)利用DPS18.10軟件進行統(tǒng)計分析，采用Duncan氐新復(fù)極差法進行差異顯著性檢驗。

2結(jié)果與分析

2.1 25%肟菌·異菌脲懸浮劑浸種對苗床接菌后黑斑病的防治效果

苗床拔苗調(diào)查表明，25%肟菌·異菌脲懸浮劑250、333mg/L和500mg/L 3個處理的薯苗發(fā)病率隨藥液濃度的增加而降低，2018年分別為7.53%、3.33%和2.45%; 2019年分別為15.96%、13.01%和8.20%，中高濃度處理的發(fā)病率顯著低于空白對照，低于對照藥劑36%甲基硫菌靈SC處理。對應(yīng)的千克種薯產(chǎn)苗量隨藥液濃度的增加而增加，2018年分別為63.11、90.87株和126.92株，中高濃度處理顯著高于空白對照和對照藥劑處理；2019年分別為66.86、77.56株和85.31株，呈逐漸增加趨勢（表1）。由結(jié)果可知25%肟菌·異菌脲懸浮劑浸種薯，可有效防治苗期黑斑病的發(fā)生，增加產(chǎn)苗量。

2.2種薯接菌條件下25%肟菌·異菌脲懸浮劑浸種對薯苗黑斑病的防治效果

調(diào)查結(jié)果表明（表2），帶菌種薯育苗，所有處理的千克種薯出芽數(shù)在134.96～157.09株之間，處理間差異不顯著。藥劑浸種可減少萌發(fā)的幼芽發(fā)病，25%肟菌·異菌脲懸浮劑250、333mg/L和500mg/L處理的發(fā)病率在45.81%～47.34%之間，均顯著低于未藥劑浸種處理（CK1）的發(fā)病率。

采苗調(diào)查表明，健康種薯育苗（CK2）的千克種薯產(chǎn)苗量顯著高于其他處理，達到102.06株，未經(jīng)藥劑浸種的帶菌種薯育苗（CK1）的千克種薯產(chǎn)苗量最少，為57.10株，產(chǎn)苗量減少43.97%。帶菌種薯經(jīng)25%肟菌·異菌脲懸浮劑浸種處理的千克種薯產(chǎn)苗量隨藥液濃度的提高而增加，其中500mg/L處理的千克種薯產(chǎn)苗量為74.12株，顯著高于CK1處理。25%肟菌·異菌脲懸浮劑浸種的3個處理薯苗發(fā)病率在35.02%～39.69%之間，處理間差異不顯著，但均顯著低于CK1處理（表2）。調(diào)查結(jié)果表明，帶菌種薯育苗對出芽數(shù)量沒有明顯影響，但會引起萌發(fā)的幼芽和薯苗發(fā)病，顯著減少產(chǎn)苗量。

2.3育苗基質(zhì)接菌條件下25%肟菌·異菌脲懸浮劑浸種對薯苗黑班病的防治效果

調(diào)查結(jié)果表明（表3），育苗基質(zhì)帶菌時，所有處理的千克種薯出芽數(shù)在121.10～138.30株之間，處理間差異不顯著。25%肟菌·異菌脲懸浮劑250、333mg/L和500mg/L浸種處理的發(fā)病率在35.98%～40.46%之間，均顯著低于未經(jīng)藥劑浸種的清水對照（CK1），表明藥劑浸種薯可降低幼芽的發(fā)病率。

采苗調(diào)查表明，基質(zhì)未接菌的對照處理（CK2）千克種薯產(chǎn)苗量達到98.70株，顯著高于其他處理；種薯未經(jīng)藥劑浸種的對照（CK1）千克種薯產(chǎn)苗量最少，為39.66株，產(chǎn)苗減少59.82%。25%肟菌·異菌脲懸浮劑浸種的3個處理千克種薯產(chǎn)苗量隨藥液濃度的提高而增加，薯苗發(fā)病率明顯降低，其中500mg/L處理的千克種薯產(chǎn)苗量為69.56株，薯苗發(fā)病率為36.49%，與CK1差異顯著（表3）。說明育苗基質(zhì)帶菌對種薯出芽數(shù)量沒有明顯影響，但會引起萌發(fā)的幼芽和薯苗發(fā)病，顯著減少產(chǎn)苗量。

2.4苗期黑斑病對薯苗生長的影響

通過對正在出苗的薯塊進行調(diào)查，結(jié)果表明，種薯帶菌或育苗基質(zhì)帶菌引起的幼苗發(fā)病，在種薯萌芽初期，幼苗中上部易受侵染，受害部位縊縮（圖1a），病斑擴大可造成頂芽或中上部枯萎壞死（圖1b），使幼苗生長嚴(yán)重受限。幼苗中上部的發(fā)病率高于其他部位的發(fā)病率，種薯帶菌和基質(zhì)帶菌時幼苗中上部的發(fā)病率分別為40.88%和36.60%（表4）。幼苗中下部在生長過程中，受侵染后會形成病斑（圖1c），隨著薯苗的生長，發(fā)病部位的病斑會繼續(xù)發(fā)展（圖1d）。在幼苗破土過程中，可出現(xiàn)多部位同時受害的現(xiàn)象（圖1e），發(fā)病幼苗破土后表現(xiàn)出中上部枯萎的現(xiàn)象（圖1f），生長基本停滯。隨育苗時間延長，種薯也開始出現(xiàn)癥狀（圖1g），與薯塊相連接的薯苗莖基部受害現(xiàn)象開始增多（圖1h），隨癥狀加重部分薯苗形成典型的“黑腳”苗（圖1i），與健康薯苗（圖1j）相差很大。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，種薯帶菌和育苗基質(zhì)帶菌引起的薯苗發(fā)病過程和癥狀相同，均可引起幼苗中上部枯萎壞死，以及破土后中上部枯萎、生長停滯，是造成產(chǎn)苗量減少的主要原因。

PCR檢測結(jié)果表明，種薯帶菌和基質(zhì)帶菌處理中顯癥薯苗樣品的黑斑病菌檢出率均為100%，無癥幼芽樣品的檢出率分別為85.71%和90.48%（表4），表明種薯帶菌和基質(zhì)帶菌均可引起薯苗和幼芽帶菌。

3結(jié)論與討論

本研究采用薯塊無損接種黑斑病菌技術(shù)，使甘薯種薯帶菌，通過灌水接菌和基質(zhì)接菌的方法使苗床帶菌。將薯塊出芽和薯苗破土過程中黑斑病的發(fā)生情況統(tǒng)計與產(chǎn)苗調(diào)查相結(jié)合，明確了種薯或苗床攜帶黑斑病菌對種薯出芽無明顯影響，但病原菌侵染會導(dǎo)致幼芽發(fā)病，引起薯苗死亡或生長停滯，是產(chǎn)苗量減少的主要原因。甘薯幼苗破土前頂端或中上部易受黑斑病菌侵染，造成壞死枯萎，符合甘薯黑斑病可在育苗初期發(fā)生的論斷，與馬鈴薯晚疫病發(fā)生導(dǎo)致薯芽出土前腐爛，其幼芽的中部、頂端先受侵染的現(xiàn)象類似。明確甘薯苗期黑斑病的發(fā)病過程和引起產(chǎn)苗量減少的原因，有助于對甘薯黑斑病的精準(zhǔn)防控，提高甘薯黑斑病的防控效果。

肟菌酯有良好的內(nèi)吸性和向上傳導(dǎo)的特性，可抑制甘薯黑斑病菌生長。異菌脲是保護性殺菌劑，已在甘薯儲藏期使用，也被證明施用于馬鈴薯種薯的幼芽時可在幼芽內(nèi)傳導(dǎo)，能有效抵御病原菌侵染。在本研究中，不同帶菌情況下，使用25%肟菌·異菌脲懸浮劑浸種，成苗量均隨藥劑處理濃度的增加而增加，表明該藥劑能夠有效防控薯苗黑斑病，增加成苗量。目前我國僅登記有5種藥劑防治甘薯黑斑病．本試驗的開展為25%肟菌·異菌脲懸浮劑在甘薯生產(chǎn)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

25%肟菌·異菌脲懸浮劑不同濃度處理的幼芽發(fā)病率差異不明顯，可能與嫩芽易于被侵染且病害發(fā)展較快，不能進行分級調(diào)查有關(guān)。基質(zhì)帶菌時，整個苗床病原菌分布均勻，可持續(xù)侵染薯苗；種薯帶菌時，菌源初期主要集中于薯塊周圍，隨著薯苗生長，相對幼嫩的中上部組織會遠(yuǎn)離菌源集中區(qū)域。本次試驗中基質(zhì)帶菌和種薯帶菌的成苗發(fā)病率隨藥劑濃度變化的趨勢不一致，反映出不同帶菌情況下藥劑對薯苗的保護效果有差別。

前人研究發(fā)現(xiàn)，秋季收獲的無黑斑薯塊表面粘附的黑斑病菌可侵染薯塊，但通過藥劑處理薯塊可獲得無病種薯。結(jié)合本研究明確的苗期黑斑病的發(fā)生特點和種薯、基質(zhì)帶菌對發(fā)病的影響，可將防治時期前移，嚴(yán)控甘薯種薯和苗床帶菌，加強種薯入窖前藥劑處理和苗床消毒是防治甘薯黑斑病的重要環(huán)節(jié)，因此有必要進一步開展種薯和苗床處理藥劑的篩選和配套使用技術(shù)研究。