西瓜葉斑病病原菌的鑒定及室內藥劑篩選

關鍵詞西瓜；瓜類尾孢；多基因序列聯合分析；毒力測定

西瓜為一年生蔓生草本植物，果實甘甜多汁，營養豐富，深受消費者喜愛；西瓜生長周期短，經濟價值高，深受種植戶喜愛。據FAO統計，2021年我國西瓜種植面積為141萬hm2左右，產量約為6101萬t（WWW．fao．org）。上海市西瓜常年種植面積約為2000hm2，不僅是上海市郊區農業致富的重要產業，也是品牌農業、休閑農業、生態農業的重要載體。西瓜在生長過程中會受到多種病害的侵襲，常發的病害有蔓枯病、白粉病、炭疽病、葉斑病等，這些病害嚴重影響西瓜的產量和品質。

2022年7月，本研究組在上海市浦東新區調查時發現，多個農戶的種植大棚中出現一種癥狀相似的葉部病害，嚴重時整葉枯黃，影響植株光合作用和正常生長，田間株發病率50%以上。為明確引起該病害的病原菌，本研究對典型癥狀病樣進行組織分離、純化、培養，并結合病原菌形態、生物學特征、致病性、多基因聯合系統發育分析對分離物進行鑒定，以明確引起上海市西瓜葉斑病的病原菌種類，并開展了藥劑室內毒力測定，以期為該病害的防控提供參考。

1材料與方法

1.1材料

病樣：于上海市浦東新區公平村西瓜種植戶采集有典型病害癥狀的西瓜葉片。

瓊脂、葡萄糖、二甲基亞砜等生化試劑購自中國醫藥集團有限公司；2×Taq Master Mix （Lot：P112-01）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司、2k plus DNA Marker購自北京全式金生物技術有限公司。

10種供試殺菌劑原藥及來源：98%氟啶胺原藥（江西禾田科技有限公司）、95.4%己唑醇原藥（江蘇七洲綠色化工股份有限公司）、98%氟環唑原藥（江蘇七洲綠色化工股份有限公司）、97%戊唑醇原藥（江蘇七洲綠色化工股份有限公司）、97%咪鮮胺原藥（上海悅聯化工有限公司）、98%嘧菌酯原藥（山東京博農化科技股份有限公司）、98%氟吡菌酰胺原藥（拜耳股份公司）、95.2%苯醚甲環唑原藥（上海生農生化制品股份有限公司）、96.9%異菌脲原藥（江西禾益化工股份有限公司）、98%氟唑菌酰胺原藥（巴斯夫歐洲公司）。

1.2試驗方法

1.2.1癥狀觀察

2022年7月，在上海市浦東新區公平村西瓜種植戶，觀察西瓜葉斑病危害癥狀及程度等。

1.2.2病原菌的分離與純化

將有典型癥狀的發病初期葉片洗凈，在自來水下沖洗2h，按組織分離法分離病原菌。在病健交界處剪取直徑6～8mm的圓形病斑，用2%次氯酸鈉浸泡消毒2～3min，然后用滅菌水清洗3次，在無菌的培養皿內晾干，均勻放置在含有50ug/mL氯霉素和50ug/mL鏈霉素的PDA培養基上，26℃黑暗培養，挑取邊緣菌絲到新的PDA培養基上，待分離物產生孢子后，挑取單個孢子進行分離純化，分離物5℃保存。

1.2.3分離物的形態學及生物學特性

參考方中達的方法對分離物SHCCCO1進行形態學鑒定，在26℃下黑暗培養，觀察其在PDA培養基上的菌落特征以及菌絲和分生孢子的顯微形態。同時觀察光照對分離物色素產生的影響：先26℃全黑暗培養7d，然后全光照培養（光強度500lx，光源高度40cm）3d，觀察光照對紅色素產生的影響。

參考方中達的方法測試菌落生長適宜溫度：用打孔器在活化的菌落邊緣取直徑6mm的菌餅，接種在PDA培養基中央，設置培養溫度范圍18～34℃、溫度梯度2℃，黑暗培養7d后，用十字交叉法測量菌落直徑，試驗重復4次。

1.2.4致病性測定

將分離物SHCCC01接種于直徑90mm的PDA平板上（20mL培養基／皿）、26℃黑暗培養10d后，取2個平板的所有培養物連同培養基一起置于勻漿杯中，加100mL無菌水，高速組織搗碎儀10000r/min勻漿2min，菌懸液終濃度調至OD600 nm=1.5，用手持噴霧器均勻噴霧接種2～3葉期‘早佳一號’西瓜苗20株；噴施等量無菌水的‘早佳一號’西瓜苗20株為對照，在透光的塑料箱內保濕，在26℃L∥D=12h∥12h條件下生長。每日觀察記錄植株發病情況，接種7d后從發病植株的葉片發病部位重新分離病原菌，進行柯赫氏法則驗證。

1.2.5病原菌多基因聯合鑒定

將分離物SHCCCO1在PDA培養基上26℃培養7d后，挑取少量菌絲，參考Harju的方法提取真菌基因組DNA。對分離物分別選擇核糖體內部轉錄間隔區（internal transcribed spacers，ITS）引物ITSI（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3）/ITS4進行DNA片段擴增和測序，引物合成及測序委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。PCR擴增體系反應程序參考各引物出處文獻。

以暹羅假尾孢Pseudocercospora thailandica（CPC 10547）為外群參考序列，將分離物的序列與已經發表的ITS、His、TEFI-a、Act序列經Clustalx1.83做完全比對，并將兩端截齊，相關序列信息見表1。使用Sequence Matrix 1.80軟件按ITS-His-TEF-Act順序連接成多基因聯合序列?；卩徑臃ǎ╪eighbor-joining，NJ），設置自展值（boot-straps）為1000，用MEGA 7構建系統發育樹。

1.2.6室內藥劑毒力測定

采用菌絲生長抑制法，具體步驟參考劉欣等、曾蓉等的方法，測試10種殺菌劑原藥對分離物SHCCCOI的室內毒力。將供試菌株在PDA平皿上26℃黑暗培養7d后，在菌落邊緣打取直徑6mm的菌餅，菌絲面朝下接入含有藥劑的PDA平皿中央。所有藥劑用二甲基亞砜（DMSO）溶解成相應濃度后加入PDA平皿，設置不同濃度梯度。氟啶胺和己唑醇濃度設置為0.05、0.1、0.5、1.0、2.0ug/mL和5.0ug/mL;氟環唑和戊唑醇濃度設置為0.1、0.5、1．0、2.0、5.0ug/ml。和10.0ug/mL；咪鮮胺、嘧菌酯和氟吡菌酰胺濃度設置為0.5、1.0、5.0、10.0、20.0ug/mL和50.0ug/mL;苯醚甲環唑、異菌脲和氟唑菌酰胺濃度設置為10.0、50.0、100.0、200.0ug/mL和300.0ug/mL。以上藥劑均使用DMSO溶解，以添加100uL DMSO的PDA平皿為對照。每個處理重復4次，26℃黑暗培養7d后，用十字交叉法測量菌落直徑，用如下公式計算菌絲生長抑制率。

菌絲生長抑制率=（對照菌落直徑一處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-6mm）×100%。

試驗數據使用WPS Office 2023進行處理，線性回歸采用DPS 7.05進行分析，計算線性方程斜率（slope）、標準誤（SE）、卡方值（X2）、自由度（df）、抑制中濃度（ECso）、95%置信限。

2結果與分析

2.1田間癥狀

在夏秋季西瓜設施大棚內，病原物主要侵染西瓜葉片，表現為發病初期葉片上出現直徑1～2mm大小深褐色不規則或近圓形斑點，濕度高時發病部位擴大至10mm或更大斑，病斑褐色，中心部位灰白色，病斑周圍時有黃色，有典型的尾孢病害“蛙眼”狀圓斑，嚴重時整葉枯死，嚴重影響西瓜正常生長（圖1）。在調查中發現，上海市主栽西瓜品種‘早佳一號’大都易感病，株發病率高于50%。

2.2病原菌形態及生物學特性

組織分離后5d組織塊周圍長出灰褐色菌落，菌落邊緣菌絲白色，取菌落邊緣純化后，待分離物產生孢子后，挑取單個孢子進行分離純化。對5個病樣進行分離，共獲得20個分離物，命名為SHCCCO1～SHCCC20，這些分離物的菌落形態特征、生長速度基本一致，本研究選取了分離物SHCCCO1進行后續的試驗。

分離物SHCCC01菌絲在PDA培養基上生長較慢，緊貼培養基生長，在黑暗條件下，正面白色或灰色，背面灰褐色或暗褐色（圖2）；在光照培養條件下，菌落四周會產生鮮紅色或暗紅色色素（圖3）。西瓜葉斑病菌菌絲生長最適宜溫度是26℃，在該溫度下在PDA上培養7d菌落直徑為22.6mm，培養14d后菌落直徑為40.2mm;在18℃和34℃時，分離物生長速度緩慢，在PDA上培養7d菌落直徑分別為12.3mm和9.0mm，培養14d菌落直徑分別為22.8mm和9.9mm。

在自然發病的葉片發病部位能觀察到分生孢子梗和分生孢子的產生，其分生孢子梗多為簇生，基部棕褐色，頂端淺褐色，直立或彎曲，有多個屈膝狀折點，有多個隔膜（圖4a）；分生孢子無色，直或彎，短小的孢子呈倒棍棒狀，基部平截，頂端近尖至鈍，有3個以上隔膜，部分孢子有多達30余個隔膜，孢子大小為（2.5～5.2）um×（35. 3～240.3）um。黑暗條件下在PDA上培養14d，會有少量分生孢子產生，形態特征與葉片上相似（圖4b～e）。這些特征與郭蘭英等描述的侵染葫蘆科作物的瓜類尾孢較相似，與葉云峰等在甜瓜上發現的形態特征等也相似，初步判斷引起西瓜葉斑病的病原為尾孢菌。

2.3分離菌株對西瓜的致病性

20株2～3葉期‘早佳一號’西瓜接種SHCCCO1后7d，被接種葉片出現壞死斑，中間灰白色，后期病斑變大，整葉枯萎，與田間癥狀相似，而對照植株葉片上無癥狀（圖5）。從接種植株的發病部位重新進行組織分離，得到了與SHCCCO1分離物形態特征一致的分離物，進一步說明了SHCCCO1是引起西瓜葉斑病的病原菌。

2.4分子生物學鑒定

利用ITS、His、TEFI-a和Act4個基因序列的引物對西瓜葉斑病菌分離物SHCCCO1進行PCR擴增，分別得到長度為536、391、308、225 bp的DNA片段，上傳到NCBI的GenBank數據庫，獲得登錄號分別為：OR054068、OR088051、OR088052、OR088053.在GenBank數據庫中進行各序列BLASTn，結果顯示：菌株SHCCCOI的ITS序列與瓜類尾孢C．cit-ruZlina、辣椒尾孢C．capsici、煙草尾孢C．nicoti-anae、甜菜尾孢C．beticola、馬來尾孢C．maZayenszs、芹菜尾孢C．apii等諸多尾孢分離物的相似性都高達100%; His基因序列與數據庫中瓜類尾孢相似性都高于98．0%; TEF1-a基因序列與瓜類尾孢C．citrullina相似性都高于99.0%，與其他尾孢種的相似性在98. 0%左右；Act基因序列與瓜類尾孢C．citrullina相似性都高于99．0%，與其他尾孢種的相似性在97.0%～98．0%左右。

分離物SHCCCO1的ITS、His、TEF1-a和Act4個基因序列與尾孢相應序列的相似性最高。基于ITS、His、TEFI-a和Act 4個基因聯合序列，經NJ法構建了分離物SHCCCO1的多基因系統進化樹（圖6）。在該進化樹中，分離物SHCCCO1～SHC-CC03與瓜類尾孢C．citrullina的2個分離物聚集在一個分支，自展值為92。

2.5室內藥劑毒力測定

應用菌絲生長抑制法，測試10種藥劑對分離物SHCCC01的室內毒力作用。結果顯示（表2）：抑菌作用最好的是氟啶胺、己唑醇、氟環唑、戊唑醇等4種藥劑，EC50分別為0.3752、0.5754、1.4723、1.8902ug/mL，其次為嘧菌酯、咪鮮胺、氟吡菌酰胺3種藥劑，其EC50分別為11.7012、12.448 0、21.262ug/mL;試驗中，苯醚甲環唑、異菌脲和氟唑菌酰胺對分離物SHCCCOI的抑制活性較差，苯醚甲環唑EC50為178.1876ug/mL，而異菌脲和氟唑菌酰胺兩種藥劑在試驗中設置終濃度為300ug/mL時，仍未能測得有效的EC50。

3結論與討論

本研究對采自上海市浦東新區的‘早佳一號’西瓜葉片上致病菌進行了分離，共獲得了20株培養形態一致的分離物。經過柯赫氏法則驗證，選取了分離物SHCCCO1進一步進行了菌落形態、生物學特性、致病性測定。并通過分子生物學方法獲得了該分離物的ITS、His、TEFI-a、和Act的部分序列，通過多基因序列聯合建立NJ系統發育樹，綜合分析結果表明，引起上海浦東新區西瓜葉斑病的分離物SHCCCO1為瓜類尾孢C．citrullina。

引起西瓜葉部斑點癥狀的病害較多，有西瓜蔓枯病、細菌性葉斑病、西瓜炭疽病、尾孢葉斑病等，且這些病害僅通過癥狀難以確認病原。本研究中在葉片上觀察到的癥狀與陳益果等的描述十分相似，通過分生孢子梗、分生孢子形態、病原菌生物學特性和致病性等的鑒定，都和尾孢菌引起的植物病害特征相吻合。然而，尾孢屬近緣種之間的看家基因序列相似性高，僅憑單個基因序列信息很難準確鑒定到種。Inglis等、Conway、Mon-tenegro-Calderon等也證實，僅通過ITS序列分析無法區分大多數尾孢屬以下的分類。多基因聯合建樹的方法是尾孢菌較常用的進化分類方法，Groe-newald等應用ITS，TEFI-a，Act和Cal基因序列聯合建樹的方法將67株尾孢分離物分為甜菜尾孢C．beticola、芹菜尾孢C．apii和C．appiicola3組；曾蓉等也應用相同的方法成功地鑒定了引起上海市茼蒿葉斑病的病原；本文也采用了相同的方法成功將西瓜葉斑病病原鑒定到種，多基因序列聯合建樹方法鑒定病原菌已經成為植物病害的常用研究手段之一。

葉云峰等藥劑篩選結果發現，70%代森錳鋅可濕性粉劑等藥劑對甜瓜尾孢葉斑病有較好的抑制作用。本研究選取了10種殺菌劑原藥對分離物SHCCCO1進行毒力測定，結果顯示，殺菌劑原藥抑菌活性大小為：氟啶胺（二硝基苯胺類）gt;己唑醇、戊唑醇、氟環唑（三唑類）gt;咪鮮胺（咪唑類）gt;嘧菌酯（甲氧基丙烯酸類）gt;氟吡菌酰胺（吡唑酰胺類）gt;苯醚甲環唑（三唑類）gt;氟唑菌酰胺（羧酰胺類）、異菌脲（二甲酰亞胺類）。氟啶胺、己唑醇、戊唑醇、氟環唑對分離物SHCCC01的抑制活性較強，EC50值在0.3752～1.8902ug/mL之間。這些結果為后續西瓜葉斑病防治藥劑田間藥效評價及藥劑種類的選擇提供重要的技術支持。