基于RPA-CRISPR/CaS2a的番茄花葉病毒可視化檢測方法的建立

關鍵詞番茄花葉病毒；RPA;CRISPR/Cas12a;可視化檢測

番茄花葉病毒屬于植物桿狀病毒科Virgaviridae煙草花葉病毒屬Tobarnovirus，基因組分別編碼外殼蛋白、運動蛋白、與復制相關的126kD蛋白和183kD蛋白。ToMV在全世界均有分布，主要危害番茄和辣椒，易侵染多數茄科植物，嚴重影響果實的品質和產量。ToMV可以通過嫁接、植株間互相接觸、機械接種傳播，也可以通過種子傳毒。被ToMV侵染的葉片出現花葉癥狀，有時還會導致葉片變形，植株矮縮，甚至死亡；果實會出現著色不均或凹陷的褐色病斑。

目前檢測TolVIV的方法主要有雙抗體夾心酶聯免疫吸附測定（double antibody sandwich assay，DAS-ELISA）、斑點酶聯免疫吸附測定、膠體金免疫層析測定、RT-PCR、實時定量RT-PCR等。但是這些方法在實現快速和現場檢測TolVIV方面存在一些局限性。目前使用的大多數檢測方法很耗時，而且需要昂貴的設備和專業技術知識，限制了在實驗室之外的診斷應用。因此，有必要建立一種快速、靈敏、可視化的ToMV現場檢測方法。

重組酶聚合酶擴增技術（recombinase polymer-ase amplification，RPA）是一種在恒定溫度（37～42℃）啟動DNA指數級擴增的檢測技術。由于該技術反應速度快、靈敏、不需要昂貴的儀器，已被廣泛應用于多種植物病原物的檢測。CRISPR/Cas系統由簇狀規則間隔短鏈重復序列（clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats， CRISPR）及相關蛋白12a（CRISPR-associated12a，Cas12a）組成，存在于許多細菌和古細菌的先天免疫系統中。在該系統中，Cas蛋白與入侵病毒DNA序列互補的CRISPR RNA（crRNA）形成一個核糖核蛋白（ribo-nucleoprotein，RNP）復合物，來靶向特定的病毒序列。雖然該系統主要用于基因編輯，但最近有研究表明，一些Cas蛋白可用于檢測特定的核酸序列，例如，Cas12a在與其DNA底物特異性相互作用后獲得了非特異性的單鏈DNase活性。前人利用這一特性應用Cas12a作為生物傳感器：除了Cas12a及其crRNA的RNP復合物外，還添加了一個熒光報告基因（FQ）標記的單鏈DNA底物。在Cas12a激活后，它非特異性地降解單鏈DNA，釋放熒光基團，產生熒光信號。該方法已被用于檢測人乳頭瘤病毒（human papillomavlrus，HPV）和新型冠狀病毒（corona virus disease 2019，COVID-19），表明該方法在病毒診斷方面具有巨大潛力。近年來，CRISPR/Cas12a被應用于植物RNA病毒和DNA病毒的檢測，證明其在植物病毒病的檢測中具有很大的應用潛力。

1材料與方法

1.1材料

本研究中所用的帶病毒材料包括：ToMV、南芥菜花葉病毒（arabis mosalc vlrus，ArMV）、黃瓜花葉病毒（cucumber mosalc vlrus，CMV）、辣椒輕斑駁病毒（pepper mild mottle virus，PMMoV）、番茄褐色皺紋果病毒（tomato brown rugose fruit virus，To-BRFV）、番茄斑駁花葉病毒（tomato mottle mosalcvirus，ToMMV）、番茄環斑病毒（tomato ringspotvirus，ToRSV）、煙草環斑病毒（tobacco ring spot vi-rus，TRSV）、煙草花葉病毒（tobacco mosalc virus，TMV）、番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus，TSWV）侵染的辣椒或番茄的葉片或種子樣品均由中國檢驗檢疫科學研究院保存。

1.2方法

1.2.1總RNA提取

稱取1000粒健康或帶病毒的番茄或辣椒種子在干磨機中打碎至粉末狀，按質量體積比1：2比例加入1XPBS緩沖液充分混合放置45min，取1mL上清液備用；取健康或帶病毒的番茄或辣椒葉片在液氮中充分研磨，稱取0.1g備用；按照植物總RNA提取試劑盒（DP432，天根生化科技有限公司）說明書提取RNA，于-80℃保存備用。

1.2.2RPA引物、crRNA及熒光報告基因FQ設計

根據NCBI中ToMV外殼蛋白對應基因序列，進行序列比對分析并設計引物，使用NCBI中Prim-er-BLAST （https：∥www. ncbi. nlm. nih. gov/tools/primer-blast/）對設計的引物進行特異性驗證；使用在線設計網站CRISPR進行crRNA設計（表1），crRNA、熒光報告基因FQ序列和引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2.3RPA檢測方法

本研究按照RPA恒溫擴增試劑盒（WI。RB-8207KIT，安普未來生物科技有限公司）進行RPA反應，擴增體系為50uL，每個反應管中加入待測樣品RNA模板，混合均勻后在42℃反應15min。反應結束后純化擴增產物：加入等體積的Tris飽和酚／氯仿／異戊醇（25：24：1）抽提液，混勻，12000r/min離心5min。取上清進行顯色反應。

1.2.4CRISPR/Cas12a等溫快速可視化檢測方法

本研究采用的CRISPR/Cas12a反應擴增體系為、熒光報告基因FQ（10umol/Lgt;0.8uL、將上述溶液加到反應管中充分混合后，加入2uL純化好的RPA反應產物，再次充分混勻，離心，37℃反應15min。反應結束后在藍光（440～460nm）下觀察，當溶液發出綠色熒光時，判定待測樣品為ToMV陽性。

1.2.5CRISPR/Cas12a等溫快速可視化檢測體系優化

對熒光報告基因FQ終濃度進行優化時，將其終濃度依次設置為100、200、300、400、600、800 nmol/L，其他試驗條件保持不變；對Cas12a/crRNA濃度比例進行優化時，將其濃度比例分別設置為2：1、1：1、1：2、1：5、1：10，其他試驗條件保持不變；在優化好熒光報告基因FQ終濃度和Cas12a/crRNA濃度比例的基礎上，確定最終濃度，將Cas12a/crRNA最終濃度分別設置。

1.2.6特異性分析

提取辣椒和番茄上常見的ArMV、CMV、PM-MoV、ToBRFV、ToMMV、ToRSV、TRSV、TMV、TSWV樣品總RNA作為模板，使用建立的基于RPA-CRISPR/Cas的等溫快速可視化檢測體系對其進行擴增，以驗證該檢測體系是否與其他病毒有交叉反應。

1.2.7靈敏度分析

參照《番茄花葉病毒檢疫鑒定方法》（GB/T36771-2018）[33設計RT-PCR引物，引物序列為：RT-ToMV-F（5'-CGAGAGGGGCAAcjAAACAT-3'），RT-ToMV-R（5'-ACCTGTCTCCATC'FCTTTGG-3'）；擴增片段長度為318 bp。參照全式金TransScriptII One-Step RT-PCR SuperMix試劑盒配制2040s，35個循環；72℃10min。

1.2.8樣品檢測

收集10份辣椒和番茄的葉片或種子樣品提取總RNA（表2），使用建立的RPA-CRISPR/Cas12a體系進行ToMV的檢測，并與RT-PCR檢測方法比較，分析檢測準確率。

2結果與分析

2.1可視化反應體系優化

為建立最適的RPA-CRISPR/Cas12 a反應體系，進行熒光報告基因FQ終濃度優化，試驗結果如圖1a所示，當熒光報告基因FQ終濃度達到400 nmol/L時，離心管中綠色熒光強度達到最亮，繼續增加濃度時亮度不再增加，因此選擇400 nmol/L為熒光報告基因FQ終濃度。

2.2檢測體系的特異性分析

為了評估RPA-CRISPR/Cas12檢測體系的特異性，根據優化好的RPA-CRISPR/Cas12 a反應體系對分別攜帶ArMV、CMV、PMMoV、ToBRFV、ToM[MV、ToRSV、TRSV、TMV、TSWV的樣品進行檢測，以ddH2O為陰性對照（NC）。結果顯示，攜帶ToMV病毒的樣品檢測為陽性，帶有其他9種病毒的樣品檢測結果均為陰性（圖2）。

2.3檢測體系的靈敏度測定

以攜帶ToMV的番茄樣品總RNA為模板，RPA-CRISPR/Cas12a反應能檢測到的極限為172ag/uL（圖3a），RPA反應的檢測靈敏度為1. 72fg/uL（圖3b），而普通RT-PCR的檢測靈敏度為1. 72pg/uL（圖3c），在此條件下，建立的RPA-CRISPR/Cas12a檢測的靈敏度顯著高于普通RT-PCR，是普通RT-PCR的10000倍。

2.4辣椒和番茄樣品的檢測

使用建立的RPA-CRISPR/Cas12a體系進行ToMV的檢測，以ddH70為陰性對照（NC），攜帶ToMV的番茄樣品總RNA為陽性對照（P）。結果顯示，總共在3份樣品中檢出ToMV（圖4a），RT-PCR檢測結果與RPA-CRISPR/Cas12a檢測結果一致（圖4b）。

3結論與討論

ToMV主要危害番茄、辣椒及多數茄科植物，在世界各地廣泛分布。快速、準確地檢測該病毒有助于預防其進一步傳播，然而，現有的ToMV診斷方法只能在實驗室中進行。本研究開發了一種快速、特異、靈敏的RPA-CRISPR/Cas12a技術的ToMV可視化檢測方法。在RPA-CRISPR/Cas12a檢測體系中加入熒光報告基因FQ（FAM-CCG-GAAAAAAAAAAAACCGG-BHQI），如果發現目標序列，熒光報告基因被切割出FAM基團，可在藍光（440～460nm）下直接觀察到綠色熒光信號，增加了該方法的便攜性。因此，該方法具有在現場檢測中使用的潛力。

本研究構建的RPA-CRISPR/Cas12a體系的靈敏度是RPA反應的10倍，是RT-PCR的10000倍，顯著高于傳統的RT-PCR，RPA與CRISPR/Cas12a系統相結合，能夠獲得比RPA反應靈敏度更高的檢測技術，對環境要求低，操作簡單，不需要PCR儀和瓊脂糖凝膠電泳，可以實現在田間、口岸等現場快速檢測的需求。但是通常檢測靈敏度越高的技術，在實際應用中發生污染的可能性越大，因此可以優先選用帶有濾芯的滅菌移液器槍頭和單獨開蓋的離心管進行試驗。后續可以考慮在同一個離心管中進行RPA反應和CRISPR/Cas12a可視化反應，減少中途開蓋操作，降低污染的可能。

本研究建立的RPA-CRISPR/Cas12a檢測方法只需反應30min，利用便攜式恒溫金屬浴和充電式藍光燈，即可快速檢測ToMV，可用于田間和口岸檢疫等，為我國番茄花葉病毒的預測預報和田間診斷等提供了更為便捷的技術手段，具有廣泛的應用前景，對我國番茄花葉病毒的防控具有重要意義。