葡萄VvERF655基因響應可可毛色二孢的表達模式及VvERF655與VvWRKY75的互作

關鍵詞葡萄；葡萄潰瘍病；可可毛色二孢；酵母雙雜交；表達模式

葡萄是世界范圍內廣泛栽植的古老果樹之一，其品種多、用途廣，既可以鮮食，也被廣泛用于釀酒、制干等商品加工，已經成為我國果樹產業的重要組成部分之一。葡萄枝干病害（grapevine trunk diseases）是一類由多種病原真菌復合侵染引起的病害的總稱，可危害葡萄果實、葉片、嫩梢等，造成不同程度的維管束變色、腐爛，葉片壞死等癥狀，嚴重時引起整個植株樹勢減弱甚至死亡。座腔菌科Botryosphaeriaceae真菌引起的葡萄潰瘍病在我國多個省份普遍發生。Li等在2010年首次報道了葡萄潰瘍病在我國的發生，該病害造成葡萄枝干及果實褐變，樹干潰瘍，果實干縮掉粒，樹勢減弱等現象。在已報道的研究中，葡萄座腔菌、可可毛色二孢、色二孢、小新殼梭孢和7種病原菌可引起我國葡萄潰瘍病，其中優勢種是B．dothidea和L. theobromae，致病力最強的為L．theobr07tnae。

轉錄因子（transcription factor．TF），又稱反式作用因子，是一種能與基因啟動子上的特定序列專一性結合，在轉錄水平上調控靶標基因表達，調節植物生長發育和逆境脅迫過程的蛋白質分子。目前，植物中已發現多種轉錄因子，其中WRKY、AP2/ERF、MYB、NAC等是研究較多的轉錄因子。AP2/ERF是植物中數量最多的轉錄因子家族之一。目前已在擬南芥、水稻、玉米、小麥、大豆等多種植物中分離鑒定到大量AP2/ERF轉錄因子，參與植物的生長發育以及非生物與生物脅迫反應。根據其所包含的AP2結構域數量，通常將AP2/ERF轉錄因子家族成員分為AP2、ERF、RAV以及Soloist 4個家族。其中ERF家族進一步分為DREB亞家族（I一Ⅳ組）和ERF亞家族（V-X、Ⅵ-L和X b-L組）。研究發現，ERF家族成員主要參與激素信號轉導、脅迫響應、代謝調控以及生長發育等過程。在擬南芥中，Dubois等發現轉錄因子AtERF6和AtERF11可以通過拮抗作用來調節由甘露醇導致的擬南芥生長抑制現象。Yu等發現，在黃花蒿中，轉錄因子AaERF1和AaERF2響應茉莉酸并且正調控青蒿素合成過程。Zhu等研究發現，中國野生葡萄中3個ERF轉錄因子參與不同的生物與非生物脅迫途徑，其中VqERF1在干旱和高溫脅迫下會顯著表達，過表達VqERF2和VqERF3可以提高葡萄對青枯雷爾氏菌和疫霉的抗性。

課題組前期研究表明，VvoWRKY75可以負調控葡萄潰瘍病的發生，通過權重基因共表達網絡分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）發現VvERF655與VvWRKY75共表達。本文主要探究VvERF655是否參與葡萄對葡萄潰瘍病的調控過程，分析VzERF655的表達模式，明確其是否與VvWRKY75存在互作關系，為進一步解析VvERF655在葡萄中的生物學功能及葡萄枝干病害防控提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

葡萄‘夏黑’種植于北京市農林科學院植物保護研究所溫室；‘無核白’葡萄組培苗由本實驗室培養和保存。可可毛色二孢菌株CSS-01s由實驗室分離并保存。酵母菌株Y2HGo1d由實驗室保存。用于酵母雙雜交的AD載體pGADT7和BD載體pGBKT7，以及pGBKT7-53、pGBKT7-Lam和pGADT7-T均由實驗室保存。

20%葡萄糖：經0.22um濾膜過濾除菌，4℃冰箱保存。0.2%腺嘌呤硫酸鹽（0.2%Ade）：121℃高壓滅菌15min，4℃冰箱保存。YPDA培養基：蛋白胨20g，酵母提取物10g，瓊脂20g，定容至880mL，pH6.5，121℃高壓滅菌15min，再加入過濾除菌的20%葡萄糖100mL，0.2% Ade 20mL。SD培養基：無氨基氮源6.7g，瓊脂20g，定容至800mL，pH調至5.8。10×-Leu/-Trp母液：1.28gDOsupplement-Leu/-Trp粉末溶于200mL滅菌水。10×-Ade/-His/-Leu/-Trp母液：1.2gDOsupplement-Ade/-His/-Leu/-Trp粉末溶于200mL滅菌水。向SD培養基中加入100mL20%葡萄糖和100mL相應的缺陷型母液即配成SD/-Leu/-Trp二缺培養基和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp四缺培養基。PDA培養基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，定容至1L。上述培養基和試劑均121℃高壓滅菌20min，常溫保存。植物總RNA提取試劑盒購于北京艾德萊生物科技有限公司。SuperScriptⅢ反轉錄試劑盒購于Invitrogen公司。酵母轉化試劑盒購于TaKaRa公司。

1.2試驗方法

1.2.1目的基因克隆

根據VvERF655和VvWRKY75基因的CDS序列設計特異性引物（表1），在引物上添加EcoR和Xho酶切序列，引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。取‘無核白’葡萄幼嫩葉片，按照RNA提取試劑盒說明書提取葉片總RNA，利用SuperScriptⅢ反轉錄試劑盒將其反轉錄成cDNA。以‘無核白’cDNA為模板，利用表1中引物克隆VvERF655和VvWRKY75全長CDS片段。反應體系為反應程序為：94℃預變性5min; 94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，32個循環；72℃延伸10min。PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小正確后回收目的片段。

1.2.2生物信息學分析

利用ExPASY數據庫中的ProtParam在線工具（https：∥web. expasy. org/protparam/）對VvER655進行蛋白理化性質分析；利用PlantCARE網站（http：∥bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/ht-ml/）對VvERF655啟動子上游2000bp的序列進行順式作用元件分析；通過在線網站Prabi（https：∥npsa-prabi. ibcp. fr/cgi-bin/npsa_automat. pl？ page＝npsa_sopma．htmL）對VvERF655的二級結構進行預測；利用ProtComp v．9．0在線網站（http：∥linuxl.softberry. com/berry. phtm1？ topic=protcompp1amp;group=programsamp;subgroup=proloc）進行亞細胞定位預測。

保守結構域分析：將VvERF655的蛋白序列在NCBI網站進行BLASTp比對，獲得擬南芥Arabi-、擬絨毛煙草、銀白楊、棉花、茶樹的同源蛋白序列，利用DNAMAN對6個物種的蛋白序列進行多重序列比對，并利用SMART網站對6個物種的蛋白進行結構域預測。

系統進化樹構建：為了揭示葡萄VvERF655在ERF家族中的分類地位，本研究選用已報道的擬南芥和葡萄ERF家族各小組成員與VvERF655一起進行蛋白序列比對，并利用MEGA7.0軟件按照鄰接法（neighbor-j oining，NJ），bootstrap設定為1000，構建系統進化樹。

1.2.3VvERF655的相對表達量分析

1.2.3.1接種可可毛色二孢后VvERF655的相對表達量

為探究VvERF655基因是否響應可可毛色二孢侵染，參照張瑋等的接種方法對葡萄枝條進行接種：將可可毛色二孢菌株CSS-01s在PDA培養基上28℃條件下培養2d，葡萄枝條為采集于北京市農林科學院溫室培養的‘夏黑’葡萄半木質化枝條，經75%乙醇擦拭枝條進行表面消毒后，用直徑4mm滅菌打孔器于莖節中間打孔，接種CSS-01s菌餅并固定，以接種無菌PDA為對照。接種后置于26℃，相對濕度80%的溫室，分別于接種后0、12、24、36h和48h，在以傷口為中心4cm范圍內取韌皮組織，液氮速凍后于-80℃保存。

將-80℃保存的樣品按照RNA提取試劑盒說明書提取RNA，并利用SuperScriptⅢ反轉錄試劑盒將其反轉錄成cDNA。采用設計的熒光定量特異性引物655-qF/655-qR（表1）擴增VvERF655基因，以VvEF1-y基因為內參基因。反應程序為：95℃ 30s；95℃5s．60℃34s，共40個循環；60～95℃記錄熔解曲線。每個樣品3個技術重復，用2法計算VvERF655基因的相對表達量，以接種PDA的枝條為空白對照組處理，用于排除試驗操作的影響。在時間序列分析中，以oh的表達量為對照計算各時間點的相對表達量。利用SPSS中單因素方差分析（One-way ANOVA）進行差異顯著性分析（a=0.05），并利用GraphPad Prism 8作圖。

1.2.3.2激素處理后VvERF655基因的相對表達量

參照Wang等的方法，選擇在26℃L∥D=16h∥8h的培養箱培養2個月左右的‘無核白’組培葡萄苗，用1.5mL濃度為100umol/L的茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MejA）、脫落酸（abscisicacid，ABA）、水楊酸（salicylic acid， SA）和氨基環丙烷羧酸（aminocyclopropane-l-carboxylic acid，ACC）分別噴施葡萄葉片，以噴施等體積滅菌水的葡萄葉片為對照組，在處理后0、1、3、6、12、24 h采集葡萄葉片，液氮速凍后于-80℃保存。熒光定量PCR擴增及相對表達量計算同1.2.3.1。

1.2.4VvWRKY75與VvERF655在酵母中的互作

1.2.4.1酵母雙雜載體構建與鑒定

用E-coR工和Xho IXt pGADT7（AD載體）進行雙酶切，膠回收后與VvERF655擴增產物進行In-Fusion連接反應。用EcoRI和Sal I對pGBKT7（BD載體）雙酶切，將其與VvWRKY75片段進行In-Fusion連接。連接產物轉化大腸桿菌Trans5a感受態細胞后分別在含有Amp和Kana的LB平板上生長。挑取陽性克隆，提取質粒。酶切檢驗重組質粒后，將條帶大小與預期符合的陽性克隆菌液送北京擎科生物科技股份有限公司測序。使用DNAMAN9.0軟件比對測序結果，序列正確的誘餌載體命名為BD-VvWRKY75，獵物載體命名為AD-VvERF655，菌液于-20℃保存備用。

1.2.4.2載體的毒性和自激活檢測

挑取酵母菌株Y2HGold劃線于YPDA固體培養基，30℃培養箱內倒置培養3d，參照酵母轉化試劑盒（TaKaRa）說明書制備感受態細胞。利用PEG/LiAc法將獵物載體AD-VvERF655與BD載體pGBKT7配對共轉化酵母Y2HGold感受態細胞，將誘餌載體BD-VvWRKY75與AD載體pGADT7配對共轉化酵母Y2HGold。將轉化產物涂布在SD/-Leu/-Trp和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp固體培養基上，30℃培養2～4d，進行自激活與毒性檢測。以pGBKT7-53和pGADT7-T組合配對為陽性對照，pGBKT7-Lam和pGADT7-T組合配對為陰性對照。

1.2.4.3酵母雙雜交系統互作驗證

使用PEG/LiAc法將獵物載體AD-VvERF655與誘餌載體BD-VvVVRKY75共轉化酵母Y2HGold感受態細胞中，轉化產物涂布于SD/-Leu/-Trp平板，30℃培養2d。挑取單克隆于SD/-Leu/-Trp液體培養基中培養至OD60為0.5，稀釋10、100倍后分別點在SD/-Leu/-Trp和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板上，30℃培養3～5d，觀察菌落生長狀況。陽性對照（pGBKT7-53和pGADT7-T配對）在SD/-Leu/-Trp和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板上均能生長，表明存在相互作用；陰性對照（pGBKT7-Lam和pGADT7-T配對）可在SD/-Leu/-Trp平板上生長，但在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板上無法生長，表明不存在相互作用。

2結果與分析

2.1VvERF655基因克隆與分析

以‘無核白’葡萄cDNA為模板，通過PCR擴增獲得VvERF655基因片段。測序結果顯示，目的基因VvERF655的開放閱讀框（ORF） 738bp，編碼246個氨基酸。蛋白理化性質分析表明，其分子量為62.7kD，等電點5.08，不穩定指數67.89，脂肪系數29.00，平均疏水指數0.986。通過Prabi在線網站預測VvERF655的二級結構發現，其以無規則卷曲（60.98%）和a螺旋（26.83%）為主，延伸鏈和折疊各占7.32%和4.88%。亞細胞定位預測其位于細胞核。通過PlantCARE網站對VvERF655啟動子的順式作用元件進行分析發現，該基因啟動子上存在脫落酸響應元件（ABRE）、水楊酸響應元件（TCA-element）等。

2.2保守結構域和系統進化樹分析

利用SMART網站預測VvERF655的結構域，發現其含有1個典型的AP2結構域。對VvERF655蛋白及其同源序列進行多序列比對，發現它們共同含有一個長度為64個氨基酸的保守AP2結構域（圖1）。

對擬南芥和葡萄ERF家族各小組的蛋白序列采用鄰接法構建系統發育樹，結果顯示，VvERF655與AtERF114（NCBI reference sequence： NP_200995.1）和VvERF099 （GenBank登錄號：CBI18230.3）聚在一支，該分支為ERF亞家族X組（圖2）。

2.3接種可可毛色二孢后VvERF655的相對表達量分析

通過RT-qPCR檢測接種可可毛色二孢的‘夏黑’葡萄枝條中VvERF655相對表達水平變化，Oh為對照，結果表明，在接種后48h內該基因的相對表達量逐漸增加，24h時其相對表達水平相較0h時有顯著差異，48h時可達對照的3.5倍（圖3）。

2.4激素處理后VvERF655的相對表達量分析

對噴施不同激素的‘無核白’葡萄葉片中VvERF655相對表達量進行檢測發現，ABA處理后0～24h，該基因的相對表達水平逐漸上升，處理后6h即有顯著誘導表達，處理后24 h其相對表達量達到0h的8倍左右（圖4a）。MeJA處理后0～3hVvERF655相對表達水平下降，處理后6h相對表達量上調，隨后逐漸減少至0h水平（圖4b）。ACC處理后1h時VvERF655的相對表達量顯著上升，隨后逐漸下降至0h水平（圖4c）。SA處理后0～3h VvERF655相對表達量顯著上升，處理后24h達到0h的23倍左右（圖4d）。

2.5酵母雙雜交分析

與對照組相比，經自激活檢驗可以觀察到AD-VvERF655與BD載體pGBKT7配對可以在SD/-Leu/-Trp平板上生長，但在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板上無法生長，表明VvERF655無自激活效應。將BD-VvWRKY75與AD-VvERF655共轉酵母菌株進行酵母雙雜交互作鑒定，結果顯示其在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板上能正常生長，表明VvERF655與VvWRKY75在酵母中可發生互作（圖5）。

3結論與討論

植物在其整個生命周期內不可避免地會遇到各種各樣的生物與非生物脅迫，在長期進化過程中形成了復雜的調控網絡。轉錄因子通過結合特定靶基因啟動子中的順式作用元件來啟動反應，可以與調節基因表達的轉錄復合物中的不同蛋白質相互作用，其中一些轉錄因子是生物響應脅迫過程中信號傳遞和調節途徑的主要調節因子。在植物中，約10%的基因編碼轉錄因子，它們在不同階段具有不同功能。因此，破譯轉錄因子的作用對于未來的研究至關重要。本研究從負調控葡萄潰瘍病的VvWRKY75人手，研究了與其共表達的轉錄因子VvERF655，通過對其結構域進行分析發現，VvERF655含有1個典型的AP2結構域，屬于AP2/ERF轉錄因子超家族。通過構建系統進化樹，發現VvERF655屬于ERF亞家族X組。

近年來，AP2/ERF轉錄因子得到廣泛研究，該類轉錄因子可以參與調控植物生長發育，調控植物代謝產物合成，以及響應生物與非生物脅迫等過程。栗麗等通過對歐洲葡萄基因組中的124個AP2/ERF類轉錄因子在葡萄組織中的表達模式分析發現，該類轉錄因子在根、葉、花莖、花及果實中表達較強，在其他的組織或器官中表達較弱。Zhu等通過全基因組鑒定與表達分析發現ERF家族基因在葡萄響應灰葡萄孢侵染以及胚珠發育方面具有潛在作用。王嵐等篩選到3個響應白粉菌誘導的轉錄因子VqERF112、VqERF1l4和VqERF072，在擬南芥中過表達后可以增強對丁香假單胞菌的抗性。

本實驗室前期利用共表達網絡分析發現Vv積F655與共同表達。本研究通過對接種的‘夏黑’葡萄枝條中的轉錄水平進行測定，發現可以誘導VvERF655基因的上調表達，表明該基因很可能參與寄主對可可毛色二孢的侵染調控過程。通過對噴施ABA、SA、MeJA、ACC等激素的‘無核白’葡萄葉片中VvERF655的轉錄水平進行測定，發現在0～24h內，ABA和SA可以顯著誘導VvERF655基因的上調表達，但VvERF655的相對表達水平基本不受MeJA和ACC的調控，該結果表明，VvERF655很可能參與ABA和SA激素調節網絡。此外，酵母雙雜交技術已經廣泛用于蛋白互作研究。Zhu等通過酵母雙雜交試驗發現轉錄因子VaERF16與VaMYB306在酵母中存在相互作用，并且可以增強葡萄對灰葡萄孢的抗性。Wang等利用酵母雙雜交試驗發現VqWRKY53與中國野生葡萄VqMYB14和VqMYB15在酵母中互作，提高二苯乙烯合成并增強對Pseudomonas syrzngae pv. tornato DC3000的抗性。本研究通過酵母雙雜交試驗發現VvERF655與VvWRKY75在酵母中可以發生相互作用，說明VvERF655與VvWRKY75可能存在直接相互作用。以上結果表明，VvERF655很可能參與植物對病原菌的調控過程，但其具體作用機制尚不明確，后續將對VvERF655的生物學功能展開進一步研究。