異養硝化-好氧反硝化細菌的研究進展及在水產養殖中的應用

摘" 要：異養硝化-好氧反硝化細菌可以同時實現硝化和反硝化，具有高效的脫氮性能，是目前廢水生物脫氮處理的研究熱點之一。文章從異養硝化-好氧反硝化細菌的研究現狀、作用機制、脫氮影響因素、在水產養殖中的應用等4個方面進行了綜述，可為異養硝化-好氧反硝化細菌的研究提供理論依據，為異養硝化-好氧反硝化細菌在水產養殖中的應用提供新的思路。

關鍵詞：異養硝化-好氧反硝化細菌；脫氮；作用機制；水產養殖；廢水處理

doi：10.16446/j.fsti.20230600129

收稿日期：2023-06-29

作者簡介：么寶蘭（1997—），女，碩士研究生，專業方向為預防獸醫學。E-mail：1320555850@qq.com

通信作者：李月紅（1968—），女，教授，研究方向為水產動物病害防治。E-mail：liyhong@sina.com

項目資助：吉林省中青年科技創新創業卓越人才項目（20240601068RC）；吉林省科技發展計劃重點研發項目（20230202076NC）；吉林" 省現代農業產業技術示范推廣項目（JARS-2024-1401）；國家重點研發計劃項目（2023YFD2401003）。

氮化合物的積累可導致水體溶解氧減少、富營養化和藻類繁殖，從而導致水質惡化，對水產養殖動物具有致命的影響［1］。因此，去除養殖尾水中的氮對于維護水體環境至關重要。傳統的生物脫氮包括在好氧條件下的自養硝化過程和厭氧條件下的異養反硝化過程2個部分，分別由自養硝化菌和異養反硝化菌兩種菌完成，前者在有氧條件下能將氨轉化為亞硝酸鹽或硝酸鹽，后者在厭氧條件下將硝酸鹽和亞硝酸鹽還原為氮氣。因所需條件不同，這2個部分通常需要在不同的設施下進行，導致成本高、耗時長、耗能等一系列問題。異養硝化-好氧反硝化細菌的出現很好地解決了這些問題［2-4］。異養硝化-好氧反硝化細菌能夠同時進行硝化和反硝化，具有生長速度快、環境適應性強、脫氮能力強等優點，克服了傳統生物脫氮存在的很多弊端。這類新型的脫氮微生物主要存在于副球菌屬（Paracoccus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、不動桿菌屬（Acinetobacter）等［5］。有研究表明，異養硝化-好氧反硝化細菌可能通過同化、異化、硝化、反硝化等不同生物轉化途徑分解氮源［6］。隨著異養硝化-好氧反硝化細菌在不同環境中發現得越來越多，近年來引起了人們的廣泛關注，已成為生物脫氮領域的一個研究熱點。本文從異養硝化-好氧反硝化細菌的研究現狀、作用機制、脫氮影響因素、在水產養殖中的應用等4個方面進行了綜述，以期深入了解異養硝化-好氧反硝化細菌脫氮過程中的代謝途徑，為異養硝化-好氧反硝化細菌的研究提供理論依據，為異養硝化-好氧反硝化細菌在水產養殖中的應用提供新的思路。

1" 異養硝化-好氧反硝化細菌的研究現狀

異養硝化-好氧反硝化細菌已經從各種環境中分離出來，例如廢水處理系統、水產養殖廢水和垃圾填埋場滲濾液等。現階段研究發現，僅僅去除廢水中的氮是遠遠不夠的，既能除氮又能去除其他物質的細菌更受歡迎。Rout等［7］分離鑒定了1株具有異養硝化、好氧反硝化和反硝化除磷功能的蠟樣芽孢桿菌GS-5，GS-5對生活廢水中的銨態氮（NH4+-N）、硝酸鹽氮（NO3--N）、亞硝酸鹽氮（NO2--N）和磷酸鹽（PO43--P）的最大去除率分別為96%、95%、84%和81%。Zhou等［8］分離鑒定出1株假單胞菌SCZ-2，該菌可以快速去除水中的氮和磷，對NH4+-N、NO3--N、NO2--N和PO43--P的去除速率分別為14.38、17.77、20.13和2.93 mg/（L·h）。目前，對于具有除磷能力的菌株以及除磷過程的研究報道較少，具體作用機制尚需進一步深入和廣泛的研究。除了具有除磷的能力以外，有些異養硝化-好氧反硝化細菌還具有去除水中鈣（Ca2+）和重金屬的能力。Yang等［9］分離鑒定出1株假單胞菌sp.Y1，該菌對NH4+-N、PO43--P、Ca2+有同步去除的能力，去除率分別為92.04%、99.98%和83.40%。Zheng等［10］從養殖廢水中分離得到反硝化副球菌AC-3，該菌對不同的重金屬具有良好的耐受性，可同時去除99.70%的NH4+-N、99.89%的鋅（Zn

2+）、97.42%的鎘（Cd2+）和46.19%的鎳（Ni2+）。Hu等［11］分離到一株假單胞菌sp. HXF1，能夠同時去除氨氮和氟化物，去除99.2%的NH4+-N而不積累NO2--N和NO3--N，同時去除87.3%的氟（F-）。異養硝化-好氧反硝化細菌具有同時去除氮、磷、鈣及重金屬的能力，能更高效地處理廢水，這對其推廣應用具有重要意義。部分具有除磷能力的異養硝化-好氧反硝化細菌見表1。

為了進一步提高異養硝化-好氧反硝化細菌的脫氮性能，許多研究學者開始對其進行基因改良、轉座子誘變、紫外誘變等，為提高廢水處理中異養硝化-好氧反硝化細菌的脫氮能力提供了新的策略。Wang等［15］利用紫外-硫酸二乙酯復合誘變獲得了1株高效異養硝化好氧反硝化突變株ΔRhodococcus sp. CPZ 24，其最大硝化和反硝化速率分別為3.77和1.37 mg/（L·h），分別比野生細菌高30.30%和17.10%。Deng等［16］分離得到了1株反硝化細菌，即假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）SC221，經鈷-60輻照和篩選后，SC221對亞硝酸鹽的去除能力由50 mg/L提高到100 mg/L。將其與蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）BSC24制成混合制劑，顯著降低了草魚養殖水中的銨、亞硝酸鹽、總氮的含量，而且混合制劑比單獨使用效果更好，添加微生物制劑后，水中的微生物群落結構發生了顯著變化。這說明添加微生物制劑可以改善水質和水中微生物群落組成。有研究表明，異養硝化-好氧反硝化細菌會產生細胞外聚合物（EPS），細菌EPS的產生與其聚集能力及細胞結合能力密切相關［17］。在廢水中，微生物在好氧或厭氧條件下消耗有機分子并產生EPS，EPS會填充微生物細胞之間的空間［18］。EPS由多種有機物組成，包括多糖、蛋白質、核酸、脂質和腐植酸等［19］。這些生物聚合物的數量和特性能強烈影響絮凝體的結構和微生物的性質。Padhi等［20］研究發現，肺炎克雷伯菌CF-S9表現出自聚集并能產生EPS。關于異養硝化-好氧反硝化細菌聚集能力的研究很少。該菌株的聚集和細胞結合能力表明，該菌株具有高效的生物質富集和廢水處理的實際應用價值。有研究表明，群體感應（QS）會對異養硝化-好氧反硝化細菌的生長和反硝化產生影響。群體感應即細菌自發產生和釋放一些特定的信號分子來調節微生物的群體行為。Wang等［21］研究發現，在脫氮過程中分別用3種N-酰基高絲氨酸內酯處理后，在低濃度（10、30 nmol/L）下均能加速對氨氮的去除并促進細胞生長，促進作用由大到小依次為：N-辛酰基-L-高絲氨酸內酯（C8-HSL）gt;N-己酰高絲氨酸內酯 （C6-HSL）gt;N-3-氧代-己酰高絲氨酸內酯（3-oxo-C10-HSL）。然而，當信號分子濃度達到50 nmol/L時，對氨氮的去除作用受到抑制。與此同時，C6-HSL和C8HSL處理也促進了JQ1004菌株EPS的釋放，而外源3-oxo-C10-HSL抑制了EPS的釋放。這說明信號分子的外用也會影響生物膜的形成和自聚集。Zhu等［22］研究了喹諾酮假單胞菌信號（PQS）和N-酰基-L-高絲氨酸內酯（AHL）對異養硝化-好氧反硝化的影響，AHL和PQS的缺失可通過控制異養硝化-好氧反硝化過程中亞硝酸鹽氧化還原酶（NXR）、硝酸鹽還原酶（NAR）、亞硝酸鹽還原酶（NIR）和一氧化氮還原酶（NOR）的活性，最大限度地提高氨氮脫除效率。由于QS信號分子對異養硝化-好氧反硝化細菌的氮循環途徑有抑制作用，因此，在含氮廢水處理中，可以利用信號分子猝滅劑、信號分子降解菌或酶來改善細菌的異養硝化-好氧反硝化過程。異養硝化-好氧反硝化細菌的分類和功能還在不斷完善和更新，對其潛在功能還需要進行更深入的研究。

2" 異養硝化-好氧反硝化細菌的作用機制

異養硝化-好氧反硝化細菌種屬廣泛，其產酶體系有一定差別，代謝途徑也有所不同，脫氮機制復雜，因此關于異養硝化-好氧反硝化細菌的作用機制尚不明確。通常采用檢測脫氮過程中的中間產物和酶活性的測定來推測其代謝過程［23］。目前研究發現，異養硝化-好氧反硝化細菌主要有兩種反應途徑，一種是銨（NH4+）在氨單加氧酶（AMO）的催化下氧化為羥胺（NH2OH），再經羥胺氧化還原酶（HAO）作用氧化為亞硝酸鹽（NO2-），再經亞硝酸鹽氧化還原酶（NXR）的催化轉化為硝酸鹽（NO3-）。硝酸鹽還原酶分為膜結合硝酸鹽還原酶（NAR）或質周硝酸鹽還原酶（NAP），在好氧條件下催化NO3-還原為NO2-。亞硝酸鹽還原酶（NIR）將NO2-還原為一氧化氮（NO），再經一氧化氮還原酶（NOR）催化成一氧化二氮（N2O），最后經氧化亞氮還原酶（NOS）催化為氮氣（N2）。另一種是NH4+在AMO的催化作用下氧化為NH2OH，在HAO的作用下氧化為NO，再經NOR催化成N2O，最后經NOS催化為N2。兩種脫氮途徑如下：（1）NH4+→NH2OH→NO2-→NO3-→NO2-→NO→N2O→N2；（2）NH4+→NH2OH→NO→N2O→N2（見圖1）。

羥胺氧化可以在很大程度上簡化反硝化途徑，對氮的循環利用和處理具有重要意義。然而，硝化過程中產生的亞硝酸鹽氮（NO2--N）和硝酸鹽氮（NO3--N）仍需要其他方法來去除，以提高總

氮的去除率。除了以上這兩種途徑外，其他氮代謝途徑還有厭氧氨氧化反應［24］。厭氧氨氧化是1種化能自養途徑，其中NO2-首先還原為NO，然后與NH4+結合形成肼，最后轉化為N2。有研究表明，菌株在催化羥胺生成亞硝酸鹽時會產生丙酮肟雙加氧酶（POD）［25］。羥胺通過與丙酮酸的非酶反應轉化為丙酮肟，然后通過POD氧化為亞硝酸鹽和丙酮酸。異養硝化-好氧反硝化細菌在硝化過程中的關鍵酶和代謝途徑不盡相同，目前對其的研究尚嫌不足，亟需進一步深入的研究。

細菌的脫氮途徑依賴于酶。其中AMO、HAO、NXR、NAR、NAP、NOR和NOS分別由amoA、hao、nxrA、nar、napA、norB和nosZ基因編碼［26］。在好氧條件下，napA往往比nar發揮更大的作用［27］。NIR酶分為兩種：細胞色素cd1亞硝酸還原酶（cd1-NIR，由nirS編碼）或含銅亞硝酸還原酶（Cu-NIR，由nirK編碼）。之前的研究認為，這兩種酶不能在同一種細菌中共存，但Jang等［28］從Bradyrhizobium nitroreducens sp. nov菌株中同時擴增出了這兩種基因，魏渤惠等［29］也有一致的結果，說明nirS和nirK是可以在同一菌株中存在的，只是這兩種基因如何發揮作用尚不清楚。目前，使用已報道的通用引物還難以從異養硝化-好氧反硝化細菌中擴增出上述的許多基因。Cui等［30］已經檢測到AMO和HAO的特異性酶活性，但是仍沒有檢測到amoA和hao基因。napA基因是廣泛存在于異養硝化-好氧反硝化細菌中的典型基因，因此被認為是鑒定異養硝化-好氧反硝化細菌的關鍵基因。然而，在菌株AHP 123中未發現napA基因［31］。以上這些發現表明，僅僅通過基因來預測細菌的異養硝化和好氧反硝化能力是不夠的。聚合酶鏈式反應（PCR）擴增未獲得的基因并不代表其不具有異養硝化和好氧反硝化能力，可能還存在一些新類型的基因或替代的氮代謝途徑。除了擴增相關基因外，同時檢測異養硝化-好氧反硝化細菌的酶活性、積累的中間產物和產生的終產物是全面分析異養硝化-好氧反硝化細菌脫氮機理的更好方法。

3" 異養硝化-好氧反硝化菌的脫氮影響因素

不同條件下，不同菌株的脫氮速率不同。為了使菌株在水體中發揮更好的作用，需要根據不同菌株來探索最佳的條件。

碳源為細菌提供能量和電子供體，能直接影響反硝化的速率和效果，目前常用的碳源包括琥珀酸鈉、檸檬酸鈉、葡萄糖、蔗糖、乙酸鈉等［32-35］。Ke等［36］研究了碳源對不動桿菌ZJB20129脫氮效果的影響，發現在以乙酸鈉和琥珀酸鈉為碳源時，菌株生物量明顯增加，脫氮量也明顯上升。這說明每種異養硝化-好氧反硝化細菌可能有多種不同碳源的代謝途徑，在轉化效率和能量產量方面也存在差異。碳氮比（C/N）是細菌脫氮過程中電子供體和電子受體比例的關鍵指標。Ma等［37］從水庫中分離出兩株好氧反硝化放線菌LJH-12-1和LJH-12-2，LJH-12-1在C/N為13時，具有最好的脫氮效果，LJH-12-2在C/N為10時，對氨氮的去除率達到93%。但在實際應用中工業廢水、生活污水和養殖廢水并沒有那么高的C/N，因此在較低的C/N下還能表現出高效的脫氮性能十分重要。Hu等［38］分離出1種假單胞菌Y7，能有效去除低碳氮比煉油廢水中的氮，在C/N為6的單一或混合氮源培養基中對NH4+-N、NO3--N和NO2--N的去除率高達90%左右。常規情況下，較高的C/N會引起其他異養細菌和自養硝化菌對氧氣和生態位的競爭，從而導致群落的適合度和優勢度下降。

pH是影響異養硝化-好氧反硝化菌生長和硝化效率的關鍵因素之一。水體中的氨氮容易受到pH的影響，pH越高，水中非離子氨的占比就越高，而非離子氨對于魚類等水生動物具有較強的毒性，因此在水產養殖中，水體pH越高，氨氮的毒性越強。pH也會影響脫氮過程中酶的活性［39-40］。Deng等［41］從水產養殖系統中分離出1株假單胞菌DM02，當pH為7時，DM02對總氮、硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮的去除率達到最高。

轉速可以影響水體的溶解氧濃度，而溶解氧也是異養硝化-好氧反硝化的關鍵因素之一。Ouyang等［42］從污染河流的沉積物中分離出1株不動桿菌MZ-5，當震蕩速度為150～250 r/min，水體溶解氧濃度在7.35～7.66 mg/L時，MZ-5對氨氮的去除率達到90%以上。

溫度影響細菌的生長，而且低溫會影響脫氮過程中酶的活性，高溫會使酶變性從而喪失酶活性。適宜的溫度可以提高酶的活性，促進酶促反應。大多數異養硝化-好氧反硝化細菌的最適溫度在25～37 ℃，Zhang等［43］研究發現，反硝化副球菌（Paracoccus denitrificans）Z195的最佳脫氮條件為：C/N為7.47，搖動速度為108 r/min，溫度為31 ℃，初始pH為8.02。不過已有研究篩選出耐低溫和耐高溫的異養硝化-好氧反硝化細菌，為不同環境下的脫氮提供了技術支持。Huang等［44］分離到1株不動桿菌sp. Y16，在2 ℃條件下表現出良好的脫銨能力，并同時產生最終產物氮氣。Chen等［45］篩選出1株嗜熱異養硝化-好氧反硝化細菌，在最適溫度55 ℃的條件下，NH4+-N和NO3--N的平均去除率分別為71.0%和74.7%。目前廢水中普遍存在碳源不足、低碳氮比等特點，為了保證反硝化的順利進行，需要額外添加碳源，以提高反硝化速率。

4" 異養硝化-好氧反硝化菌在水產養殖中的應用

益生菌在水產養殖中的應用非常廣泛。有大量報道稱，益生菌可以改善養殖水質，降低水體中氨

氮和亞硝酸鹽的含量，促進水中優勢菌群的形成，抑制病原微生物的生長［46-51］。Zokaeifar等［52］研究發現，在養殖水體中投放枯草芽孢桿菌可顯著降低氨氮、亞硝酸鹽和硝酸鹽含量，提高凡納濱對蝦的生長性能和存活率。這說明益生菌是一種很好的水體改良劑，并且對水生動物產生有益的影響。異養硝化-好氧反硝化細菌也能降低水體中的氨氮，已有研究人員將其應用到養殖水體處理。如羅國芝等［53］從活性污泥中分離出1株異養硝化-好氧反硝化細菌，將其應用到循環水養殖系統中，能夠有效去除氨氮和硝酸態氮。這說明異養硝化細菌可以用于凈化養殖水體。康傳磊等［54］研究發現，將3株異養硝化-好氧反硝化細菌，花津灘芽孢桿菌（Bacillus hwajinpoensis）SLWX2、嗜堿鹽單胞菌（Halomonas alkaliphila）X3

和麥氏交替單胞菌（Alteromonas macleodii）SLNX2組合起來對圓斑星鰈（Verasper variegates）養殖廢水的處理效果最佳，能夠顯著降低水體中的氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮、總氮的含量，起到凈化水質、維護魚體健康的作用。這說明不要局限于單株菌，可以將幾種菌聯用，發揮最大的優勢。王淼等［55］分別將3種異養硝化細菌應用到尼羅羅非魚養殖水體中，結果顯示，3種菌對水體中氨氮的去除率均達到了94%以上，而且能夠顯著提高尼羅羅非魚血清中T-AOC和SOD的活性。這說明異養硝化-好氧反硝化細菌不僅僅可以用來改善水質，還可以提升魚類的抗氧化能力。陳猛等［56］從豬糞水自然曝氣池污水中分離出1株異養硝化-好氧反硝化菌株ZF2-3，將其應用到氨氮濃度相對較低的水產養殖廢水中，結果總氮和氨氮的濃度分別下降了37.7%和67.4%，又將其應用到氨氮濃度相對較高的豬糞廢水中，總氮和氨氮濃度分別降低了34.6%和30.4%，均具有良好的處理效果。錢春園等［57］從土壤中分離出1株高效的異養硝化菌HY13，將其應用于甲魚養殖廢水中，經216 h的培養，氨氮去除率達64.3%，但在培養基中，96 h氨氮濃度即降到最低。這說明當菌株應用于廢水處理時，不同的氨氮濃度、菌株接種量等均會影響氨氮的去除率。在水產養殖場，養殖池塘通常需要增氧以保證水生動物的生長。然而，反硝化通常在缺氧條件下進行，而氨氮轉化為硝酸鹽的過程需要氧氣，氧氣的存在又會抑制厭氧反硝化菌的活性。因此，尋找有氧條件下能夠進行反硝化反應的菌株，在含氮廢水處理中的應用是非常必要的。異養硝化-好氧反硝化細菌投放到養殖水體中能夠有效改善水質條件，降低氨氮、亞硝酸鹽以及總氮的含量，但其作用機理以及降解氨氮的途徑目前尚不清楚。一些異養硝化-好氧反硝化細菌在水產養殖中應用的研究結果匯總見表2。

5" 總結

目前對于異養硝化-好氧反硝化細菌的研究還處在實驗室范圍內，在實際中的應用鮮有報道。異養硝化-好氧反硝化細菌來源廣泛，不同種屬的細菌代謝途徑不同，產酶體系不同，脫氮途徑也不盡相同。除了脫氮以外，還具有除磷、鈣、重金屬等功能。碳源、碳氮比、pH、溶解氧、溫度等因素都會對異養硝化-好氧反硝化細菌的除氮效率產生影響。由于水體環境容易受多方面因素的影響，因此要根據不同的菌株來探索適合其生長的條件，發揮其最大脫氮性能。有些異養硝化-好氧反硝化細菌還能在極端環境下發揮硝化和反硝化作用。菌種接種濃度的選擇也是非常重要的，并不是濃度越高越好，適宜的濃度才能夠顯著改善水質環境，提高養殖動物的生產性能。異養硝化-好氧反硝化細菌的EPS和QS可能在異養硝化-好氧反硝化細菌生長過程中微生物的聚集和信息交換中起重要作用。目前研究發現，主要有兩條脫氮途徑：（1） NH4+→NH2OH→NO2-→NO3-→NO2-→NO→N2O→N2；（2） NH4+→NH2OH→NO→N2O→N2。現有的研究大多集中在菌株的分離上，用于養殖廢水脫氮處理的研究很少，而且參與異養硝化和好氧反硝化降解途徑的功能基因和酶仍需要進一步探索發現。

異養硝化-好氧反硝化菌株分布廣泛，未來發展潛力巨大。可以嘗試將多種菌株聯合起來，做成復合菌劑進行使用，或者將其與藻類聯用。此外異養硝化-好氧反硝化細菌的檢測和鑒定方法還有待進一步完善和規范，這對于異養硝化-好氧反硝化細菌的開發和研究具有重要意義。未來可以利用宏基因組測序技術對養殖環境中的菌群進行全面分析，利用基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學等組學方法深入研究異養硝化-好氧反硝化細菌的脫氮途徑機制，利用基因工程等手段進一步研究異養硝化-好氧反硝化細菌的酶和功能基因。

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Research progress of heterotrophic nitrifying-aerobic denitrifying bacteria and its application in aquaculture

YAO Baolan， LIU Jia， YAN Zihao， LU Yuqian， KOU Yihan， LI Yuehong

（College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun" 130118，China）

Abstract： Heterotrophic nitrifying-aerobic denitrifying bacteria can simultaneously achieve nitrification and denitrification，with efficient denitrification performance.Heterotrophic nitrifying-aerobic denitrifying bacteria are currently one of the research hotspots in wastewater denitrification treatment for the removal of nitrogen-containing organic compounds in nitrogen-containing wastewater.The article reviews the research status，mechanism of action，nitrogen removal influencing factors，and application in aquaculture of heterotrophic nitrifying-aerobic denitrifying bacteria，in order to provide theoretical basis for the research of heterotrophic nitrifying-aerobic denitrifying bacteria and provide new ideas for the application of heterotrophic nitrifying-aerobic denitrifying bacteria in aquaculture.

Key words： heterotrophic nitrifying-aerobic denitrifying bacteria; denitrification; mechanism of action; aquaculture; wastewater treatment