三種藥用水蛭的染色體制備及核型分析

摘" 要：為探究寬體金線蛭、天津醫蛭和菲牛蛭等3種藥用水蛭的染色體制備及核型分析方法，豐富對水蛭染色體數目及核型組成的認知，以精巢細胞為材料，采用空氣干燥法制作前述3種水蛭的染色體玻片，并進行鏡檢和核型分析。試驗結果顯示，3種水蛭的染色體數目和核型公式分別為寬體金線蛭：2n=22=8m+4sm+4st+6t，天津醫蛭：2n=22=12m+4sm+2st+4t，菲牛蛭：2n=26=4m+4sm+6st+12t；核型不對稱系數分別為寬體金線蛭71.27%，天津醫蛭65.70%，菲牛蛭78.99%；核型分類標準分別為寬體金線蛭“3A”型，天津醫蛭“2A”型，菲牛蛭“3A”型。結果說明，核型分析結果與這3種水蛭所在的系統分類地位相符，3種水蛭的進化程度有一定差別。

關鍵詞：寬體金線蛭；天津醫蛭；菲牛蛭；染色體；核型

doi：10.16446/j.fsti.20231000103

收稿日期：2023-10-03

作者簡介：施鳳（2001—），女，碩士研究生，研究方向為藥用蛭類資源開發與利用。E-mail：1607152305@qq.com

通信作者：劉子超（1997—），男，副教授，研究方向為藥用蛭類資源開發與利用。E-mail：abclzc@aliyun.com

項目資助：國家自然科學基金項目（32260132）；云南省萬人計劃青年拔尖人才專項（YNWR-QNBJ-2018-161）；云南省地方本科高校基" 礎研究聯合專項（202301BA070001-105，202101BA070001-164）；昆明學院2023年科研特色團隊。

水蛭俗稱螞蝗，隸屬于環節動物門（Annelida）、蛭綱（Hirudinea）［1］。全世界記述了4亞綱5目13科144屬約700種水蛭［2］，中國分布有2亞綱3目9科33屬111種［3］。水蛭在我國有悠久的臨床藥用歷史。漢代的《神農本草經》即記載了水蛭的藥效，“水蛭，味咸，平。主逐惡血，瘀血，月閉，破血瘕，積聚，無子，利水道”?！秱摗贰侗静菥V目》等古代醫學名著也對水蛭的藥效有詳細記載?！吨袊幍洹?020年版將寬體金線蛭（Whitmania pigra）、日本醫蛭（Hirudo nipponica）和尖細金線蛭（Whitmania acranulata）收載，用于治療血瘀經閉、癓瘕痞塊、中風偏癱、跌撲損傷等［4］。其中，寬體金線蛭和日本醫蛭的市場占有率較大，尖細金線蛭則極為少見。本文作者結合形態學、解剖學和分子分類學研究，證實目前中藥材市場上的日本醫蛭其實是以天津醫蛭（Hirudo tianjinensis）為主，真正的日本醫蛭十分少見［5］。此外，分布于我國廣東、廣西、海南等地的菲牛蛭（Poecilobdella manillensis）因具有個體大、抗凝血酶活性高、易于養殖等優勢，近年來在中藥材市場上也逐漸占據了較大的比例［6］。因此，目前我國藥材市場上常見的水蛭主要為寬體金線蛭、天津醫蛭和菲牛蛭3種。

核型是染色體組在有絲分裂中期的表型，包括染色體數目、倍性、大小、形態特征等內容。核型分析是分類學、群體遺傳學、物種進化等研究的重要工具。目前，雖然對水蛭的核型研究既包括了淡水蛭類和海洋蛭類，也包括吸血蛭類和肉食性蛭類［7］，但是研究的種類很少，在已經報道的600多種水蛭中，僅有約30種水蛭的染色體數目被報道，且尚未見對水蛭染色體形態的研究報道［8-10］。本試驗以精巢細胞為材料，對寬體金線蛭、天津醫蛭和菲牛蛭等3種藥用水蛭的核型進行分析，旨在豐富對水蛭染色體數目及核型組成的認知，為我國藥用蛭類資源的開發利用提供資料。

1" 材料和方法

1.1" 試驗材料

試驗用寬體金線蛭購買自山東省濟寧市；天津醫蛭采集自云南省昆明市滇池流域；菲牛蛭購買自廣東省中山市。3種水蛭均在昆明學院農學與生命科學學院水蛭養殖室正常暫養10 d以上，以確保其處于正常的生理狀態（見圖1）。

1.2" 染色體制備

取健康水蛭于50 mL錐形離心管中，用15%乙醇麻醉后取出并置于蠟盤中，在體視顯微鏡下進行解剖。用手術刀從后往前將水蛭背部的皮膚劃開，并用昆蟲針固定，用尖頭鑷子將精巢組織取出，立即放入1 mg/mL秋水仙素中處理18 h。取出并適當研磨破碎精巢組織，然后在0.4% KCl低滲液中處理30 min，以1 000 r/min離心10 min。將沉淀物放入卡諾氏固定液中固定20 min。再次離心，將沉淀用少量卡諾氏固定液制成細胞懸液。采用空氣干燥法制作玻片，用10% Gimsa染液染色30 min，用蔡司熒光顯微鏡Axioplan 2（Zeiss company， USA）進行染色體拍照，用圖像分析軟件CytoVision system（Applied Imaging Corp， UK）進行染色體分析。

1.3" 染色體計數與核型分析

挑選染色體分散均勻、形態完整的二倍體分裂相細胞，選擇形態大小接近的染色體進行配對、編號、計數，并用Photoshop軟件制作核型圖。每個物種選取30個以上細胞進行統計，其中85%以上細胞具有的染色體數確定為該物種的染色體數［11］。根據CytoVision system測量的數據計算染色體的相對長度和臂比，公式為：相對長度＝（每條染色體長度/染色體組總長度）×100%，臂比＝長臂長度/短臂長度；根據Levan等的方法對染色體進行分類和核型公式計算，并用EXCEL軟件制作核型模式圖［12］。以Stebbins［13］提出的最長染色體與最短染色體之比和臂比值＞2的染色體所占比例為核型分類原則；以Arano［14］提出的核型不對稱系數，對所得數據進行核型分析，公式為：核型不對稱系數＝（長臂總長/全組染色體總長）×100%。用SPSS軟件進行統計學分析，結果數據以平均值±標準差表示。

2" 結果和分析

2.1" 水蛭染色體數

3種水蛭選取的二倍體分裂相細胞數分別為：寬體金線蛭65個，天津醫蛭49個，菲牛蛭43個。統計結果表明：寬體金線蛭2n=22占比為93.85%；天津醫蛭2n=22占比為90.00%；菲牛蛭2n=26占比為93.02%。上述結果均大于85%，因此確定，3種藥用水蛭的染色體數目分別為：寬體金線蛭2n=22，天津醫蛭2n=22，菲牛蛭2n=26（見圖2）。

2.2" 寬體金線蛭核型分析

根據65個細胞的測量結果數據，寬體金線蛭的染色體數目為11對22條（見圖3），由第3、5、6、11對中部著絲點染色體（m），第7、10對近中部著絲點染色體（sm），第1、2對近端部著絲點染色體（st），以及第4、8、9對端部著絲點染色體（t）組成。染色體組的相對長度在3.52%～5.67%，染色體臂比值在1.04～15.13，平均臂比值為4.76（見表1）。

2.3" 天津醫蛭核型分析

根據49個細胞的測量數據，天津醫蛭的染色體數目為11對22條（見圖4），由第3、4、6、79對中部著絲點染色體（m），第10、11對近中部著絲點染色體（sm），第1對近端部著絲點染色體（st），以及第2、5對端部著絲點染色體（t）組成。染色體組的相對長度為3.66%～5.53%，染色體臂比值在1.03～12.4，平均臂比值為3.38（見表2）。

2.4" 菲牛蛭核型分析

根據43個細胞的測量數據，菲牛蛭的染色體數目為13對26條（見圖5），由第12、13對中部著絲點染色體（m），第7、9對近中部著絲點染色體（sm），第2、4、11對近端部著絲點染色體（st），以及第1、3、5、6、8、10對端部著絲點染色體（t）組成。染色體組的相對長度為3.19%～4.55%，染色體臂比值在1.05～12.82，平均臂比值為6.43（見表3）。

2.5" 三種水蛭的染色體核型特征分析

通過對精巢染色體玻片進行鏡檢，結果表明，以上述方法制備的水蛭染色體分散效果良好，并且3種水蛭的染色體均為二倍體，未發現多倍體染色體、性染色體和隨體（見圖3～圖5）。供試的3種水蛭中，寬體金線蛭和天津醫蛭均以m染色體為主，菲牛蛭則是以t染色體為主。寬體金線蛭中m染色體的占比為36.4%，sm染色體的占比為18.2%，st染色體的占比為18.2%，t染色體的占比為27.3%；天津醫蛭中m染色體的占比為

54.5%，sm染色體的占比為18.2%，st染色體的占比為9.1%，t染色體的占比為18.2%；菲牛蛭中m染色體的占比為15.4%，sm染色體的占比為15.4%，st染色體的占比為23.1%，t染色體的占比為46.2%（見表1～表3）。

在一定的分類階元中，物種的進化程度與其t型、m型和sm型染色體的數量密切相關。通常認為，t型染色體數量較多的物種，其進化程度較低，而m型和sm型染色體數量較多則表明了物種較高的進化程度，這一結論已經在魚類研究中被證實［15］。本試驗結果顯示，天津醫蛭的m型和sm型染色體數量較多，其次是寬體金線蛭，而菲牛蛭則相對較少。這一趨勢與《中國動物志（蛭綱）》中“醫蛭科較進化，黃蛭科較原始”的觀點相符合。

2.6" 三種水蛭的核型進化趨勢分析

由表4可知，寬體金線蛭臂比大于2的染色體比例為54.55%，染色體核型公式為2n=22=8m+4sm+4st+6t，屬于3A核型。天津醫蛭臂比大于2的染色體比例為36.36%，染色體核型公式為2n=22=12m+4sm+2st+4t，屬于2A核型。菲牛蛭臂比大于2的染色體比例為76.92%，染色體核型公式為2n=26=4m+4sm+6st+12t，屬于3A核型。

Stebbins［13］曾指出，物種的進化是從對稱向不對稱進化的，即1個物種染色體越對稱，則其進化程度越原始；反之，染色體對稱性越低則其進化程度越高。本試驗中3種水蛭的核型不對稱系數為65.70%～78.99%（見表4），排列順序為：菲牛蛭gt;寬體金線蛭gt;天津醫蛭。根據核型不對稱系數來看3種水蛭的進化程度：菲牛蛭進化程度較高，寬體金線蛭次之，天津醫蛭最低。這一結果也與醫蛭科和黃蛭科的進化方向相符。

3" 討論

水蛭是我國重要的動物類中藥材。水蛭中藥飲片和以水蛭為主要原材料的復方藥被應用于臨床，治療腦梗、心梗、靜脈血栓、高血壓等多種凝血相關疾病。隨著我國人口老齡化和人均壽命的延長，水蛭的市場份額呈現逐年增長的趨勢。然而，水蛭遺傳學信息的缺乏成為創新藥物研發的瓶頸，在很大程度上限制了其市場推廣應用。核型分析是細胞遺傳學研究的重要方法，染色體數目、形態及分類是細胞遺傳學研究的核心內容，而核型分析和帶型研究是最為重要的切入點［16］。

水蛭的體型會隨著環境和饑餓程度的變化而發生較大改變，其受到刺激時也會分泌出大量黏液，使體表呈現出極其黏滑的狀態。由于這些特征的存在，對水蛭特定組織進行取樣變得異常困難，同時在制作玻片時也難以形成均勻的單層細胞，因此，對水蛭染色體進行深入研究的相關報道十分少見。目前全世界已知水蛭約700種，僅有10多種被報道了染色體數目，對染色體進行配對和分型研究的報道則更少，國內僅見楊潼等［17］對日本醫蛭的染色體進行過研究，其研究結果表明，日本醫蛭的染色體2n=16，并且還記錄到日本醫蛭的桿狀、點狀、環狀染色體，但是部分染色體的形態與其他常見物種染色體的形態差異較大，其原因尚不清楚。從已知結果看，不同物種水蛭的染色體數目變化較大，分類地位較近的物種，其染色體數目也存在較大差異，如澤蛭的染色體數目最少為2n=12，最多為2n=32。這在一定程度上與當前水蛭分類學的發展水平有關，同時也反映出該領域在我國還有待進一步深入研究。由于水蛭分布范圍較廣、數量眾多且種類繁多，而在細胞遺傳學研究中，核型分析是一項至關重要的方法，因此，對水蛭進行核型分析十分有必要。

盡管中國水蛭已有悠久的臨床藥用歷史，但分類學研究起步較晚，相關資料稀缺，對于藥用水蛭的物種鑒定也缺乏明確的認識。蛭類經典分類學專著《螞蟥》［18］和《中國動物志（蛭綱）》［1］對于日本醫蛭的描繪和插圖有明顯的差異。近年來，隨著生物技術在醫學領域中的應用，國內外學者開始關注水蛭的核型問題并開展深入研究。Wang等［5］結合形態學、解剖學和分子分類學方法得出結論，大多數中藥材市場上的“日本醫蛭”實際上是天津醫蛭。從染色體核型的角度來看，本研究進一步證實了天津醫蛭與日本醫蛭在物種鑒定方面存在顯著差異，這為我國藥用水蛭的鑒定提供了重要的理論依據。Utevsky等［19］對3種醫蛭屬染色體的研究結果為：H. medicinalis n=14，H. verbena n=13，H. orientalis n=12。天津醫蛭的單倍體染色體數n=11，與其較為接近，也說明其系統發育存在一定的同源性。

本研究以水蛭的精巢組織為材料，成功制備了藥用水蛭寬體金線蛭、天津醫蛭和菲牛蛭的二倍體染色體，這為水蛭的染色體和細胞遺傳學研究提供了新的思路。此外，本研究還對3種水蛭的二倍體染色體進行了核型分析，進一步豐富了目前對水蛭染色體數目及核型組成的認知，有助于水蛭系統發育和遺傳學研究。本研究對于水蛭的物種鑒定、親緣關系、基因組學等相關研究具有重要的科學和應用價值。

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Chromosome preparation and karyotype analysis

of three medicinal leeches

SHI Feng1，2， SHEN Luyao1， LIU Zichao1， HU Qingmei1， TONG Xiangrong1， BI Xiaoxu1， LI Junyu3

（1. Engineering Research Center for Exploitation and Utilization of Leech Resources in

Universities of Yunnan Province，College of Agriculture and Life Sciences，

Kunming University，Kunming" 650214，China; 2. School of

Medicine， Kunming University，Kunming" 650214，China;

3. Department of Ultrasound，People’s Hospital of Fengdu

County，Chongqing City，Fengdu" 408200，China）

Abstract： To investigate the methods of chromosome preparation and karyotype analysis of three medicinal leech species，Whitmania pigra，Hirudo tianjinensis，and Poecilobdella manillensis，and to further enrich the knowledge of the number of chromosomes and karyotype composition of leeches.The spermatocytes were used as material to make chromosome slides of the three leech species by air-drying method，and microscopic examination and karyotype analysis were carried out.The results showed that the chromosome number and karyotype formulas of the three leech species were as follows：W. pigra：2n=22=8m+4sm+4st+6t，H. tianjinensis：2n=22=12m+4sm+2st+4t，P. manillensis：2n=26=4m+4sm+6st+12t.Karyotype asymmetry coefficients were 71.27%，65.70% and 78.99%，respectively.The karyotype classification criteria were the “3A” type of W. pigra，“2A”type of H. tianjinensis and “3A” type of the P. manillensis.The results indicated that the karyotype analysis was consistent with the phylogenetic status of the three leech species，which was different in their degree of evolution to some extent.

Key words： Whitmania pigra; Hirudo tianjinensis; Poecilobdella manillensis; chromosome; karyotype